CN106898042A - 一种光学散射模拟模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光学散射模拟模型的构建方法及其应用。将所需构建模型的散射介质置于显微镜下进行三维立体扫描成像，获得散射介质的三维结构图像；将每张二维结构图像转为灰度图像矩阵后进行幅值归一化处理，获得归一化图像矩阵；设定相位差权重，将相位差权重乘到每个归一化图像矩阵得到光学相位差分布矩阵，由所有光学相位差分布矩阵组成光学散射模拟模型。本发明简单、便捷，能够在制作实验样本的同时获得其对应的数值模拟模型，更接近实验中光束与生物组织的相互作用，更好地模拟提升实验效率。
Description
技术领域
本发明属于光学显微成像领域，特别涉及了一种光学散射模拟模型的构建方法及其应用，并应用于模拟光学散射成像过程。
背景技术
在生物医学光学领域，光学散射是制约光学成像质量的主要因素。多数深部组织成像的光学技术(例如，激光共聚焦成像，双光子显微镜和光学相干层析扫描)主要利用非散射光子(即弹道光子)成像。弹道光子的数量随深度增加呈指数式衰减，因此将成像范围限制在了1mm的深度。
早先应用在天文学中的自适应光学技术，为实现深层生物组织成像提供了新的技术支持。在开发自适应光学生物成像技术时，需要利用计算机模拟光学散射的过程，从而在实验前得到不同实验条件与参数下的光学矫正结果，对成像技术进行评判。
计算机光学散射模拟是基于菲涅尔衍射原理，利用快速傅里叶变换(FFT)对光的散射进行逐层模拟的。当光束经过一薄层散射介质后，其振幅能够继续向前传播，而相位发生了改变，其相位改变量可以用矩阵形式表示，即透过的光束在保持其振幅与波矢的同时，附加了一个相位掩膜。对于较厚的散射介质，可以分解为多层散射相位掩膜矩阵的依次叠加。传统的光学散射模拟介质是利用计算机生成的随机矩阵来构建散射颗粒的。随机矩阵的单元值均在0～1之间分布，通过设定单元阈值来控制散射颗粒的浓度。利用插值的方法对矩阵进行平滑扩增，使其呈现出接近实际小球的圆滑相位变化趋势。通过设定每层矩阵的厚度，将多层矩阵叠加构建散射介质。然而由于随机矩阵的单元值随机分布，使得各层矩阵之间模拟的颗粒连续性不高，导致其不能很好的体现实际生物组织或散射小球样本的结构分布，降低了散射模拟对成像技术的评价可靠性。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的在于利用生物组织或散射介质的三维结构图像，构建出多层结构上连续分布的相位差矩阵，用于模拟散射介质内的光学散射。通过将生物三维成像技术与计算机光学散射模拟相结合，提出了一种光学散射模拟模型的构建方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
一、一种光学散射模拟模型的构建方法：
(1)将所需构建模型的散射介质置于显微镜下，在显微镜的物镜下进行三维立体扫描成像，获得散射介质的三维结构图像；
(2)将每张二维结构图像转为灰度图像矩阵，灰度图像矩阵的元素是由灰度图像中的灰度值构成，并对每个灰度图像矩阵进行幅值归一化处理，获得归一化图像矩阵；
(3)根据散射介质的物理参量计算设定相位差权重，并将相位差权重乘到每个归一化图像矩阵上，得到光学相位差分布矩阵，由所有光学相位差分布矩阵组成光学散射模拟模型。
所述的散射介质的三维结构图像是由显微镜在沿自身光轴方向的不同散射结构层位置(设置轴向步进距离)进行扫描获得的沿光轴依次排列的各层二维结构图像组成，并且通过显微镜参数换算获得二维结构图像所扫描范围的实际尺寸。
所述步骤(3)根据散射介质的物理参量计算设定相位差权重具体是采用以下公式计算获得入射光散射时所改变的最大相位差△φ，入射光入射到散射介质上被显微镜扫描接收，以最大相位差△φ作为相位差权重：
△φ＝2πnd/λ
其中，d为每层扫描的散射介质厚度，λ表示入射光的波长，n表示散射介质的折射率。
所述的散射介质为但不限于已表达荧光蛋白或进行荧光染色的离体生物组织、经透明化处理的离体生物组织或含荧光小球的琼脂块等。
所述的显微镜采用宽场荧光显微镜、激光片层扫描显微镜、激光共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜等多种光学成像显微镜。
所述步骤(1)中的三维结构图像是包括单份厚度确定的由多层散射结构二维结构图像组成的三维结构图像或者多份连续分布散射介质的三维结构图像的结合。
所述步骤(2)中的矩阵幅值归一化处理具体是指：针对每个灰度图像矩阵，将灰度图像矩阵中的各个元素值均除以所有元素值中的最大值后替换原元素值，使得归一化处理后矩阵中的各元素值按0～1分布，用以表征相位差值的幅度。
所述步骤(3)中的相位差分布矩阵是指将散射介质的每层散射结构表征为光相位改变量的幅值，并对每层灰度图像矩阵乘以最大相位差，从而将结构图像矩阵转为光因散射结构而导致的相位差分布矩阵。
本发明涉及到的物理参量具体包括：实际扫描成像的样本尺寸L、每层扫描的散射介质厚度d、显微镜的轴向步进距离△z、散射介质的折射率n、入射光波长λ等。
二、本发明在光学散射模拟与自适应光学矫正模拟中的应用。
本发明将矩阵相位变化趋势与实际光束遇到介质发生的散射相对应，通过相位差的幅值表征立体结构信息，相邻矩阵之间保持原散射介质的结构连续性。
本发明的优势与有益效果是：
本发明利用具有结构连续性的生物组织或散射介质的三维结构图像，生成能够表征光学散射的相位差分布矩阵，从而能够在计算机光学散射模拟时，提供接近真实组织的散射结构分布，为光学成像技术与自适应光学矫正技术的评价提供了更加可靠的计算机模拟模型。
本发明构建模型所需的材料易于获取与制备，并且能够方便的与多种光学显微成像技术结合，构建成本低，构建方法简单、便捷。
相对于传统的模型构建方法，本发明舍去了通过设定浓度参数来逼近真实散射情况的方法，同时也免去了平滑相位差分布的插值方法。
相对于传统的模型构建方法，本发明保留了真实散射介质的内部结构连续性，不会产生因前后相位差矩阵分布不连续导致的模拟失真。
本发明适用性广泛，能够用于各类需要接近真实光学散射的计算机模拟之中。
附图说明
图1为实施例1的脑组织样本经共聚焦显微镜成像后的图像；
图2为实施例1对脑组织样本成像后按深度进行三维重建的立体结构图像；
图3为实施例2的荧光小球样本经双光子荧光显微镜成像后的图像；
图4为实施例2对荧光小球样本成像后按深度进行三维重建的立体结构图像；
图5为实施例1脑组织样本光学相位差分布矩阵按深度依次排列构建模型的示意图；
图6为实施例2荧光小球光学相位差分布矩阵按深度依次排列构建模型的示意图；
图7为实施例1计算机模拟光束经过脑组织的光学散射模型后的散射光场；
图8为实施例1计算机模拟自适应光学矫正将脑组织模型散射矫正后的结果；
图9为实施例2计算机模拟光束经过荧光小球的光学散射模型后的散射光场；
图10为实施例2计算机模拟自适应光学矫正将小球模型散射矫正后的结果。
具体实施方式
以下样本制备和模型构建实施例可以更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
本发明的实施例如下：
实施例1
1.脑组织的固定和分离，实施例采用小鼠大脑，其固定和分离过程为：质量浓度2％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(50mg/kg)，待小鼠完全麻醉后腹面向上固定。沿腹腔打开胸腔，尽可能多暴露心脏。找到心尖，用止血钳预夹住心尖，持针从心尖略偏右下进，插入有突破感即停，打开灌流泵以35mL/min流速灌注0.1mol/L浓度的磷酸缓冲液。剪破右心耳，将流速提高到100mL/min冲洗全身血液，冲洗2分钟。换质量浓度4％的多聚甲醛100mL/min灌注，待鼠尾翘起后将流速降至35mL/min，灌注10分钟。灌注完成后取脑组织，灌流成功情况下大脑完全变白，无红色血管。后续将脑置于质量浓度4％多聚甲醛4℃固定24小时。固定完成后将全脑置于脑模具上，刀片切下1mm厚度的脑片
2.用无尘试纸轻轻吸去所有的试剂并将脑片放入24孔板中。加入1mL PBST(包含0.1％体积浓度Triton X-100的磷酸缓冲液)恒温摇床30摄氏度50rpm清洗24小时。然后吸走所有PBST，重新加入1mL PBST恒温摇床30摄氏度50rpm清洗30分钟。再次吸走所有PBST，加入新的1mL PBST和20μL兔抗鼠GFAP一抗，恒温摇床30摄氏度50rpm处理48小时。完成后回收一抗，重新加入1mL PBST恒温摇床30摄氏度50rpm再次清洗24小时，期间每4-6h换液。吸走所有PBST，加入新的1mL PBST、1μL DAPI和20μL羊抗兔Cy3二抗。恒温摇床30摄氏度50rpm处理24小时。吸走所有溶液，再加入1mL PBST恒温摇床30摄氏度50rpm清洗24小时。处理完成后将小鼠脑片置于载玻片上，在脑片上滴加约40μL磷酸缓冲液，盖上盖玻片。
3.制片完成后在奥林巴斯FV1000荧光共聚焦显微镜下进行成像。显微镜成像中使用60倍物镜，在视野下最开始能观察到荧光信号的样本位置(即样本的最表层)记为扫描初始层。向样本深处方向(Z轴方向)移动物镜至无法观察到荧光信号时记为扫描结束层。从扫描初始层开始每间隔0.65μm的深度拍摄一张成像图。单层成像结果如图1所示。完成对样本Z轴多层扫描后可进行图像匹配并完成对样本的三维重建，最终结果如图2所示。
4.将获得的三维重建图像按层由浅至深依次输出为二维结构图像，所得图片为不同深度处脑组织的结构横截图。将图片导入计算机辅助软件中，将其读取转为灰度图像矩阵形式。然后找出各层矩阵最大值并对矩阵进行幅值归一化处理。
根据二维结构矩阵对应的脑组织样本物理参数，实施例的实际扫描成像的样本尺寸L约为318μm、每层扫描的样本厚度d约为0.65μm、显微镜的轴向步进距离△z约为0.65μm、散射结构的折射率n约为1.53，入射光波长为488nm，求出每层矩阵对应的光学相位最大改变量(最大相位差)△φ为12.8，作为相位差权重。
将相位差权重乘到各个归一化二维图像矩阵上，得到光学相位差分布矩阵。每层矩阵的每个像素单元值都在0～2πnd/λ之内分布，其幅值代表了矩阵区域所对应的脑组织结构对光束的散射强弱。
将处理完的相位差分布矩阵按深度依次排列，如图5所示，并附加有每层矩阵对应的厚度大小，以进行进一步的计算机光学散射模拟。
利用所建散射模型通过MATLAB软件工具进行计算机模拟光束穿过可得图7的散射图。图8为通过计算机模拟自适应光学矫正技术进行任意位置多点光聚焦及光斑优化，将图7所示散射光斑矫正后得到的图样。对比图7和图8可以发现，经过光学矫正之后的光斑在中央获得了更大的光强分布，验证了模型在计算机模拟自适应光学矫正技术上应用完成可行，具有其突出显著的技术效果。
实施例2
1.取10μL直径为1um的荧光小球悬浊液，加入乘有500μL去离子水的1.5mL离心管中稀释。将此离心管置入超声破碎仪中使荧光小球分散均匀，设置参数30秒钟超声震荡与30秒钟静止循环30次处理。另取一玻璃锥形瓶，加入0.2g琼脂糖与10mL去离子水，同时将处理好的荧光小球溶液加入锥形瓶中。手动摇匀后放入微波炉内加热至溶液沸腾或无明显琼脂糖颗粒未溶解。加热完成后立即将热溶液灌注入金属方形模具(金属板内加工有10mm×8mm×1mm的凹槽)，待冷却后形成包含有均匀分散荧光小球的方形琼脂糖凝胶。将凝胶从模具中取出置于载玻片上，并在凝胶上加盖盖玻片。
2.制片完成后在奥林巴斯双光子荧光显微镜下进行成像。显微镜成像中使用20倍物镜，在视野下最开始能观察到荧光信号的样本位置(即样本的最表层)记为扫描初始层。向样本深处方向(Z轴方向)移动物镜至无法观察到荧光信号时记为扫描结束层。从扫描初始层开始每间隔1μm的深度拍摄一张成像图。单层成像结果如图3所示。完成对样本Z轴多层扫描后可进行图像匹配并完成对样本的三维重建，最终结果如图4所示。
3.将获得的三维重建图像按层由浅至深依次输出为二维结构图像，所得图片为不同深度处荧光小球的结构横截图。将图片导入计算机辅助软件中，将其读取转为灰度图像矩阵形式。然后找出各层矩阵最大值并对矩阵进行幅值归一化处理。
根据二维结构矩阵对应的含有荧光小球的琼脂块物理参数，实施例的实际扫描成像的样本尺寸L约为212μm、每层扫描的样本厚度d约为1μm、显微镜的轴向步进距离△z约为1μm、散射结构的折射率n约为1.59，入射光波长为488nm，求出每层矩阵对应的光学相位最大改变量(最大相位差)△φ为20.5，作为相位差权重。
将相位差权重乘到所有的归一化二维图像矩阵上，得到光学相位差分布矩阵。每层矩阵的每个像素单元值都在0～2πnd/λ之内分布，其幅值代表了矩阵区域所对应的荧光小球琼脂块结构对光束的散射强弱。将处理完的相位差分布矩阵按深度依次排列，如图6所示，并附加有每层矩阵对应的厚度大小，以进行进一步的计算机光学散射模拟。
利用所建散射模型通过MATLAB软件工具进行计算机模拟光束穿过可得图9的散射图。图10为通过计算机模拟自适应光学矫正技术进行任意位置多点光聚焦及光斑优化，将图9所示散射光斑矫正后得到的图样。对比图9和图10可以发现，经过光学矫正之后的光斑在中央获得了更大的光强分布，验证了模型在计算机模拟自适应光学矫正技术上应用的可行性。
由上述实施例可见，本发明散射模型构建方法简单、便捷，能够在制作实验样本的同时获得其对应的数值模拟模型。相比于利用随机矩阵插值生成的散射矩阵模型，更接近实验中光束与生物组织的相互作用，能够更好地在实验前对不同条件下的结果进行模拟，提升实验效率。
Claims (9)
1.一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将所需构建模型的散射介质置于显微镜下，在显微镜的物镜下进行三维立体扫描成像，获得散射介质的三维结构图像；
(2)将每张二维结构图像转为灰度图像矩阵，并对每个灰度图像矩阵进行幅值归一化处理，获得归一化图像矩阵；
(3)根据散射介质的物理参量计算设定相位差权重，并将相位差权重乘到每个归一化图像矩阵上，得到光学相位差分布矩阵，由所有光学相位差分布矩阵组成光学散射模拟模型。
2.根据权利要求1所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：所述的散射介质的三维结构图像是由显微镜在沿自身光轴方向的不同散射结构层位置进行扫描获得的沿光轴依次排列的各层二维结构图像组成，并且通过显微镜参数换算获得二维结构图像所扫描范围的实际尺寸。
3.根据权利要求1所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：
所述步骤(3)根据散射介质的物理参量计算设定相位差权重具体是采用以下公式计算获得入射光散射时所改变的最大相位差△φ，以最大相位差△φ作为相位差权重：
△φ＝2πnd/λ
其中，d为每层扫描的散射介质厚度，λ表示入射光的波长，n表示散射介质的折射率。
4.根据权利要求1所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：
所述的散射介质为但不限于已表达荧光蛋白或进行荧光染色的离体生物组织、经透明化处理的离体生物组织或含荧光小球的琼脂块等。
5.根据权利要求1所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：
所述的显微镜采用宽场荧光显微镜、激光片层扫描显微镜、激光共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜等多种光学成像显微镜。
6.根据权利要求1或者2所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中的三维结构图像是包括单份三维结构图像或者多份连续分布散射介质的三维结构图像的结合。
7.根据权利要求1所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的矩阵幅值归一化处理具体是指：针对每个灰度图像矩阵，将灰度图像矩阵中的各个元素值均除以所有元素值中的最大值后替换原元素值，使得归一化处理后矩阵中的各元素值按0～1分布。
8.根据权利要求1所述的一种光学散射模拟模型的构建方法，其特征在于：
所述步骤(3)中的相位差分布矩阵是指将散射介质的每层散射结构表征为光相位改变量的幅值，并对每层灰度图像矩阵乘以最大相位差，从而将结构图像矩阵转为光因散射结构而导致的相位差分布矩阵。
9.根据权利要求1-8任一所述方法构建获得的模型的应用，其特征在于：所述模型在光学散射模拟与自适应光学矫正模拟中的应用。
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