CN106902354A - 双级靶向三元复合物核酸递释系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物医药技术领域，涉及一种D型IF‑7多肽修饰的还原性树枝状高分子(RHB)自组装双靶向核酸递送系统及其制备方法。本发明通过还原性树枝状阳离子聚合物聚氨基胺(RHB)自主压缩质粒DNA形成二元复合物；采用逆序D型技术对靶向肿瘤血管内皮细胞表面特异性受体Anxa1的IF7多肽改造并合成RIF7多肽；通过酰胺反应将RIF7多肽结合到靶向肿瘤细胞表面CD44受体的HA的分子结构上，合成双靶向包衣材料；通过静电作用对形成的RHB/DNA二元复合物进行包衣，形成靶向三元复合物核酸递释系统。本发明的递送系统能有效压缩和包裹质粒DNA，通过双级靶向作用使复合物逐级跨越肿瘤血管屏障和肿瘤细胞膜屏障，提高基因的转染效率，降低载体系统的毒性。

Description

双级靶向三元复合物核酸递释系统及其制备方法
技术领域
本发明属生物医药技术领域，涉及一种双级靶向三元复合物非病毒核酸递释系统及其制备方法，具体涉及一种D型IF-7多肽修饰的还原性树枝状高分子(RHB)自组装双靶向三元复合物核酸递送系统及其制备方法。
背景技术
基因治疗是当前肿瘤治疗研究领域的热点；该技术应用的关键是需要安全、高效的基因给药载体系统。与病毒载体相比，非病毒载体具有毒性低、易于合成、免疫反应低、可靶向性修饰等特点。阳离子聚合物是目前研究较多的一种非病毒基因递送载体，常用的有聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)、壳聚糖及其衍生物、聚赖氨酸(Poly(L-lysine)，PLL)、聚脒、聚氨基酯和树状高分子(Dendrimers)等。阳离子聚合物载体表面的正电荷可以与细胞膜表面产生静电吸附，被内吞进入细胞，所以该类基因递送载体系统具有较高的体外转染效率。
目前，所述阳离子聚合物载体的体内应用远不如病毒载体的效果，还存在下述许多问题亟待解决：
①毒性大：阳离子聚合物表面具有大量的正电荷，容易与细胞膜上带负电荷的多糖蛋白复合物发生静电作用，引起细胞毒性；此外，所述阳离子聚合物在体内循环时很容易发生聚集、引起红细胞凝集，引起机体毒性，降低体内转染效率；有研究表明，有些阳离子聚合物(如PEI)在细胞内释放出核酸后，聚合物骨架仍然滞留、蓄积在机体内，导致细胞和机体毒性；
②稳定性差：所述阳离子聚合物与核酸压缩形成的复合物容易与体内带负电荷的蛋白质如酶、免疫球蛋白、白蛋白等静电结合，使已形成的复合物解离，不仅降低了复合物的体内转染效率，还会影响正常的生理功能；
③特异性差：所述阳离子聚合物与核酸形成的复合物对肿瘤无特异性，与正常细胞也能发生强烈的相互作用，从而引发肝毒性、肾毒性等；因此，普通的阳离子聚合物非病毒载体不能高效地将治疗基因经静脉给药后递送到靶组织细胞发挥疾病治疗作用，当前非常必要研究高效、低毒、靶向性好、安全的非病毒基因递送系统。
研究显示，在聚合物载体材料中，树枝状高分子是高度分支的聚合物，具有单分散性和完全均一的分子结构；有研究公开了一种还原型聚氨基胺(RHB)是一类由双丙烯酰胺与三胺单体发生Michael加成聚合得到树枝状高分子聚合物，该聚合物的拓扑结构可通过聚合温度来加以控制，当反应温度提高到48℃以上，即可导致形成超树枝化的聚合物；目前RHB仅用于体外转染，尚未见体内转染的报道；其原因是RHB/核酸复合物表面带大量正电荷，对肿瘤靶向性差、血清稳定性低，体内循环时间短，基因难以长期稳定表达；因此，增强RHB/核酸复合物的肿瘤靶向性、降低表面正电荷性是非病毒基因递送载体体内应用的关键问题。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种具有稳定，低毒，高效转染及靶向性的双级靶向三元非病毒核酸递释系统，进一步用作转染试剂和非病毒基因递释载体。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种基于静电包衣的双级靶向三元非病毒核酸递释系统，具体涉及一种D型IF-7多肽修饰的还原性树枝状高分子(RHB)自组装双靶向核酸递送系统；该递送系统具有稳定，低毒，高效转染，通过二硫键的生物可降解性以及靶向性的优点，可用作转染试剂和非病毒基因递释载体。
本发明针对肿瘤微环境和静脉给药途径的特点，克服阳离子聚合物载体的局限性，提供了一种新型双靶向功能自组装三元复合物基因递送载体；选用双(丙稀酰)胱胺(CBA)和甲叉双丙烯酰胺(MBA)与1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)为单体，按适当摩尔比混合通过迈克尔加成合成还原型RHB作为载体材料，RHB与质粒DNA或siRNA自组装压缩成纳米级复合物，再以靶向肿瘤血管上皮细胞Anxa1受体的RIF7肽修饰的带负电荷且具有CD44受体靶向的HA对该复合物进行静电包衣，形成具有双靶向功能的RIF7-HA/RHB/DNA或siRNA三元复合物系统；对载体进行Anxa1受体、CD44双靶向功能修饰后，纳米载体可成功逐级跨越肿瘤血管屏障和肿瘤细胞膜屏障，增强纳米载体在肿瘤部位的蓄积，进一步增加在体内对核酸药物的递送，构建制得安全、有效、稳定的靶向性非病毒递送载体系统。
基于现有技术的理论基础，本申请中，巧妙的引入逆序D型技术对IF7多肽进行改造，合成了RIF7多肽，在不影响多肽靶向性的基础上，提高多肽在血浆中的稳定性，根据HA和RIF7的分子结构，将RIF7多肽结合到HA的分子结构上，彼此不会影响各自的靶向能力，形成具有双靶向的载体功能元件。
本发明中，选用的单体分别为CBA和MBA，制成的RHB结构中的大量胺基，进入溶酶体后产生“质子海绵效应”，保护DNA或siRNA不被溶酶体破坏。由于RHB结构中存在二硫键，在体内生理条件下被细胞内还原型谷胱甘肽还原降解，使RHB高聚物降解成小分子化合物，不仅可提高基因药物的细胞内转染效率，且明显降低材料的细胞毒性。
本发明中，选择透明质酸为静电包衣的阴离子聚合物；除了作为静电包衣材料，HA还可特异性靶向肿瘤细胞表面CD44受体，由于CD44受体介导的HA肿瘤细胞靶向仅仅解决了肿瘤细胞膜屏障，不能有效解决纳米递送系统在传递过程中遇到的肿瘤血管上皮屏障；因此，在以HA靶向肿瘤细胞的基础上，本发明选择一种特异性靶向肿瘤细胞膜的配体作为递送系统的另外一个靶向头基；所述IF7肽易与肿瘤血管内皮细胞表面特异性高表达的受体Anxa1结合；所述IF7虽然具有很强的靶向Anxa1受体的能力，但是与所有的L型多肽类似，IF7的稳定性非常差，对多肽进行逆序D型改造能显著增强多肽的稳定性和抗蛋白酶活性，并且不影响多肽的生物功能，
具体的，本发明中，选用聚氨基胺树枝状阳离子聚合物材料与质粒DNA形成RHB/DNA二元复合物，作为所述三元复合物的内核：
本发明通过还原性树枝状阳离子聚合物聚氨基胺(RHB)自主压缩质粒DNA形成二元复合物；采用逆序D型技术对靶向肿瘤血管内皮细胞表面特异性受体Anxa1的IF7多肽进行改造，合成了RIF7多肽；通过酰胺反应将RIF7多肽结合到靶向肿瘤细胞表面CD44受体的HA的分子结构上，合成双靶向包衣材料；通过静电作用对形成的RHB/DNA二元复合物进行包衣，形成靶向三元复合物核酸递释系统，制得D型IF-7多肽修饰的还原性树枝状高分子(RHB)自组装双靶向核酸递送系统。
本发明中，解决的第一个技术问题是提供一种工艺合理，生产成本低，操作简单，毒性较低的聚氨基胺及化学合成方法；即提供一种可生物降解的聚氨基胺聚合物及化学合成方法；所述可降解的聚氨基胺是由双(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)通过迈克尔加成而制得；该聚氨基胺是可生物降解的基因传送聚合物之一，与非生物可降解的阳离子聚合物比较，毒性低，更具有体内传送基因的潜力；
所述聚氨基胺的组分及含量为双丙烯酰胺与三胺摩尔比为2:1；
其合成方法为：按摩尔比(1：2：1.5)分别精密称取双(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)，将CBA和MBA加入盛有AEPZ甲醇/水混合液(7/3，v/v)的圆底烧瓶中，磁力搅拌、N2保护、避光，50℃油浴反应3d，得到粘稠溶液；加入少量4-氨基-1-丁醇(ABOL)，50℃继续搅拌12h；将产物溶液HCL水溶液(pH＝3)透析1d，蒸馏水透析2d，冻干，称重，制得所述RHB，其中可降解的聚氨基胺的分子量为60kDa。
本发明解决所述技术问题所采用的技术方案中，在反应过程中不需要加催化剂；所述两种双丙烯酰胺单体为双(丙稀酰)胱胺(CBA)和甲叉双丙烯酰胺(MBA)(任意摩尔比)与三胺单体通过Michael加成反应而得；
其反应方程式为：
本发明中，解决的第二个技术问题是提供一种可对RHB/DNA二元复合物进行静电包衣修饰的阴离子高分子生物材料；
所涉及的阴离子高分子生物材料为透明质酸(HA)；所述HA可特异性靶向肿瘤细胞表面CD44受体；由于CD44受体介导的HA肿瘤细胞靶向仅仅解决了肿瘤细胞膜屏障，不能有效解决纳米递送系统在传递过程中遇到的肿瘤血管上皮屏障，为进一步加强复合物的靶向能力，本发明人在HA上通过酰胺反应键合特异性靶向肿瘤血管内皮细胞表面特异性受体Anxa1的IF7多肽；由于IF7的体内的稳定性非常差，因此，对其进行了逆序D型改造，合成了稳定性明显提高而特异性不变的RIF7多肽；解决该技术问题的技术方案是提供一种合成RIF7-HA的方法；解决该技术问题的技术方案是利用酰胺反应使RIF7与HA合成RIF7-HA；本发明解决其技术问题所采用的技术方案中说明，该反应的反应溶剂为水；将HA的羧基活化后在pH7.4条件下进行反应。
本发明中，解决的第三个技术问题是提供一种靶向三元非病毒载体系统的制备方法；该三元体系是由上述的RHB、DNA、RIF7-HA制备而成；本发明中通过静电吸附理论，所述RHB与质粒DNA自组装形成RHB/DNA复合物，进一步采用RIF7-HA对RHB/DNA二元复合物进行静电包衣，形成RIF7-HA/RHB/DNA靶向三元复合物；一方面可利用HA的负电荷降低RHB/DNA复合物表面的正电荷，从而降低复合物的毒性，另一方面可利用高分子之间产生的较强的静电作用力，长时间保持载体系统在血清中的稳定性，因此，为该载体系统体内转染提供了希望；进一步，所述载体系统包衣层的靶向功能可增加复合物在肿瘤部位的蓄积，明显提高其治疗效果。
具体而言，本发明的D型IF-7多肽修饰的还原性树枝状高分子(RHB)自组装双靶向核酸递送系统的制备方法包括，将还原性树枝状聚合物聚氨基胺(RHB)与含有报告基因或治疗基因的质粒DNA或小干扰RNA(siRNA)于水溶液中混合后，涡旋5s，静置5min，经自组装压缩得到RHB/DNA二元复合物载体系统；根据静电吸附理论，采用逆序D型改造的IF7靶向修饰的透明质酸(HA)进一步对RHB/DNA二元复合物载体系统进行静电包衣，制得靶向三元复合物载体系统；
本发明中，所述还原性树枝状聚合物RHB由两种双丙烯酰胺单体与三胺单体发生Michael加成制备而成，并可通过功能化基团对其进行修饰；
本发明中，进一步静电包衣修饰的材料为逆序D型改造的IF7修饰的透明质酸(HA)；
本发明中，所述氨基酸序列为RQWLLFI，所有的氨基酸均为D型氨基酸；
本发明中，合成所述的双级靶向静电包衣材料的方法，包括以下步骤：
精密称取HA(7.5kD)溶解于PBS(pH7.4)磁力搅拌至澄清，加入EDC·HCL和HOBT，继续搅拌2h；将等摩尔的RIF7相关肽用三蒸水溶解后逐滴加入活化的HA溶液中，加入适量的NaCl，加入N-甲基吗啉调节pH至7.4；搅拌过夜，用分子量3500的透析袋透析，除去未反应的多肽，冻干制得RIF7-HA；
本发明中，合成所述的可降解的还原性树枝状聚合物RHB的方法，包括以下步骤：
按摩尔比(1：2：1.5)分别精密称取双(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)，将CBA和MBA加入盛有AEPZ甲醇/水混合液(7/3，v/v)的圆底烧瓶中，磁力搅拌、N2保护、避光，50℃油浴反应3d，得到粘稠溶液，加入少量4-氨基-1-丁醇(ABOL)，50℃继续搅拌12h。将产物溶液HCL水溶液(pH＝3)透析1d，蒸馏水透析2d，冻干，称重，制得RHB；
本发明中，所述还原性树枝状聚合物RHB及其化学合成方法，反应所需两种双丙烯酰胺单体为双(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉双丙烯酰胺(MBA)，三胺单体为1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)；
所述双(丙稀酰)胱胺(CBA)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)配比(摩尔比)为1：2：1.5，双丙烯酰胺与三胺的摩尔比为2:1；
其化学合成原理为Michael加成；
其反应温度50℃，反应时间3d，避光，氮气保护；
其反应过程不需要加催化剂；
所述的还原性树枝状聚合物RHB的化学结构式为树枝状，并可生物降解；
本发明中，所述的双级靶向静电包衣材料RIF7-HA及其制备方法，其化学合成原理为酰胺合成反应。
本发明的实施例的方案中提供了一种转染真核细胞的方法，该方法包含用载体系统压缩核酸分子接触细胞，借此传送核酸分子进入细胞；该实施方案中所涉及的核酸分子包括DNA，小干扰RNA(siRNA)。
本发明通过还原性树枝状阳离子聚合物聚氨基胺(RHB)自主压缩质粒DNA形成二元复合物；采用逆序D型技术对靶向肿瘤血管内皮细胞表面特异性受体Anxa1的IF7多肽进行改造，合成了RIF7多肽；通过酰胺反应将RIF7多肽结合到靶向肿瘤细胞表面CD44受体的HA的分子结构上，合成双靶向包衣材料；通过静电作用对形成的RHB/DNA二元复合物进行包衣，形成靶向三元复合物核酸递释系统。本发明所述递送系统可有效压缩和包裹质粒DNA，通过双级靶向作用使复合物逐级跨越肿瘤血管屏障和肿瘤细胞膜屏障，提高基因的转染效率，降低载体系统的毒性。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1是合成产物RHB和RIF7-HA的1H-NMR核磁图谱(图1A为RHB，图1B为RIF7-HA)，结果表明合成成功。
图2是透射电镜下RHB/DNA二元体系和RIF7-HA/RHB/DNA三元体系的形态(图2a为RHB/DNA二元体系，图2b为RIF7-HA/RHB/DNA三元体系)。
图3是用凝胶阻滞电泳分析证明RHB对质粒DNA的压缩能力及按不同质量比加入HA后琼脂糖凝胶电泳的变化情况，图3A表示不同质量比RHB对质粒DNA的压缩能力(lane 1-8分别表示Marker、RHB/DNA(w/w)0:1,1:1,2.5:1,5:1,10:1,50:1,100:1)；图3B表示按不同质量比加入HA后琼脂糖凝胶电泳的变化情况(lane 1-6分别表示Marker、HA/RHB/DNA质量比为0:5:1,1:5:1,2.5:5:1,5:5:1)；实验结果表明RHB对质粒DNA具有较强的压缩能力，同时加入HA包衣后RHB/DNA二元体系仍保持稳定。
图4是经HA包衣前后，RHB/DNA对B16F10细胞的毒性(图4A表示静电包衣前，RHB/DNA对B16F10细胞的毒性；图4B表示静电包衣后，HA/RHB/DNA三元体系对B16F10细胞的毒性)；结果表明，与对照组相比，RHB/DNA小于5:1时，毒性作用显著低于LipofectamineTM2000，而HA/RHB/DNA三元体系在实验范围内，对B16F10细胞的毒性随着HA量的增加逐渐降低，并且均显著低于LipofectamineTM2000。
图5表示载有报告基因pEGFP的二元复合物转染B16F10细胞的荧光显微照片(A)以及流式细胞仪定量结果(B)；显示随着RHB/DNA质量比的增加，转染效率提高，当RHB/DNA质量比为5:1或10:1时，二元复合物的转染效率与阳离子脂质体组相当。
图6为载有报告基因pEGFP的靶向三元复合物转染B16F10细胞的荧光显微照片(A)以及流式细胞仪定量结果(B)，其中显示，在无血清条件下，RIF7-HA/RHB/DNA复合物的转染效率高于RHB/DNA复合物，达到85％左右，随着血清比例的增加，RIF7-HA/RHB/DNA复合物转染效率一直保持较高水平，说明RIF7-HA/RHB/DNA具有更好的血浆耐受性，证明对多肽靶头进行逆序D型改造对于增强复合物载体系统的靶向性具有重要的意义。
图7是荷虫荧光素酶肺肿瘤裸鼠经尾静脉注射复合物后肿瘤部位实时荧光分布图，其中以阴性siRNA为对照组，图中显示，RHB/siRNA二元复合物组在注射后48h肿瘤部位荧光强度仍然很高，说明二元复合物系统不能有效将siRNA递送到肿瘤部位，使虫荧光素表达降低；HA/RHB/siRNA三元复合物组注射后24h荧光强度变化不大，48h后观察到部分降低，而靶向三元复合物RIF7-HA/RHB/siRNA给药后24h即出现明显的沉默虫荧光素酶表达效果，48h进一步增强，直观地反映了复合物体系在肿瘤部位的蓄积过程；所述的靶向三元复合物体系可以将治疗基因成功递送到肿瘤部位，并成功完成体内转染。
具体实施方式
通过下列实施实例进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围，不局限于此。
实施例1：合成树枝状阳离子聚合物聚氨基胺(RHB)的方法
精密称取CBA(0.260g，1.0mmol)、MBA(0.308g，2.0mmol)，加入盛有AEPZ(0.193g，1.5mmol)甲醇/水混合液(3.5mL，7/3，v/v)的圆底烧瓶中，磁力搅拌、N2保护、避光，50℃油浴反应3d，得到粘稠溶液。加入少量4-氨基-1-丁醇，50℃继续搅拌12h。将产物溶液HCL水溶液(pH＝3)透析1d，蒸馏水透析2d，冻干，称重，制得RHB。
实施例2：合成RIF7修饰的HA(RIF7-HA)的方法
精密称取HA(7.5kD，50mg，0.005mmol)溶解于PBS(5ml，pH7.4)磁力搅拌至澄清，加入EDC·HCL(20mg，0.1mmol)和HOBT(15mg，0.1mmol)，继续搅拌2h。将11.8mgRIF7相关肽用5ml三蒸水溶解后逐滴加入活化的HA溶液中，加入适量的NaCl，加入140μlN-甲基吗啉调节pH至7.4。搅拌过夜，用分子量3500的透析袋透析，除去未反应的多肽，冻干。
实施例3：制备RHB/DNA复合物纳米粒的方法
阳离子聚合物RHB与DNA自组装形成纳米粒；分别制备1μg/μl的聚合物RHB的水溶液和1μg/μl的DNA水溶液，按照聚合物RHB与DNA的质量比(w/w)取相应体积的母液分散于pH7.4的PBS中，然后与等体积的DNA溶液混合，涡旋5s并室温下静置孵育5min，制得RHB/DNA二元复合物纳米粒。
实施例4：制备RIF7-HA/RHB/DNA靶向三元复合物
分别制备1μg/μl的聚合物RHB的水溶液和1μg/μl的DNA水溶液，按照聚合物RHB与DNA的质量比(w/w)取相应体积的母液分散于pH7.4的PBS中，然后与等体积的DNA溶液混合，涡旋5s并室温下静置孵育5min，即得RHB/DNA二元复合物纳米粒；加入适量体积的1μg/μl的RIF7-HA水溶液，混合均匀，室温下孵育30min，得RIF7-HA/RHB/DNA三元复合物纳米粒。
实施例5：凝胶电泳阻滞试验
为了证明阳离子聚合物RHB对DNA的压缩能力和HA的加入对RHB/DNA二元复合物的影响，10μl二元复合物或三元复合物(含500ng质粒DNA)与2μlloading buffer均匀混合，加样至0.7％琼脂糖凝胶板中，TBE缓冲溶液中100V电压进行凝胶电泳阻滞试验。
实施例6：RHB/DNA的细胞毒性实验
采用MTT法评价二元复合物对B16F10细胞的毒性作用，以5000个细胞/孔的细胞密度将细胞接种于96孔板，培养24hr后，用无血清培养基置换，分别加入RHB/DNA二元复合物纳米粒，使最终每孔中质粒为0.2μg，LipofectamineTM2000为对照组，4hr后去除纳米粒培养基，每孔加入100μl新鲜的含血清培养基继续培养，48hr后，吸弃原有培液，每孔加入180μlPBS和20μlMTT溶液(5mg/ml)在37℃孵育4hr，吸弃MTT溶液，每孔加入150μlDMSO，混匀，使紫色结晶完全溶解，以570nm波长测定吸光度值。
实施例7：HA/RHB/DNA的细胞毒性实验
采用MTT法评价三元复合物对B16F10细胞的毒性作用，以5000个细胞/孔的细胞密度将细胞接种于96孔板，培养24hr后，用无血清培养基置换，分别加入HA/RHB/DNA三元复合物纳米粒，使最终每孔中质粒为0.2μg，LipofectamineTM2000为对照组，4hr后去除纳米粒培养基，每孔加入100μl新鲜的含血清培养基继续培养，48hr后，吸弃原有培液，每孔加入180μlPBS和20μlMTT溶液(5mg/ml)在37℃孵育4hr。吸弃MTT溶液，每孔加入150μlDMSO，混匀，使紫色结晶完全溶解，以570nm波长测定吸光度值。
实施例8：RHB/DNA介导绿色荧光蛋白报告基因的体外转染
B16F10细胞以5×104个/0.5ml/孔均匀接种到24孔板中，当细胞融合度达80-90％时，开始转染操作，吸弃旧的培养液，每孔加入0.4ml新鲜的不含血清培养液，然后将制备好的复合物加入(约100μl)，每孔中质粒为0.8μg，每种处方做两个或者三个复孔，轻轻摇动24孔板使复合物均匀存在于孔中，培养箱中培养4hr后，吸弃含有复合物的培养液，PBS轻轻洗涤一遍，换上含10％FBS的完全细胞培养液，每天换以新鲜的培养液，继续培养48hr；同时操作阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为阳性对照。
实施例9：RIF7-HA/RHB/DNA介导绿色荧光蛋白报告基因的体外转染
B16F10细胞以5×104个/0.5ml/孔均匀接种到24孔板中，当细胞融合度达80-90％时，开始转染操作，吸弃旧的培养液，每孔加入0.4ml新鲜的不含血清培养液，然后将制备好的复合物加入(约100μl)，每孔中质粒为0.8μg，每种处方做两个或者三个复孔，轻轻摇动24孔板使复合物均匀存在于孔中，培养箱中培养24hr后，吸弃含有复合物的培养液，PBS轻轻洗涤一遍，换上含10％FBS的完全细胞培养液，每天换以新鲜的培养液，继续培养48hr；同时操作阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为阳性对照。
实施例10：细胞转染效率的评定
(1)荧光显微镜下观察评价绿色荧光蛋白报告基因体外细胞转染效率
转染48hr后，吸弃培养液，PBS轻轻洗涤两遍，每孔加入2滴HBSS，于显微镜下观察拍照；
(2)流式细胞仪法评价绿色荧光蛋白报告基因体外细胞转染效率
转染48hr后，吸弃培养液，PBS轻轻洗涤两遍，胰酶消化细胞，收集细胞至1.5ml EP管中，1500rpm，5min离心，弃上清，每管中加入适量的PBS，使细胞浓度在5×105个/ml，细胞重悬均匀后，上机测试，每次测试计数1万个细胞。
实施例11：Luciferase(GL2+GL3)siRNA的体内转染实验
将虫荧光素肺癌A549-Luc细胞按常规条件培养，制备2×106/mL的单细胞悬液，接种到BALB/c裸鼠右腋皮下，每只接种0.2mL，当肿瘤体积达到100-200mm3进行体内转染实验；制备RIF7-HA/RHB/siRNA三元复合物，立即尾静脉注给药，每只给药300μL；麻醉后在小动物活体成像仪上观察拍照，拍照前5分钟腹腔注射虫荧光素酶底物(150mg/kg)，转染24h或48h后再次拍照。

Claims (10)

1.双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，通过下述方法制备：
用聚氨基胺树枝状阳离子聚合物材料与质粒DNA形成RHB/DNA二元复合物，作为所述三元复合物的内核：
采用逆序D型技术改造靶向肿瘤血管内皮细胞表面特异性受体Anxa1的IF7多肽，合成RIF7多肽；通过酰胺反应将RIF7多肽结合到靶向肿瘤细胞表面CD44受体的HA的分子结构上，合成双靶向包衣材料；通过静电作用对形成的RHB/DNA二元复合物进行包衣，形成靶向三元复合物核酸递释系统，制得D型IF-7多肽修饰的还原性树枝状高分子(RHB)自组装双靶向核酸递送系统。
2.按权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，其中，所述聚氨基胺是由双(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)通过迈克尔加成制得；其中，所述双(丙稀酰)胱胺(CBA)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)摩尔比为1：2：1.5，双丙烯酰胺与三胺的摩尔比为2:1。
3.按权利要求1或2所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，所述聚氨基胺的按下述合成方法：按摩尔比1：2：1.5分别取双(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉双丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)，将CBA和MBA加入盛有AEPZ甲醇/水混合液7/3，v/v的圆底烧瓶中，磁力搅拌、N2保护、避光，50℃油浴反应，得粘稠溶液；加入4-氨基-1-丁醇(ABOL)，50℃继续搅拌；将pH＝3的产物溶液HCL水溶液透析，蒸馏水透析，冻干，称重，制得所述RHB，其中可降解的聚氨基胺的分子量为60kDa。
4.按权利要求2或3所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，所述的反应过程中不加催化剂；所述两种双丙烯酰胺单体为双(丙稀酰)胱胺(CBA)和甲叉双丙烯酰胺(MBA)按任意摩尔比与三胺单体通过Michael加成反应制得；
其反应方程式为：
5.按权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，所述静电包衣修饰的材料为逆序D型改造的IF7修饰的透明质酸(HA)。
6.按权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，所述还原性树枝状聚合物RHB由两种双丙烯酰胺单体与三胺单体发生Michael加成制备成，并通过功能化基团对其进行修饰。
7.按权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，所述的IF7多肽其氨基酸序列为RQWLLFI。
8.按权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，通过下述方法合成所述的双级靶向静电包衣材料：
取HA7.5kD溶解于PBS pH7.4磁力搅拌至澄清，加入EDC·HCL和HOBT，继续搅拌；将等摩尔的RIF7相关肽用三蒸水溶解后滴加入活化的HA溶液中，加入NaCl，加入N-甲基吗啉调节pH至7.4；搅拌过夜，用分子量3500的透析袋透析，除去未反应的多肽，冻干制得RIF7-HA。
9.按权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统，其特征在于，通过下述方法制备所述靶向三元非病毒载体系统，通过静电吸附理论，所述RHB与质粒DNA自组装形成RHB/DNA复合物，进一步采用RIF7-HA对RHB/DNA二元复合物进行静电包衣，形成RIF7-HA/RHB/DNA靶向三元复合物。
10.权利要求1所述的双级靶向三元复合物核酸递释系统在用于制备转染试剂和非病毒基因递释载体中的用途。
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