CN106906149A - 一株绿色木霉及其应用 - Google Patents

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于泽洋
范海娟
王玉成
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Abstract

一株绿色木霉及其应用，本发明涉及一株绿色木霉及其应用。本发明的一株绿色木霉为绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2015年07月15日，保藏编号为CGMCC No.11117。本发明的一株绿色木霉的应用是指绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥上的应用。

Description

一株绿色木霉及其应用
技术领域
本发明涉及一株绿色木霉及其应用。
背景技术
木霉属(Trichoderma)真菌作为一种植物真菌病害生防真菌，由于其分布广泛、适应性强、成熟期短、生长快、能改良土壤及具有广谱的抗菌抑菌特性等特点已经在农林业领域广泛应用。木霉属中的绿色木霉(Trichoderma viride)由于其良好的生防效果，在促进植物生长发育、抑制病原菌生长等方面已经被广泛研究和应用，世界上也已经有市场化的木霉菌肥投入使用，但黑龙江省地处寒地地区，其它地区木霉很有可能因为低温条件的限制，在寒地地区不能充分发挥其生防作用，所以需要分离鉴定适应低温条件的木霉菌株。
玉米(Zea mays)作为主要的粮食作物，在全国乃至全世界大规模种植，在我国，玉米种植面积近3800万公顷，秸秆年产量近2.8亿吨。收获后的玉米秸秆，还田是其最好的利用方式，不仅能够增加土壤养分，还能够改善土壤结构，达到减少使用化肥的目标。目前主要是直接将玉米秸秆粉碎至5cm以下小段还田，辅助手段则用于堆沤间接还田。但直接粉碎还田未经过高温发酵，容易将大量病原菌带入土壤；而间接堆沤还田虽然经过高温发酵，保证土壤不被带入病原微生物，也能起到改良土壤的作用，但除了上述作用外，没有附加产品产出，附加价值较低。
发明内容
本发明的目的是提供一株绿色木霉及其应用。
本发明的一株绿色木霉为绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2015年07月15日，保藏编号为CGMCC No.11117。
本发明的一株绿色木霉的应用是指绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥上的应用。
本发明在2013年秋季黑龙江省哈尔滨百盛家园旁野地的小蓟(Cirsium setosum)根际土壤中分离得到绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006；该菌生长较快，28℃条件下培养48h菌落半径为27mm，菌丝层较厚，后期产生分生孢子，深绿色，菌落呈同心轮纹。显微镜观察有弯曲或钩状瓶梗。经形态鉴定和分子鉴定相结合鉴定为绿色木霉(Trichodermaviride)，最终命名为绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006。
本发明的优点：
1、本发明获得的绿色木霉分离鉴定于黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨市气候寒冷，条件恶劣，分布在当地的木霉，较其他地区木霉，有更好的适应低温的能力，在低温条件下生防能力更加稳定良好，也更适合于地处寒地的农业地区；
2、玉米秸秆的优良特性适合木霉菌肥的制备：与其它原料相比，玉米秸秆主要成分为纤维素、糖分、无机盐和水，这些成分本身就是木霉生长所需的营养物质；玉米秸秆较其他原料有更强的透气性，吸水性、保水性，更适用于培养木霉。玉米秸秆比重较低，粉碎后相对表面积较大，同等质量可以得到更大的孢子产量，适于生产木霉菌肥；
3、发酵料的主料玉米秸秆成本低廉：主要利用难以完全充分处理的农业废弃物玉米秸秆进行菌肥发酵。玉米作为主要的粮食作物，种植广袤，种植玉米的地区均可取材，所以玉米秸秆极为丰富。在收获玉米的同时就可以收获秸秆，回收的成本很低廉，粉碎后的秸秆约100-200元/吨。本配方看重玉米秸秆蓬松质稀的特点，因此运输过程中，压缩后同等质量可以运送更大体积的玉米秸秆，成本更加低廉；
4、获得高附加价值的产品-木霉菌肥：与其它应用玉米秸秆的方式相比，制备木霉菌肥具有更高的附加价值，在一个长*宽*高为2m*5m*3m空间内，可堆放约2*10*35＝700个托盘，用料61.6kg(46.9kg秸秆，14.7kg麦麸)，一周期12d可生产约9kg木霉干孢子粉(65亿个孢子/g)，制备成合适的剂型,最终可获得毛利润近14500元；
5、分离木霉后的发酵料还田更加合理：在施肥时可以直接将已经分离了孢子的玉米秸秆直接还田，一方面秸秆中原有的病原菌被木霉抑制杀死，不会向土壤中带入病原微生物；另一方面还能为土壤带来大量有益微生物；木霉对秸秆的分解作用使得发酵料营养更丰富，更好地促进秸秆还田。
附图说明
图1为试验1和对照试验1～4绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥的发酵状态；
图2为试验1和对照试验1～4中5种不同发酵配方的孢子产量。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一株绿色木霉为绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2015年07月15日，保藏编号为CGMCC No.11117。
本实施方式在2013年秋季黑龙江省哈尔滨百盛家园旁野地的小蓟(Cirsiumsetosum)根际土壤中分离得到绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006；该菌生长较快，28℃条件下48h菌落半径为27mm，菌丝层较厚，后期产生分生孢子，深绿色，菌落呈同心轮纹。显微镜观察有弯曲或钩状瓶梗。经形态鉴定和分子鉴定相结合鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)，最终命名为绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006。
本实施方式的绿色木霉分离鉴定于黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨市气候寒冷，条件恶劣，分布在当地的木霉，较其他地区木霉，有更好的适应低温的能力，在低温条件下生防能力更加稳定良好，也更适合于地处寒地的农业地区。
具体实施方式二：本实施方式一株绿色木霉的应用是指绿色木霉(Trichodermaviride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥上的应用。
本实施方式的有益效果：
1、玉米秸秆的优良特性适合木霉菌肥的制备：与其它原料相比，玉米秸秆主要成分为纤维素、糖分、无机盐和水，这些成分本身就是木霉生长所需的营养物质；玉米秸秆较其他原料有更强的透气性，吸水性、保水性，更适用于培养木霉。玉米秸秆比重较低，粉碎后相对表面积较大，同等质量可以得到更大的孢子产量，适于生产木霉菌肥；
2、发酵料的主料玉米秸秆成本低廉：主要利用难以完全充分处理的农业废弃物玉米秸秆进行菌肥发酵。玉米作为主要的粮食作物，种植广袤，种植玉米的地区均可取材，所以玉米秸秆极为丰富。在收获玉米的同时就可以收获秸秆，回收的成本很低廉，粉碎后的秸秆约100-200元/吨。本配方看重玉米秸秆蓬松质稀的特点，因此运输过程中，压缩后同等质量可以运送更大体积的玉米秸秆，成本更加低廉；
3、获得高附加价值的产品-木霉菌肥：与其它应用玉米秸秆的方式相比，制备木霉菌肥具有更高的附加价值，在一个长*宽*高为2m*5m*3m空间内，可堆放约2*10*35＝700个托盘，用料61.6kg(46.9kg秸秆，14.7kg麦麸)，一周期12d可生产约9kg木霉干孢子粉(65亿个孢子/g)，制备成合适的剂型,最终可获得毛利润近14500元；
4、分离木霉后的发酵料还田更加合理：在施肥时可以直接将已经分离了孢子的玉米秸秆直接还田，一方面秸秆中原有的病原菌被木霉抑制杀死，不会向土壤中带入病原微生物；另一方面还能为土壤带来大量有益微生物；木霉对秸秆的分解作用使得发酵料营养更丰富，更好地促进秸秆还田。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：发酵料的配方为：按质量份数将76份粉碎后的玉米秸秆和24份麦麸混合，得到混合物A，然后加入硫酸亚铁和水，其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亚铁和3L的水。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的粉碎后的玉米秸秆是指粉碎至每段＜5cm。其他与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：每88g发酵料中接种30mL绿色木霉分生孢子悬浮液；其中绿色木霉分生孢子悬浮液的浓度为3×106个孢子/mL。其他与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分离鉴定方法为：
(1)木霉菌的分离：称取土样10g于100mL无菌水中溶解，摇匀，作为原液，把原液再依次稀释成10-1，10-2，10-3，10-4倍。用移液器分别吸取不同稀释倍数的土壤悬浮液0.15mL，用无菌涂布器分别均匀涂布于PDA培养基平板上，28℃培养箱中倒置培养，1-2d后挑木霉单菌落转接于PDA培养基上，5d后对其进行进一步纯化培养；
(2)分离基质：分离于黑龙江省哈尔滨百盛家园旁野地的小蓟(Cirsium setosum)根际土壤；
(3)分离时间：2013年秋季；
(4)鉴定：
a、形态鉴定：生长较快，28℃条件下48h菌落半径为27mm，菌丝层较厚，后期产生分生孢子，深绿色，菌落呈同心轮纹。显微镜观察有弯曲或钩状瓶梗。
b、ITS分子鉴定：将纯化后的木霉菌接种到PD液体培养基中，28℃，180rpm，摇瓶培养48h，无菌纱布过滤收集菌丝体。提取木霉菌丝体DNA。通过PCR、胶回收纯化及测序后获得ITS序列。测序结果通过木霉分类网站Trichoderma taxonomy(http://www.isth.info/)进行TrichoBLAST和TrichOKEY在线比对，经形态鉴定和分子鉴定相结合最终鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)。
对本实施方式的绿色木霉进行功能性验证：
试验1、绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥的方法为：
一、菌种的准备：将绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接种到PDA斜面培养基上，培养5d，得到培养后的分生孢子；
二、发酵料的准备：按质量份数将76份粉碎后的玉米秸秆和24份麦麸混合，得到混合物A,然后加入硫酸亚铁和水，搅拌均匀分装到灭菌袋后，在121℃条件下灭菌2h，得到灭菌后的发酵料；其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亚铁和3L的水；
三、接种：将培养后的分生孢子刮至灭菌水中，得到浓度为3×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液；将灭菌后的发酵料倒入托盘中平铺，然后接种分生孢子悬浮液，盖上保鲜膜，在28℃、湿度为50％的条件下进行培养；
四、培养：在步骤三的条件下培养4～5d后，在保鲜膜上打孔，然后加入灭菌水，继续培养9d，再将托盘中的发酵料翻转，培养2～3d，然后干燥，即完成。
对照试验1、对照试验1的方法为：
一、菌种的准备：将绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接种到PDA斜面培养基上，培养5d，得到培养后的分生孢子；
二、发酵料的准备：按质量份数将83份粉碎后的玉米秸秆和17份麦麸混合，得到混合物A，然后加入硫酸亚铁和水，搅拌均匀分装到灭菌袋后，在121℃条件下灭菌2h，得到灭菌后的发酵料；其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.4g硫酸亚铁和3L的水；
三、接种：将培养后的分生孢子刮至灭菌水中，得到浓度为3×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液；将灭菌后的发酵料倒入托盘中平铺，然后接种分生孢子悬浮液，盖上保鲜膜，在28℃、湿度为50％的条件下进行培养；
四、培养：在步骤三的条件下培养4～5d后，在保鲜膜上打孔，然后加入灭菌水，继续培养9d，再将托盘中的发酵料翻转，培养2～3d，然后干燥，即完成。
对照试验2、对照试验2的方法为：
一、菌种的准备：将绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接种到PDA斜面培养基上，培养5d，得到培养后的分生孢子；
二、发酵料的准备：按质量份数将59份粉碎后的玉米秸秆和41份麦麸混合，得到混合物A,然后加入硫酸亚铁和水，搅拌均匀分装到灭菌袋后，在121℃条件下灭菌2h，得到灭菌后的发酵料；其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亚铁和3L的水；
三、接种：将培养后的分生孢子刮至灭菌水中，得到浓度为3×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液；将灭菌后的发酵料倒入托盘中平铺，然后接种分生孢子悬浮液，盖上保鲜膜，在28℃、湿度为50％的条件下进行培养；
四、培养：在步骤三的条件下培养4～5d后，在保鲜膜上打孔，然后加入灭菌水，继续培养9d，再将托盘中的发酵料翻转，培养2～3d，然后干燥，即完成。
对照试验3、对照试验3的方法为：
一、菌种的准备：将绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接种到PDA斜面培养基上，培养5d，得到培养后的分生孢子；
二、发酵料的准备：按质量份数将50份粉碎后的玉米秸秆和50份麦麸混合，得到混合物A，然后加入硫酸亚铁和水，搅拌均匀分装到灭菌袋后，在121℃条件下灭菌2h，得到灭菌后的发酵料；其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亚铁和3L的水；
三、接种：将培养后的分生孢子刮至灭菌水中，得到浓度为3×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液；将灭菌后的发酵料倒入托盘中平铺，然后接种分生孢子悬浮液，盖上保鲜膜，在28℃、湿度为50％的条件下进行培养；
四、培养：在步骤三的条件下培养4～5d后，在保鲜膜上打孔，然后加入灭菌水，继续培养9d，再将托盘中的发酵料翻转，培养2～3d，然后干燥，即完成。
对照试验4、对照试验4的方法为：
一、菌种的准备：将绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接种到PDA斜面培养基上，培养5d，得到培养后的分生孢子；
二、发酵料的准备：按质量份数将42份粉碎后的玉米秸秆和58份麦麸混合，得到混合物A,然后加入硫酸亚铁和水，搅拌均匀分装到灭菌袋后，在121℃条件下灭菌2h，得到灭菌后的发酵料；其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亚铁和3L的水；
三、接种：将培养后的分生孢子刮至灭菌水中，得到浓度为3×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液；将灭菌后的发酵料倒入托盘中平铺，然后接种分生孢子悬浮液，盖上保鲜膜，在28℃、湿度为50％的条件下进行培养；
四、培养：在步骤三的条件下培养4～5d后，在保鲜膜上打孔，然后加入灭菌水，继续培养9d，再将托盘中的发酵料翻转，培养2～3d，然后干燥，即完成。
试验1和对照试验1～4中所述的PDA斜面培养基的配方为：200g马铃薯加水1000ml煮沸20min，过滤后弃废渣，向滤液中加入20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，搅拌均匀后分装灭菌；步骤三所述的分生孢子悬浮液的接种量为每88g灭菌后的发酵料中接种30mL；步骤四打孔的数量为12个/0.1m2，孔径为1mm；步骤三灭菌后的发酵料与步骤四的灭菌水的质量体积比为88g:100mL。
试验1和对照试验1～4中所用托盘规格：长*宽*高：40cm*28cm*6cm。
记录试验1和对照试验1～4绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥的发酵状态，结果如图1所示，其中1号为对照试验1、2号为试验1、3号为对照试验2、4号为对照试验3、5号为对照试验4；由图1可知，孢子单位产量2号最高。经过血球计数板对发酵好的木霉菌肥进行测量，测量结果如图2所示，由图2可知，2号配方产孢量最大，约9.5亿个/g发酵料。
与其它应用玉米秸秆的方式相比，试验1制备的木霉菌肥具有更高的附加价值，在一个长*宽*高为2m*5m*3m空间内，可堆放约2*10*35＝700个托盘，用料61.6kg(46.9kg秸秆，14.7kg麦麸)，一周期12d可生产约9kg木霉干孢子粉(65亿个孢子/g)，制备成合适的剂型,最终可获得毛利润近14500元。采用试验1的方法分离木霉后的发酵料还田更加合理，在施肥时可以直接将已经分离了孢子的玉米秸秆直接还田，一方面秸秆中原有的病原菌被木霉抑制杀死，不会向土壤中带入病原微生物；另一方面还能为土壤带来大量有益微生物；木霉对秸秆的分解作用使得发酵料营养更丰富，更好地促进秸秆还田。

Claims (5)

1.一株绿色木霉，其特征在于它为绿色木霉(Trichoderma viride)NECC30006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2015年07月15日，保藏编号为CGMCC No.11117。
2.如权利要求1所述的一株绿色木霉的应用，其特征在于绿色木霉(Trichodermaviride)NECC30006以玉米秸秆、麦麸和硫酸亚铁为发酵料生产木霉菌肥上的应用。
3.根据权利要求2所述的一株绿色木霉的应用，其特征在于发酵料的配方为：按质量份数将76份粉碎后的玉米秸秆和24份麦麸混合，得到混合物A，然后加入硫酸亚铁和水，其中硫酸亚铁和水的添加量为每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亚铁和3L的水。
4.根据权利要求3所述的一株绿色木霉的应用，其特征在于所述的粉碎后的玉米秸秆是指粉碎至每段＜5cm。
5.根据权利要求2所述的一株绿色木霉的应用，其特征在于每88g发酵料中接种30mL绿色木霉分生孢子悬浮液；其中绿色木霉分生孢子悬浮液的浓度为3×106个孢子/mL。
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