CN106890105A - 一种阳离子纳米颗粒及制备方法和应用 - Google Patents

一种阳离子纳米颗粒及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阳离子纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：（1）将十八胺溶于有机溶剂中，使其浓度为0.4‑1mg/mL；（2）将PLGA溶于步骤（1）所得溶液中，使其PLGA浓度为10‑40mg/mL；（3）取浓度为0.1‑1%的F68水溶液，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；（4）乳化蒸发处理得阳离子纳米颗粒。该制备方法简单易操作，制备出的产品不包含药物，仅运用纳米粒本身特性实现杀菌抑菌效果，且抗菌作用强，刺激性小，将其制成漱口水，与牙齿生物相容性好，不易出现色素沉着进而使牙齿变色的现象。

Description

一种阳离子纳米颗粒及制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种阳离子纳米颗粒及其制备方法以及在漱口水方向上的应用。
背景技术
口腔生态菌群失调成为近年来认可的口腔常见疾病发生的主要病因之一，尤其是厌氧菌群的繁殖与破坏导致牙周炎等疾病的发生。对于口腔环境的健康维护，漱口水以其方便快捷，接受性强等特点成为许多人选择的热点。洗必泰及李施德林®是目前认可度和使用度最高的漱口水，其活性成分以抗菌作用为主要治疗机制，并取得良好的效果，得到很好的关注和拓展研究，但在临床使用中也不可避免地存在使牙齿变色等副作用及抗菌效力不足的情况，同时，在实际使用过程中，因其含有酒精成分，对口腔黏膜刺激性较强，易引起不适感。
阳离子纳米颗粒是指粒度在1-100nm之间的带有正电荷的粒子，其具有吸附蛋白质的能力，可以产生一定的抗菌效果，同时具有良好的生物相容性，在抗菌方面的应用有一定的研究潜力。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由两种单体即乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、良好的成囊和成膜的性能，无毒，因此，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。
目前在使用纳米粒治疗疾病的研究中，常见的是将纳米粒作为药物载体，起到控制释放等方面的应用，而将纳米颗粒直接作为杀菌抑菌的有效成分来使用的研究尚不多见。
经文献检索，目前也未见有关通过制备阳离子纳米颗粒来消灭和抑制口腔常见致龋菌的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种阳离子纳米颗粒及其制备方法以及在漱口水方向上的应用，可有效解决现有技术中的漱口水抗菌效果差，含刺激性成分以及使牙齿变色的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于有机溶剂中，使其浓度为0.4-1mg/mL，有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、无水乙醇和甲醇中至少一种；
（2）将PLGA溶于步骤（1）所得溶液中，使其PLGA浓度为10-40mg/mL；
（3）取浓度为0.1-1%的F68水溶液，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；其中F68水溶液与步骤（1）中有机溶剂的体积比为10-40：1；
（4）使用真空泵和旋转蒸发装置，在20-60℃条件下对步骤（3）所得乳化溶液进行乳化蒸发处理，处理时间为10-120min，得阳离子纳米颗粒。
进一步地，步骤（1）中有机溶剂为氯仿。
进一步地，步骤（1）中十八胺浓度为0.6mg/mL。
进一步地，步骤（2）中PLGA浓度为20mg/mL。
进一步地，步骤（3）中F68水溶液的浓度为0.5%。
进一步地，步骤（3）中F68水溶液与步骤（1）中有机溶剂的体积比为20：1。
进一步地，步骤（3）中超声处理温度为20-25℃，每次处理时间为5s，处理次数为6次，时间间隔为9s。
本发明提供的一种阳离子纳米颗粒及其制备方法以及在漱口水方向上的应用，具有以下有益效果：制备方法简单易操作，制备出的产品不含药物，仅运用纳米粒本身特性实现杀菌抑菌效果，抗菌作用强，刺激性小，解决了现有技术中的空白纳米粒本身不能直接作为杀菌抑菌的有效成分来使用的问题。
因该产品本身具有很强的抑菌作用，因此，在抑菌方面具有广泛的应用价值，例如可将其制成漱口水，该漱口水与牙齿生物相容性好，不易出现色素沉着进而使牙齿变色的现象。
附图说明
图1为阳离子纳米颗粒形态图。
图2为阳离子纳米颗粒粒径图。
图3为阳离子纳米颗粒电位图。
图4为阳离子纳米颗粒热力学稳定性实验结果图。
图5为阳离子纳米颗粒动力学稳定性实验结果图。
图6为阳离子纳米颗粒对游离菌抑制作用实验结果图；其中，每个对比结果中，从左至右，每根柱子分别代表对照组、浓度为200μg/mL的实验组、浓度为100μg/mL的实验组、浓度为50μg/mL的实验组、浓度为250μg/mL的实验组、浓度为12.5μg/mL的实验组、含0.5%F68水溶液的阴性对照组和不含0.5%F68水溶液的对照组（与阴性对照组不同之处仅为不添加0.5%F68水溶液）。
图7为阳离子纳米颗粒对菌膜形成抑制作用实验结果图。
图8为阳离子纳米颗粒对成熟菌膜抑制作用实验结果图。
图9为阳离子纳米颗粒与细菌作用力实验结果图。
具体实施方式
实施例1
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于氯仿中，使十八胺浓度为0.6mg/mL；
（2）取步骤（1）所得溶液0.5mL，将20mg PLGA溶于该溶液中，搅拌混匀；
（3）取浓度为0.5%的F68水溶液10mL，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，处理温度为25℃，处理6次，时间间隔为9s，每次处理时间为5s，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；
（4）将步骤（3）所得乳化溶液置于40℃下真空旋转蒸发20min去除氯仿
，得阳离子纳米颗粒溶液。
取上述阳离子纳米颗粒溶液0.1mL，用蒸馏水稀释10倍，通过Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)纳米测量仪测定平均粒径，平均粒径为217.7 nm，PDI为0.118。阳离子纳米颗粒形态图和粒径图分别见图1和图2。
取阳离子纳米颗粒溶液1mL，通过纳米测量仪测其平均电位，平均电位为14.7 mv。阳离子纳米颗粒电位图见图3。
实施例2
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于二氯甲烷中，使十八胺浓度为0.8mg/mL；
（2）取步骤（1）所得溶液0.5mL，将20mg PLGA溶于该溶液中，搅拌混匀；
（3）取浓度为0.6%的F68水溶液10mL，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，处理温度为25℃，处理6次，时间间隔为9s，每次处理时间为5s，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；
（4）将步骤（3）所得乳化溶液置于25℃下真空旋转蒸发40min去除氯仿
，得阳离子纳米颗粒溶液。
取上述阳离子纳米颗粒溶液2mL，置于37℃条件下分别培养4h，8h，24h，48h和72h，然后测量各时间点时的粒径大小，进而分析其热力学稳定性，结果见图4；并于相同时间点，取0.1mL上清液，测其在550nm处的透射率，进而分析动力学稳定性，结果见图5。
热力学稳定性可通过粒径的变化来进行分析，从结果中可以看出，以最初（0h）粒径为1，72h的变化在98.42-104.08%范围内，说明阳离子纳米粒的粒径可在37℃条件下保持至少72h，对于变异链球菌有稳定的抑制作用。
动力学稳定性可通过沉降率来分析，由结果可知，8h内，纳米粒基本保持稳定，以0h的透光率为1，24h、48h和72h的透光率分别为128.87%、138.03%和149.22%，表明阳离子纳米粒有着轻微的聚合倾向。
实施例3
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于无水乙醇中，使十八胺浓度为1mg/mL；
（2）取步骤（1）所得溶液0.5mL，将15mg PLGA溶于该溶液中，搅拌混匀；
（3）取浓度为0.2%的F68水溶液15mL，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，处理温度为25℃，处理6次，时间间隔为9s，每次处理时间为5s，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；
（4）将步骤（3）所得乳化溶液置于37℃条件下真空旋转蒸发35min去除氯仿，得阳离子纳米颗粒溶液。
将变异链球菌（UA159）接入BHI液体培养基进行传代培养，待菌株浓度适中，活力较强时，将其加入96孔板（Costar 3599; Corning Inc., NY），再分别加入浓度为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的阳离子纳米颗粒溶液，于37℃条件下培养2h、4h、6h、8h、10h和24h，然后使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham,MA, USA)测量595nm处阳离子纳米颗粒对游离菌的抑制作用。
对照组为菌液中加入250μg/mL氨苄青霉素，阴性对照组为菌液中加入表面活性剂0.5%F68水溶液，结果见图6。
由图6可知，阴性对照组中，细菌的生长几乎没有受到影响，实验组中，阳离子纳米颗粒对细菌的影响呈现浓度相关趋势，当阳离子纳米颗粒浓度为25、50、100和200μg/mL时，对细菌的生长有明显的抑制作用，当浓度为12.5μg/mL时，对细菌的生长没有抑制作用。
实施例4
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于氯仿中，使十八胺浓度为0.4mg/mL；
（2）取步骤（1）所得溶液0.5mL，将25mg PLGA溶于该溶液中，搅拌混匀；
（3）取浓度为0.5%的F68水溶液5mL，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，处理温度为25℃，处理6次，时间间隔为9s，每次处理时间为5s，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；
（4）将步骤（3）所得乳化溶液置于30℃条件下真空旋转蒸发40min去除氯仿，得阳离子纳米颗粒溶液。
将变异链球菌（UA159）接入BHI液体培养基进行传代培养，待菌株浓度适中，活力较强时，将其加入48孔板（Costar 3599; Corning Inc., NY），再分别加入浓度为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的阳离子纳米颗粒溶液，于37℃条件下培养24h，将形成的菌膜转移到离心管中，48孔板使用500μL PBS冲洗两次，保证粘壁细胞全部被转移，菌膜经过涡旋震动后，将其稀释至10-7，然后均匀涂布在BHI琼脂固体培养基平板上，于37℃条件下培养48h，然后计数平板上的菌落形成数量来观测细菌浓度，进而分析阳离子纳米颗粒对菌膜形成的抑制效果。
阴性对照组为菌液中加入表面活性剂0.5%F68水溶液，结果见图7。
由图7可知，阴性对照组中，细菌的生长几乎没有受到影响，实验组中，阳离子纳米颗粒对细菌的影响呈现浓度相关趋势，当阳离子纳米颗粒浓度为50μg/mL时，菌落数量减少33.92%，浓度为100μg/mL时，菌落数量减少94.79%，浓度为200μg/mL时，菌落数量减少99.98%。
实施例5
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于乙酸乙酯中，使十八胺浓度为0.6mg/mL；
（2）取步骤（1）所得溶液0.5mL，将20mg PLGA溶于该溶液中，搅拌混匀；
（3）取浓度为1%的F68水溶液10mL，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，处理温度为20℃，处理6次，时间间隔为9s，每次处理时间为5s，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；
（4）将步骤（3）所得乳化溶液置于20℃条件下真空旋转蒸发40min去除氯仿，得阳离子纳米颗粒溶液。
将BHI液体培养基加入48孔板（Costar 3599; Corning Inc., NY）中，再加入传代培养后的变异链球菌（UA159），于37℃条件下培养24h形成菌膜，然后分别加入浓度为浓度为200μg/mL和100μg/mL的阳离子纳米颗粒溶液，于37℃条件下分别培养24h，48h和72h后将菌膜转移到离心管中，48孔板使用500μL PBS冲洗两次，保证粘壁细胞全部被转移，菌膜经过涡旋震动后，将其稀释至10-6，然后均匀涂布在BHI琼脂固体培养基平板上，于37℃条件下培养48h，然后计数平板上的菌落形成数量来观测细菌浓度，进而分析阳离子纳米颗粒对菌膜形成的抑制效果。
阴性对照组为菌液中加入表面活性剂0.5%F68水溶液，结果见图8。
由图8可知，阴性对照组中，细菌的生长几乎没有受到影响，实验组中，阳离子纳米颗粒对细菌的影响呈现浓度相关趋势，当阳离子纳米颗粒浓度为100μg/mL时，菌落数量减少33.3%，浓度为200μg/mL时，菌落数量减少71.4%。
实施例6
一种阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于丙酮中，使十八胺浓度为1mg/mL；
（2）取步骤（1）所得溶液0.5mL，将30mg PLGA溶于该溶液中，搅拌混匀；
（3）取浓度为0.8%的F68水溶液20mL，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，处理温度为25℃，处理6次，时间间隔为9s，每次处理时间为5s，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；
（4）将步骤（3）所得乳化溶液置于38℃条件下真空旋转蒸发40min去除氯仿，得阳离子纳米颗粒溶液。
将传代后的变异链球菌（UA159），于37℃条件下培养24h，然后在1500r/min下离心15min，再用PBS溶液冲洗两次，接着采用AFM探针悬臂(Ultrasharp, μ-Masch, Tallinn,Estonia)于紫外光下消毒5min，之后在显微操作下，悬臂一半长度于0.01%左旋多聚赖氨酸液滴中浸泡1min，然后在空气中干燥2min，最后再在菌液中浸泡1min，以在悬臂表面形成细菌层。将一滴纳米颗粒滴在盖玻片上，于空气中干燥。通过原子力显微镜(AFM,
SPM9600;Shimadzu, Kyoto, Japan)测量细菌和纳米颗粒之间的作用力，共测量纳米颗粒液滴的5个位置，每个位置重复至少10次，结果见图9。
图9中横坐标表示探针与托盘的相对位置，纵坐标表示作用力的大小。当探针上的细菌和托盘上的纳米粒接近时，会产生相互作用力。A线为0作用力的基准线，R线为探针在各个位置上测到的作用力的大小。从图9中得出，在距零点1400nm处，产生最大作用力184nN。
实验例 阳离子纳米颗粒的抑菌实验
通过实验来检测阳离子纳米颗粒对口腔主要致龋菌即变异链球菌的影响：
实验共分三组，分别观测本发明所述阳离子纳米颗粒对游离菌的影响，对成熟菌膜的影响和对菌膜形成的影响。
在第一组实验中，将游离细菌培养液与阳离子纳米颗粒共同培养一定时间，然后使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)观测。可得到纳米颗粒浓度为50μg/mL的溶液与细菌作用时，前8小时有明显的杀菌抑菌效果。当浓度增加的200μg/mL时，可基本杀灭所有细菌，可得最小灭菌浓度（MBC）为200μg/mL（实施例3）。
在第二组实验中，将尚未形成菌膜的细菌培养液与阳离子纳米颗粒共同培养一定时间，然后将菌液稀释，在BHI琼脂平板培养基上进行涂布，观测细菌形成菌落数来判断抑菌效果。可得纳米颗粒浓度为50μg/mL的溶液与细菌作用时，与对照组相比较，菌落数降低33.92%，浓度为100μg/mL和200μg/mL时，菌落数分别降低94.79%和99.98%（实施例4）。
在第三组实验中，将已经形成菌膜的细菌培养液与阳离子纳米颗粒共同培养一定时间，然后将菌液稀释，在BHI琼脂固体培养基平板上进行涂布，观测细菌形成菌落数来判断抑菌效果。可得纳米颗粒浓度为100μg/mL和200μg/mL时，菌落数分别降低39.3%和71.4%（实施例5）。
通过上述实验，可证明本发明有良好的杀菌和抑菌效果。
本发明制备的阳离子纳米颗粒可制成片剂、胶囊、混悬剂、粉针剂等。
该产品还可以用于制备漱口水，其与牙齿生物相容性好，不易出现色素沉着进而使牙齿变色的现象。

Claims (9)

1.一种阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将十八胺溶于有机溶剂中，使其浓度为0.4-1mg/mL，有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、无水乙醇和甲醇中至少一种；
（2）将PLGA溶于步骤（1）所得溶液中，使其PLGA浓度为10-40mg/mL；
（3）取浓度为0.1-1%的F68水溶液，将其与步骤（2）所得溶液混合，然后进行超声处理，得含有PLGA纳米颗粒的乳化溶液；其中F68水溶液与步骤（1）中有机溶剂的体积比为10-40：1；
（4）使用真空泵和旋转蒸发装置，在20-60℃条件下对步骤（3）所得乳化溶液进行乳化蒸发处理，处理时间为10-120min，得阳离子纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中有机溶剂为氯仿。
3.根据权利要求1所述的阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中十八胺浓度为0.6mg/mL。
4.根据权利要求1所述的阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中PLGA浓度为20mg/mL。
5.根据权利要求1所述的阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中F68水溶液的浓度为0.5%。
6.根据权利要求1所述的阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中F68水溶液与步骤（1）中有机溶剂的体积比为20：1。
7.根据权利要求1所述的阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中超声处理温度为20-25℃，每次处理时间为5s，处理次数为6次，时间间隔为9s。
8.如权利要求1-7任一项方法制备得到的阳离子纳米颗粒。
9.一种如权利要求8所述的阳离子纳米颗粒在制备漱口水中的应用。
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