CN106841080A - Dna过氧化物模拟酶在检测1,8‑二氨基萘中的应用 - Google Patents
Dna过氧化物模拟酶在检测1,8‑二氨基萘中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于检测技术领域，提出一种DNA过氧化物模拟酶在1,8‑二氨基萘检测中的应用，所述DNA过氧化物模拟酶中的DNA为具有连续G序列的核苷酸。本发明还提出一种应用DNA过氧化物模拟酶进行1,8‑二氨基萘检测的方法。本发明建立了基于DNA过氧化物模拟酶‑双氧水‑ABTS体系检测1,8‑二氨基萘污染物的比色生物传感方法，该比色法具有简单、快速、成本低、样品用量少等优点。为环境体系1,8‑二氨基萘污染物的快速检测提供了一种新的检测方法，这在完善现有1,8‑二氨基萘污染物检测技术方面具有重要意义，同时拓宽了DNA过氧化物模拟酶在分析化学领域中的应用。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种应用DNA模拟酶进行检测的方法。
背景技术
氨基萘类化合物是一类具有“三致”效应的有毒环境污染物，进入环境后可以造成严重的环境污染，已被列为优先监控的环境污染物之一。氨基萘类化合物为重要的化工原料和精细化工中间体，常被用于印染、制药、医药、农药、塑料、橡胶、纺织、陶瓷上釉和油漆等工艺生产过程，这也是导致环境体系中氨基萘类污染物广泛存在的重要原因。环境体系中的氨基萘类污染物具有生物累积性、较强的生物毒性，进入体内的会对生物体造成伤害—经过体内的酶的活化作用可对DNA造成损害，引起DNA突变，表现出较强的致癌、致畸、致突变的作用，如诱发膀胱癌、输尿管癌、肾癌等，对人类的健康危害极大。由于持久性有毒污染物对人体健康和环境的长期影响，目前已经受到各国政府和环境科学家的关注，成为国际环境科学十分热门的研究领域。
传统的氨基萘类污染物检测法主要为仪器分析法，如高效液相色谱法，液相色谱-质谱联用法，气相色谱法，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等等。这些仪器分析方法虽然能够精确、快速地测定出该污染物的含量，但仍存在一些不足之处，如仪器操作相对复杂，需专业技术人员培训；仪器设备昂贵、测试费用高；测试样品需进行前处理，耗时较长；难于实现原位、实时、在线检测；对实际样品检测时灵敏度偏低等。随着电化学技术和DNA生物传感技术的发展，DNA生物传感器作为一种新型的检测技术亦被用于检测芳香胺污染物。Wang[1]等应用天然小牛胸腺DNA修饰的碳糊电极生物传感器，实现了对2-氨基萘、1-氨基蒽、2-氨基蒽、9,10-二氨基菲、1-氨基吡等芳香胺类污染物的检测。Chiti[2]等采用天然DNA和含人工合成的含23个碱基的DNA片段修饰的丝网石墨印刷电极传感器，对-氨基萘、2-氨基蒽、1,2-二氨基蒽醌等化合物进行了检测。Liang等[3]应用发卡状DNA修饰的电极实现了对氨基萘污染物的检测，建立了高灵敏、选择性的氨基萘污染物电化学阻抗检测方法。
然而，采用电化学核酸生物传感法检测氨基萘污染物仍存在一些不足之处，如需对电极表面进行DNA修饰，而修饰过程使检测周期变长，大大降低了检测的效率；同时电极膜材料的性能、膜的稳定性等因素都会影响检测结果的准确性；核酸修饰电极批次之间的差异等也会对测定结果产生影响。到目前为止，尚未有基于DNA过氧化物酶对氨基萘类污染物进行比色法检测的相关研究。因此，开发一种快速、简单、廉价、灵敏检测氨基萘污染物的方法具有重要的意义。
参考文献
1.Wang,J.,Rivas,G.,Luo,D.,Cai,X.,Valera,F.S.and Dontha,N.,1996.DNA-Modified Electrode for the Detection of Aromatic Amines.Anal.Chem.68(24):4365-4369.
2.Chiti,G.,Marrazza,G.and Mascini,M.,2001.Electrochemical DNAbiosensor for environmental monitoring.Anal.Chim.Acta 427(2):155-164.
3.Liang,G.,Li,T.,Li,X.H.,Liu,X.H.,2013.Electrochemical Detection ofthe Amino-Substituted Naphthalene Compounds Based on IntercalativeInteraction with Hairpin DNA by Electrochemical ImpedanceSpectroscopy.Biosens.Bioelectron.48(15),238-243.
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明的目的是提出一种DNA过氧化物模拟酶在1,8-二氨基萘检测中的应用。
本发明的另一目的是提出一种应用DNA过氧化物模拟酶进行1,8-二氨基萘检测的方法。
实现本发明上述目的技术方案为：
DNA过氧化物模拟酶在1,8-二氨基萘检测中的应用，其特征在于，所述DNA过氧化物模拟酶中的DNA为具有连续G序列的核苷酸。
更为具体地，本申请的具体实施方式中采用的DNA粉末为PW17DNA，其核苷酸序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGG。
实际应用中，可使用其它具有连续G序列的DNA序列进行替换，例如:
Tel22DNA:AGGGTTAGGG TTAGGGTTAG GG；
T30695:GGGTGGGTGGGTGGGT；
PS2.M2:GGGTAGGGCGGGTTGGGT；
其中，所述DNA过氧化物模拟酶中DNA的序列为PW17,Tel22,T30695，PS2.M2所示的序列中的一种。
研究发现，DNA过氧化物模拟酶，即G-四联体DNA和hemin分子结合形成的G-四联体/hemin复合物，具有催化活性高、生产成本低、易于制备及贮存、热稳定好等优点，且能够催化双氧水氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)使体系产生颜色变化。基于此，该DNA过氧化物模拟酶被用于比色法分析检测1,8-二氨基萘污染物。
在前期研究中，我们首次发现1,8-二氨基萘污染物会对DNA过氧化物模拟酶、双氧水、ABTS等组成的比色探针体系产生抑制作用，导致体系颜色的降低，且体系颜色强度变化与1,8-二氨基萘污染物浓度变化存在一定关系。基于此，我们建立了一种利用比色法检测1,8-二氨基萘污染物的方法。
一种应用DNA过氧化物模拟酶进行1,8-二氨基萘检测的方法，包括如下步骤：
(1)将DNA过氧化物模拟酶与ABTS溶液混合均匀；
(2)将含1,8-二氨基萘的待测样品用缓冲溶液稀释，然后与H2O2溶液混合均匀；
(3)将步骤(1)所得的混合溶液置于离心管中，取步骤(2)所得的混合溶液快速加入上述离心管，得到比色检测体系，待3-6min后进行紫外-可见吸收信号检测。
其中，所述DNA过氧化物模拟酶通过以下方法制备：
S1：将DNA用缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混匀，并于85-95℃的水浴中处理1-10min，取出，自然冷却，静置于室温下0.1-5h，备用；
S2：取步骤S1配制的DNA溶液加到离心管中，向其中加入Tris-KClO4溶液，孵育0.1-5h后，加入hemin，用漩涡振荡器混匀，放置0.1-10h，得到DNA过氧化物模拟酶。
优选地，所述的DNA过氧化物模拟酶中DNA与hemin的浓度比为1:1.0-1.5。
更优选地，所述比色检测体系中：DNA过氧化物模拟酶的浓度为10-500nM，ABTS浓度为0.1-5mM，H2O2溶液的浓度为0.1-10mM，K+的浓度为1-50mM。
其中，所述比色检测体系的pH值为4-11；所述缓冲溶液由Tris、KClO4、磷酸、柠檬酸、盐酸、氯化钾、KH2PO4、K2HPO4中的二种或三种配制而得。
进一步优选地，所述比色检测体系的pH值为7-8，所述缓冲溶液由Tris、KClO4配制而得。
试验中发现，当所述混和比色检测-体系的pH值为4-11时，可检测到明显紫外-可见吸收信号。当所述混和比色检测-体系的pH值为6.5-8.5，紫外-可见吸收信号较强。
所述的方法，还包括：利用标准梯度浓度的1,8-二氨基萘制备混和比色检测体系，进行吸收信号检测，构建标准曲线，将待测样品的检测值带入计算，对待测样品的1,8-二氨基萘污染物进行定量分析。
其中，用波长422nm处的紫外-可见吸收信号构建标准曲线。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了以一种基于DNA过氧化物模拟酶-双氧水-ABTS体系检测1,8-二氨基萘污染物的比色生物传感方法，该比色法具有简单、快速、成本低、样品用量少等优点。为环境体系1,8-二氨基萘污染物的快速检测提供了一种新的检测方法，这在完善现有1,8-二氨基萘污染物检测技术方面具有重要意义，同时拓宽了DNA过氧化物模拟酶在分析化学领域中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例4中不同体系测定的紫外可见光谱：a含有DNA过氧化物模拟酶、ABTS、H2O2的缓冲溶液体系；b代表含有DNA过氧化物模拟酶、ABTS、H2O2、1,8-二氨基萘的缓冲溶液体系。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。本领域技术人员应当知晓，本发明的范围不仅限于特定的实施方案，在不脱离本发明的精神下可以进行各种修饰和改变。
如未特别说明，具体实施方式中所采用的手段均为本领域常规的技术手段。
实施例1、DNA过氧化物模拟酶制备
将固体DNA粉末(PW17DNA)用20mM Tris-HClO4缓冲溶液(pH＝7.4)溶解，用漩涡振荡器混匀，并于90℃的水浴锅中处理4min，取出，静置自然冷却，取适量上述配制的DNA溶液加到离心管中，向其中加入20mM Tris-KClO4溶液，稀释到500nM，孵育2h后，加入hemin使其在最终得到的DNA过氧化物模拟酶中浓度为600nM，用漩涡振荡器混匀，放置1h，得到浓度为500nM的DNA过氧化物模拟酶。
实施例2
配制pH＝7.4的20mM的Tris-KClO4缓冲溶液，用上述缓冲溶液分别配制含200nMDNA过氧化物模拟酶的溶液，记为A液；4mM ABTS的溶液，记为B液；10mM H2O2溶液，记为C液；4μM 1,8-二氨基萘的溶液，记为D液。
1、取上述pH＝7.4的20mM的Tris-KClO4缓冲溶液250μL加入离心管中，然后分别取A液250μL、B液250μL加入到上述离心管中，用漩涡振荡器混匀；取C液250μL快速滴加于上述混合体系中，用漩涡振荡器震荡4min，然后转移至检测池中，待5min时测定紫外-可见吸收强度(图1a线)。
2、取上述A液250μL、B液250μL、D液250μL加入到上述离心管中，用漩涡振荡器混匀；取C液250μL快速滴加于上述混合体系中，用漩涡振荡器震荡4min，然后转移至检测池中，待5min时测定紫外-可见吸收强度(图1b线)。
从图1中可以看出，当测定体系中存在DNA过氧化物模拟酶、ABTS、双氧水时，在422nm处产生较强的吸收信号(图1a线)，说明DNA过氧化物模拟酶可以有效催化ABTS、双氧水体系产生颜色变化；当含有1,8-二氨基萘存在时，在422nm处紫外-可见吸收信号显著下降(b线)，说明1,8-二氨基萘可以抑制上述反应体系，从而可以根据422nm处紫外-可见吸收信号的变化实现对1,8-二氨基萘的检测。
实施例3
设定不同pH值的混和体系，按照和实施例2相同的方法进行比色法检测。其中，缓冲溶液分别为pH值为4.49磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液，pH值为6.8Tris-HCl-KCl缓冲液，pH值为8.8Tris-KCl缓冲液、pH值为7.4的Tris-KClO4缓冲液。
在422nm紫外-可见吸收波长处，pH值为4.49-8.8时，混和体系可检测到明显紫外-可见吸收信号。
pH值为6.8和7.4的混和体系的紫外-可见吸收信号较强。pH值为7.4的混和体系紫外-可见吸收信号最强。
实施例4
1、将实施例1制备的DNA过氧化物模拟酶与ABTS溶液混合均匀；
2、将1,8-二氨基萘用Tris-KClO4缓冲溶液稀释后，与H2O2溶液混合均匀；
3、将步骤1所得的混合溶液置于2ml离心管中，取步骤2混合溶液加入上述离心管，孵育5min，然后进行比色信号检测。
其中，为了验证不同浓度1,8-二氨基萘对比色信号的影响，通过改变加入1,8-二氨基萘溶液体积使混和体系中1,8-二氨基萘浓度分别为0nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L。所得混合发光体系中：DNA过氧化物酶的浓度为50nM，K+的浓度为20mM，H2O2的浓度为2mM，ABTS的浓度为1mM。
不同混合比色检测体系在422nm处的紫外-可见吸收光强度，见表1。
表1与不同浓度1,8-二氨基萘作用后紫外-可见吸收光强度
上述试验结果说明本方法检出限低，检测范围广，可以快速检测，具有很高的实用价值。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京农业质量标准与检测技术研究中心
<120> DNA过氧化物模拟酶在检测1,8-二氨基萘中的应用
<130> KHP171111861.7TQ
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<213> 人工序列
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<400> 4
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Claims (10)
1.DNA过氧化物模拟酶在1,8-二氨基萘检测中的应用，其特征在于，所述DNA过氧化物模拟酶中的DNA为具有连续G序列的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA过氧化物模拟酶中DNA的序列为PW17,Tel22,T30695，PS2.M2所示的序列中的一种。
3.一种应用DNA过氧化物模拟酶进行1,8-二氨基萘检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将DNA过氧化物模拟酶与ABTS溶液混合均匀；
(2)将含1,8-二氨基萘的待测样品用缓冲溶液稀释，然后与H2O2溶液混合均匀；
(3)将步骤(1)所得的混合溶液置于离心管中，取步骤(2)所得的混合溶液快速加入上述离心管，得到比色检测体系，待3-6min后进行紫外-可见吸收信号检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNA过氧化物模拟酶通过以下方法制备：
S1：将DNA用缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混匀，并于85-95℃的水浴中处理1-10min，取出，自然冷却，静置于室温下0.1-5h，备用；
S2：取步骤S1配制的DNA溶液加到离心管中，向其中加入Tris-KClO4溶液，孵育0.1-5h后，加入hemin，用漩涡振荡器混匀，放置0.1-10h，得到DNA过氧化物模拟酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的DNA过氧化物模拟酶中DNA与hemin的浓度比为1：1.0-1.5。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述比色检测体系中：DNA过氧化物模拟酶的浓度为10-500nM，ABTS浓度为0.1-5mM，H2O2溶液的浓度为0.1-10mM，K+的浓度为1-50mM。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述比色检测体系的pH值为4-11；所述缓冲溶液由Tris、KClO4、磷酸、柠檬酸、盐酸、氯化钾、KH2PO4，K2HPO4中的二种或三种配制而得。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述比色检测体系的pH值为7-8，所述缓冲溶液由Tris、KClO4配制而得。
9.根据权利要求3～8任意一项所述的方法，其特征在于，利用标准梯度浓度的1,8-二氨基萘制备混和比色检测体系，进行紫外-可见吸收信号检测，构建标准曲线，将待测样品的检测值带入计算，对待测样品的1,8-二氨基萘污染物进行定量分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用波长422nm处的紫外-可见吸收信号构建标准曲线。
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