CN106857238A - 一种基于机械法获取花药的大麦花培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于机械法获取花药的大麦花培方法，所述花培方法的步骤如下：（1）取穗及预处理；（2）对预处理后的大麦穗进行灭菌；（3）在无菌条件下将大麦穗进行机械分割，切碎的大麦穗倒入离心管中密封后置于摇床上震荡；（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中离心获得离体花药；（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织；（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程。本发明通过将大麦穗采取机械切割的方式进行破碎，然后将碎片离心提取到纯净的大麦花药，并通过优化离心介质和采用无菌操作，获取到活力旺盛的大麦花药并进一步花培成功，从而大大提高了花培工作效率。

Description

一种基于机械法获取花药的大麦花培方法

技术领域

本发明涉及一种基于机械法获取花药的大麦花培方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

大麦属禾本科大麦属一年生谷类植物，是一种主要的粮食和饲料作物，有30多个种，只有普通大麦（horderm vulgare L.）一个种具有栽培价值，包括二棱、多棱和中间型大麦3个亚种。作为工农业生产的重要谷类作物，全球现种植大麦6100多万hm²，总产量约1.7亿吨，面积和总产仅次于小麦、水稻、玉米，为第四大谷物。许多发达国家对大麦生产特别重视，这是与其发展啤酒工业和畜牧业，以提高人民生活质量相适应的。世界大麦面积分布依次为欧洲占50%以上，亚洲占20%～25%，美洲10%～15%，非洲占6%左右，大洋洲占5%左右。

大麦栽培历史悠久，是第一个被驯化的谷类作物。据考证，早在新石器时代中期，古羌族（居住在青海）就已在黄河上游开始栽培，距今已有5000年的历史。由于大麦具有早熟、耐旱、耐盐、耐低温冷凉、耐瘠薄等特点，因此栽培非常广泛。椐统计，我国大麦种植面积在20世纪30年代曾达到9570万亩，总产85亿公斤；50年代，面积缩小到5809万亩，总产34.5亿公斤；70年代，面积又扩增到9750万亩，总产99亿公斤，每亩产量101.5公斤；现已缩减到1500万亩，每亩产量266公斤，主要产区集中在长江流域、黄河流域和青藏高原。

近20年来我国啤酒工业发展迅速，现已成为世界第一啤酒生产大国，由于我国优质啤酒专用大麦品种选育研究滞后于啤酒工业的迅速发展，以及啤麦生产方式及设备等因素，我国的啤酒原料因质量问题而主要依赖进口。我国成为啤酒大麦的第一进口国，目前我国进口啤麦量占世界啤麦进口贸易量的一半以上，占我国啤麦需求的60%左右。由于全球啤酒工业的发展和大麦原料的紧缺，再加国外水、旱和病虫害的影响，大麦进口极不稳定，国内企业易受国外价格的冲击，我国啤酒业今后将面临涨价的压力。因此，努力实现啤酒原料国产化，对于促进我国啤酒工业的稳定发展具有十分重要的意义。

大麦籽粒的粗蛋白和可消化纤维均高于玉米，是牛、猪等家畜、家禽的好饲料。欧洲、北美的发达国家和澳大利亚，都把大麦作为牲畜的主要饲料。用大麦喂猪，在育肥期增加饲料中的大麦的比例，可使猪肉脂肪硬度大，熔点高，瘦肉多，肉质好。大麦还可以做青贮饲料，在灌浆期收割切段青储，是奶牛的好饲料。

我国南方各省饲料严重紧缺，每年从北方调入上千万吨玉米与豆粕等原料来弥补缺口，或直接以稻谷替代。在我国饲料工业中，近几年大麦型配合饲料所必需的β-葡聚糖酶等饲料添加剂的研制与生产已取得成功的突破，大麦型配合饲料开始在我国南方进入快速发展阶段。选育优质、高产饲料专用大麦新品种和建立饲麦生产基地等产业化网络，利用南方大片冬闲地、海涂盐碱地大力发展饲麦生产，对于解决我国南方地区饲料的供需矛质，促进该地区畜牧渔业的发展将发挥重大作用。尽管目前我国的大麦生产处于低谷阶段，但是从国内对大麦的巨大需求和充分利用我国有限的土地资源这两个重要的国情分析，我国的大麦生产应该和必将会得到迅速发展，大麦仍然是我国最具有发展潜力的谷物。

大麦新品种选育中应用单倍体技术可以简化和加速育种程序，缩短育种时间5年左右，因而受到国内外育种家的青睐。早在1971年和1973年Clapham就报道首次得到了大麦花药愈伤组织和花粉植株。自此，大麦花药培养技术受到各国学者的普遍重视，花粉植株不仅是遗传研究的良好群体，而且对单倍体育种也有实践意义。现在花药培养集成了杂交育种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容，是大麦育种学发展的趋势之一。

过去几十年的育种改良过程中，我国大麦育种目标从提高产量到提升品质，有了很大的改变。我国大麦花药培养在供体植株生长条件、花药预处理方法、培养基成分和培养条件等进行了一系列的研究，使培养效率有了较大的提高，利用花药培养技术成功育成了品种“单二”和“花30”和一些高产优质新品系。

然而，迄今为止，大麦花药培养的去分化和分化频率仍然较低，加之各基因型之间的差异很大，从而限制了该技术在育种上的应用。因此，进一步提高大麦花药离体培养效率有非常重要的科学价值和实践意义。影响大麦花药培养效果的因索是多种多样的，既包括由植株本身所决定的从基因型差异、花药的发育时期及供体植株的生理状态等内在条件；也包括基本培养基成分、激素及培养温度等外界因素。从花培育种角度考虑，对于优良品种的改良和培育，往往需要从大量的花培后代中筛选优良家系，需要更大规模的培育花培子代，所以改善培养条件、提高花培效率是花培育种的最现实的需求。

现阶段大麦花培育种在花药培养方法上仍存在着工作量大、工作效率低的矛盾，限制了花培技术在大麦育种中的更广泛的应用。如何提高工作效率、加快选择效率、缩短育种周期、创新种质材料、配合其它生物技术的应用，快速获得纯系，充分利用花培技术在基础理论研究和育种应用研究的雄厚基础，成为我们迫切需要解决的问题。多年的实践经验发现，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限性，剪颖抖药法是目前花药分离最普遍的操作方法，然而，剪颖和抖药过程既需要专业组培操作，又需要消耗大量的劳动，成为花培操作的限速步骤。如何快捷分离大麦花药，并且保证分离后大麦花药维持活力且无污染适宜离体培养，是解决花培操作低效的关键。

离心机是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开，或将乳浊液中两种密度不同又互不相溶的液体分开。利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点，有的沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。

发明内容

本发明的目的是针对现有花药离体培养操作方法的专业操作要求高且耗时耗力的缺陷，提供一种提高操作量、工作效率高的基于机械法获取花药的大麦花培方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述花培方法的步骤如下：

（1）取穗及预处理；

（2）对预处理后的大麦穗进行灭菌；

（3）在无菌条件下将大麦穗进行机械分割，切碎的大麦穗倒入离心管中密封后置于摇床上震荡；

（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中离心获得离体花药；

（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织；

（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程。

所述步骤（1）中的取穗以采集主茎上的圆锥花序且其花药中的小孢子处于单核晚期为标准取穗；所述的预处理过程为：先用75%乙醇表面消毒，然后用湿润的纱布包裹整个大麦穗，保持大麦穗湿润，最后放到冰箱中，在5℃下低温预处理2-5天。

所述步骤（2）中的灭菌过程为：预处理后剪下大麦穗，将大麦穗浸泡于75%的酒精中处理3～5min，然后将该大麦穗转移于超净工作台中剥离大麦穗，用消毒过的纱布包裹大麦穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10-12min并间或摇动，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干。

所述步骤（3）中的大麦穗按照3.0-3.4mm/段进行机械分割。

所述步骤（3）中切碎的大麦穗倒入含有60-80ml的17%蔗糖溶液的100毫升离心管中，盖上离心管盖并用保鲜膜将离心管盖子位置紧紧封闭。

所述步骤（3）中密封的离心管从超净工作台中取出后置于摇床上进行300-400rpm震荡8-10min。

所述步骤（4）中的离心机参数设置为：离心机转速10000-12000rpm，离心时间8-10分钟，离心温度15-25℃；所述的离体花药需要放回超净工作台，无菌操作倒入盛有已灭菌的17%蔗糖溶液容器。

所述步骤（5）中的离体花药接种和诱导培养过程为：用灭菌过的网筛勺搅动装有离体花药的蔗糖溶液，使离体花药均匀分散，然后舀出，使得离体花药均匀分散到网筛勺上，控出液滴，将离体花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内，温度为28-29℃、湿度70%左右的环境下暗培养，诱导出愈伤组织。

所述步骤（6）中的分化、继代与移栽过程为：待花药愈伤组织直径达到1.5cm后，转接于分化培养基，在温度28～30℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗苗高达到5cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至10cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。

所述步骤（5）中的网筛勺的孔径为40-48目。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明通过创造性地对大麦花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采用不同大小的离心力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的大麦花药，并通过优化离心介质和采用无菌操作，成功获取到了活力旺盛的大麦花药并进一步花培成功，获得了健壮的花培苗；提高操作量的同时大大提升了花培工作效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

本发明提供的基于机械法获取花药的大麦花培方法的详细技术方案为：

一种基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述花培方法的步骤如下：

（1）取穗及预处理：

以采集主茎上的圆锥花序且其花药中的小孢子处于单核晚期为标准取穗；取回来后先用75%乙醇表面消毒，然后用湿润的纱布包裹整个大麦穗，保持大麦穗湿润，最后放到冰箱中，在5℃下低温预处理2-5天；

（2）对预处理后的大麦穗进行灭菌：

预处理后剪下大麦穗，将大麦穗浸泡于75%的酒精中处理3～5min，然后将该大麦穗转移于超净工作台中剥离大麦穗，用消毒过的纱布包裹大麦穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10-12min并间或摇动，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干；

（3）在无菌条件下将大麦穗进行机械分割，切碎的大麦穗倒入离心管中密封后置于摇床上震荡：

在无菌条件下将大麦穗按照3.0-3.4mm/段进行机械分割，切碎的大麦穗倒入含有60-80ml的17%蔗糖溶液的100毫升离心管中，盖上离心管盖并用保鲜膜将离心管盖子位置紧紧封闭，然后将密封的离心管从超净工作台中取出后置于摇床上进行300-400rpm震荡8-10min；

（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中离心获得离体花药：

将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，离心机参数设置为：离心机转速10000-12000rpm，离心时间8-10分钟，离心温度15-25℃离心，离心完成后将含离体花药的离心管放回超净工作台，将花药无菌操作倒入盛有已灭菌的17%蔗糖溶液容器；

（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织：

用灭菌过的孔径为40-48目的网筛勺搅动装有离体花药的蔗糖溶液，使离体花药均匀分散，然后舀出，使得离体花药均匀分散到网筛勺上，控出液滴，将离体花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内，温度为28-29℃、湿度70%左右的环境下暗培养，诱导出愈伤组织；

（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程：

待花药愈伤组织直径达到1.5cm后，转接于分化培养基，在温度28～30℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗苗高达到5cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至10cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。

实验验证

为说明本发明的基于机械法获取花药的大麦花培方法中所采用的蔗糖等渗液浓度、最适离心力是符合花药分离需求的。现进行以下实验验证以说明本发明的花培方法的创造性和实用性。

实验一 蔗糖等渗液浓度的选择

为使分离用的蔗糖溶液浓度接近大麦花药的渗透压，防止花药吸水膨胀或失水萎焉，维持花药内花粉生命力，我们测试了对花粉细胞等渗的蔗糖溶液浓度，采用不同浓度的蔗糖溶液浸泡分离的花粉，浸泡时间均为5小时，观察花粉细胞的质壁分离现象，结果如下表一。

根据表一实验结果，由于花粉细胞外有细胞壁，无法观察到吸水现象，然而17%浓度的蔗糖溶液是花粉细胞不失水的最大浓度，因此我们推断17%的蔗糖溶液最接近花粉细胞的渗透压，又由于蔗糖对花药无损伤，而且分离后的花药亦需接种到高浓度的蔗糖培养基上诱导培养，因此选择17%浓度的蔗糖溶液作为花药离心的介质溶液，不会造成花粉细胞失水或吸水，能够有效维持花粉细胞的生命力。

实验二 花药离心分离的最适离心力的选择

由于不同的大麦组织器官由于密度大小不同，具有不同的沉降系数；为寻找出能有效分离大麦花药所需的最适离心力，我们将3.0-3.4mm/段机械分割后的碎大麦穗加入17%蔗糖溶液后置于摇床上300-400rpm震荡8-10min，然后采用不同转速的离心力进行离心分离（20℃，8min），观测离心结果，如表二。

由表二可以发现，采用10000-12000rpm转速离心能有效分离出破碎大麦穗中的颖壳和支梗杂质，从大麦穗碎片中离心分离出纯净的大麦花药，对机械分割后的大麦穗碎片10000rpm 8min离心后，能够清晰的发现大麦花药被分离出来。

对比例

为说明本发明提供的基于机械法获取大麦花药的花培方法的创造性，现将本发明获得的大麦花药和常规抖药法分离的大麦花药进行同样的诱导培养，比较二者诱导率差异，结果如表三。

由表三可以发现，本发明提供的技术分离的花药愈伤诱导率与常规分离的花药愈伤诱导率并无显著性差异，因此能够说明，采用本发明分离花药能够较好的维持分离花药的生命力，适用于进一步接种培养之用。将采用本技术路线分离出的大麦花药进行诱导培养出优良的花药愈伤组织，进一步分化培养，能够分化出生长旺盛的花培幼苗。

本发明通过创造性地对大麦花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采用不同大小的离心力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的大麦花药，并通过优化离心介质和采用无菌操作，成功获取到了活力旺盛的大麦花药并进一步花培成功，获得了健壮的花培苗；提高操作量的同时大大提升了花培工作效率。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述花培方法的步骤如下：

（1）取穗及预处理；

（2）对预处理后的大麦穗进行灭菌；

（3）在无菌条件下将大麦穗进行机械分割，切碎的大麦穗倒入离心管中密封后置于摇床上震荡；

（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中离心获得离体花药；

（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织；

（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程。

2.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（1）中的取穗以采集主茎上的圆锥花序且其花药中的小孢子处于单核晚期为标准取穗；所述的预处理过程为：先用75%乙醇表面消毒，然后用湿润的纱布包裹整个大麦穗，保持大麦穗湿润，最后放到冰箱中，在5℃下低温预处理2-5天。

3.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（2）中的灭菌过程为：预处理后剪下大麦穗，将大麦穗浸泡于75%的酒精中处理3～5min，然后将该大麦穗转移于超净工作台中剥离大麦穗，用消毒过的纱布包裹大麦穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10-12min并间或摇动，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干。

4.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（3）中的大麦穗按照3.0-3.4mm/段进行机械分割。

5.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（3）中切碎的大麦穗倒入含有60-80ml的17%蔗糖溶液的100毫升离心管中，盖上离心管盖并用保鲜膜将离心管盖子位置紧紧封闭。

6.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（3）中密封的离心管从超净工作台中取出后置于摇床上进行300-400rpm震荡8-10min。

7.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（4）中的离心机参数设置为：离心机转速10000-12000rpm，离心时间8-10分钟，离心温度15-25℃；所述的离体花药需要放回超净工作台，无菌操作倒入盛有已灭菌的17%蔗糖溶液容器。

8.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（5）中的离体花药接种和诱导培养过程为：用灭菌过的网筛勺搅动装有离体花药的蔗糖溶液，使离体花药均匀分散，然后舀出，使得离体花药均匀分散到网筛勺上，控出液滴，将离体花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内，温度为28-29℃、湿度70%左右的环境下暗培养，诱导出愈伤组织。

9.根据权利要求1所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（6）中的分化、继代与移栽过程为：待花药愈伤组织直径达到1.5cm后，转接于分化培养基，在温度28～30℃、光14h/暗10h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗苗高达到5cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至10cm后移栽至周转箱壮苗，10～15天后移栽入大田。

10.根据权利要求1或8所述的基于机械法获取花药的大麦花培方法，其特征在于：所述步骤（5）中的网筛勺的孔径为40-48目。