CN106834443A - 一种藏羚羊初生性别及比例的鉴定方法 - Google Patents

一种藏羚羊初生性别及比例的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种藏羚羊初生性别的鉴定方法，它包括如下步骤：(1)搜集藏羚羊的胎盘；(2)从胎盘中抽提DNA；(3)以抽提的DNA为模板，用牛科动物性别鉴定通用引物对扩增目标DNA；(4)对扩增产物进行检测。本发明还提供了藏羚羊初生性别比例的鉴定方法。本发明方法简单、易操作，对国家保护动物无伤害，可准确鉴定藏羚羊初生性别及比例。

Description

一种藏羚羊初生性别及比例的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种藏羚羊初生性别及比例的鉴定方法，属于生物技术领域。
背景技术
性别比例(sex ratio)即种群中雄性与雌性的比例，是动物种群生态学的重要研究指标，是判定种群稳定性的重要因素之一。根据动物种群年龄结构的变化，种群性别可被分为多个阶段。迄今为止的研究中，人们关注最多的为种群的成年性比(adult sex ratio，ASR)，而影响种群成年性别比例的因素有很多，母体对于初生性比的调节和控制也是其中之一。对种群个体性别的鉴定是研究性别比例的前提。
传统的性别鉴定是基于对动物第二性征的分辨而确定性别，这种方法对于鉴定运动能力较弱、性别表征明显或者家养和半家养动物的性别是简便易行的，但是对于野生的警觉性较高、运动能力较强、性别表征不明显或者幼年时性别表征不明显的动物，显然无法准确判定其性别。
藏羚羊(Pantholopshodgsonii)为我国一级保护动物，隶属偶蹄目牛科山羊亚科羚羊属。藏羚羊是青藏高原特有的物种，在长期对高原环境的适应进化中，很好地适应了青藏高原独特的恶劣气候环境，并成为青藏高原典型的代表动物和自然生态系统的重要指标。多年来，对藏羚羊的研究主要集中在数量与分布、社群特征、迁徙和产仔、遗传多样性、行为时间分配及活动节律、青藏铁路和青藏公路对其迁徙的影响等方面，但由于其栖息地海拔高、环境条件恶劣、警觉性高，同时缺乏较好的研究材料等原因，对藏羚羊性别比例的研究甚少，且都是肉眼观察判定其性别，误差较大，尤其是对其初生性别比例的研究，一直处于空白阶段。
有研究表明，藏羚羊种群结构中，雌性明显多于雄性，但其中的调节方式及机制还鲜有研究，在雌性藏羚羊怀孕期间对胎儿性别是否有选择作用或选择作用的强弱也处于未知状态。藏羚羊新出生小羊羔的性别组成是唯一可以获得的反映母羊怀孕期间是否有性别偏向生育的指标，但新出生的小羊羔性别仅靠肉眼是无法辨别的，因此，利用其他辅助手段的性别鉴定方法是研究藏羚羊初生性别比例的不二选择。
随着胚胎学、细胞生物学的研究发展，一些新的对培养的细胞或者胚胎进行染色体型鉴定和性别鉴定的方法逐渐发展起来，如细胞遗传学方法、免疫学方法、生物化学方法以及分子生物学方法等。现有的研究方法一般都需要活的动物细胞或组织，也即需要对研究对象进行损伤性取样，而自然界很多野生动物均为保护动物，这也就限制了其在野生动物性别鉴定中的广泛应用。
胎盘，又称胎衣，是连接发育中的胎儿与母体，并进行胎儿与母体间营养吸收、废物排泄、气体交换、抵抗感染以及分泌激素的器官。通常，对人和哺乳动物胎盘的研究主要集中于医学上的病理学、激素水平等基础代谢以及药学作用等方面，研究焦点汇集于母体信息的反馈。迄今为止，利用胎盘对动物新生胎儿进行性别鉴定等的研究还处于空白阶段。
发明内容
本发明提供了一种藏羚羊初生性别的鉴定方法，它包括如下步骤：
(1)搜集藏羚羊的胎盘；
(2)从胎盘中抽提DNA；
(3)以抽提的DNA为模板，用牛科动物性别鉴定通用引物对扩增目标DNA；
(4)对扩增产物进行检测。
进一步的，上述藏羚羊为野生藏羚羊。
牛科动物性别鉴定通用引物对可以直接引用各种文献中报道的引物对。
优选地，上述引物对为KY1/KY2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1核苷酸序列为：5’-GCCCAGCAGCCCTTCCAG-3’；
SEQ ID NO.2核苷酸序列为：5’-TGGCCAAGCTTCCAGAGGCA-3’。
进一步优选地，对扩增产物进行检测是指用琼脂糖凝胶电泳检测目标产物，然后进行凝胶成像，若有两条长度分别约为220bp和180bp的条带，为雌性，若只有一条长度约为180bp的条带，为雄性。
优选地，上述引物对为SE47/SE48，其核酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.3核苷酸序列为：5’-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3’；
SEQ ID NO.4核苷酸序列为：5’-CCCGCTTGGCTTGTCTGTTGC-3’。
进一步优选地，对扩增产物进行检测是指用琼脂糖凝胶电泳检测目标产物，然后进行凝胶成像，若有两条长度分别约为280bp和220bp的条带，为雌性，若只有一条长度约为220bp的条带，为雄性。
优选地，上述引物对为Y1/Y2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：
SEQ ID NO.5核苷酸序列为：5’-GGATCCGAGACACAGAACAGG-3’；
SEQ ID NO.6核苷酸序列为：5’-GCTAATCCATCCATCCTATAG-3’。
进一步优选地，对扩增产物进行检测是指用琼脂糖凝胶电泳检测目标产物，然后进行凝胶成像，若无条带，为雌性，若有一条长度约为300bp的条带，为雄性。
优选地，扩增反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性1min，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
本发明还提供了一种藏羚羊初生性别比例的鉴定方法，它是采用上述鉴定方法鉴定性别，再计算性别比例即可。
其中，上述胎盘数量为大于或等于2的整数，通常应大于100，且数字越大越能准确地反应种群的性别比例。但考虑到取样成本，数字也不宜过大。
本发明中所取的胎盘数量，是对应藏羚羊的个体数量，不需要保证是完整的胎盘才计数。例如，一个并不完整的胎盘，同样可以计为数量1。当然，如果在野外较为接近的地区拾取的两个或多个不完整的胎盘，需要通过肉眼、检测等手段先确定是否为同一胎盘的不同部位，该手段采用公知技术即可。
本发明以藏羚羊胎盘为研究对象，采用PCR研究方法，通过鉴别各胎盘所对应胎儿(子代)的性别，能很好地鉴定藏羚羊的初生性别比例，为后续研究藏羚羊种群性别组成变化及种群发展趋势等提供了研究基础及判断依据。本发明方法克服了以往用肉眼不能鉴别初生藏羚羊性别的缺陷，且不伤害国家保护动物，检测方法简便，准确，为藏羚羊性别的初生性别及比例的鉴定提供了一种巧妙且实用的方法。
附图说明
图1藏羚羊已知性别个体性别鉴定电泳图，M：雄性，F：雌性。
具体实施方式
实施例1藏羚羊性别的鉴定
1研究材料
已知性别的雌性样品为历年收集的难产死亡雌性样品，雄性样品为羌塘自然保护区森林公安局收缴的盗猎雄性羊头上取下的少量皮子。藏羚羊胎盘为2014年6月25日至7月3日期间于可可西里自然保护区卓乃湖藏羚羊产羔地及新疆阿尔金自然保护区兔子湖产羔地搜集得到，共收集到148份藏羚羊胎盘样品，去除表层可能污染的组织，取内部纯净组织，无水乙醇固定后带回实验室备用。
2研究方法
2.1基因组DNA抽提
采用氯仿异戊醇法抽提基因组DNA。
2.2引物合成及PCR扩增
藏羚羊性别鉴定引物参照文献中已有的牛科动物性别鉴定通用引物KY1/KY2、SE47/SE48和Y1/Y2，各引物序列及退火温度等信息见表1。扩增程序为95℃预变性10min；95℃变性1min，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。实验样品扩增前，先用往年收集的已知性别藏羚羊皮张样品检验各引物用于性别鉴定的准确性，确定完全无误后再用于实验样品的性别鉴定。
表1引物序列及相关信息
2.3琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳电压为60～80V，之后进行凝胶成像。
2.4数据分析
藏羚羊初生性比为雄性数量与雌性数量的比，并使用SPSS 19.0软件计算差异显著性。
3试验结果
3.1引物检验结果
用已知性别的雌雄样品对3对引物进行验证，结果如图1所示：
对于KY1/KY2引物，雄性样品扩增出两条长度分别约为220bp和180bp的扩增产物，雌性样品扩增出220bp左右的扩增产物；
对于SE47/SE48引物，雄性样品扩增出两条长度约280bp和220bp的DNA产物，雌性样品扩增出长度约280bp的DNA产物；
对于Y1/Y2引物，雄性样品扩增出300bp左右的扩增产物，雌性样品无扩增产物。
上述结果与参考文献中其他牛科动物扩增片段相近，且3对引物所检验出的雌雄个体结果一致，表明用这3对引物对藏羚羊个体进行性别鉴定的结果是可信的。
3.2藏羚羊初生性别比例
利用KY1/KY2、SE47/SE48、Y1/Y2三对引物，分别对藏羚羊胎盘基因组DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测后对比各引物扩增结果得出：148份样品共有雌性76头，雄性72头，雌雄性别比(♀：)为1∶1.06(n＝148，χ2＝0.108，P＝0.742)，差异无统计学意义，藏羚羊的出生性别比例未明显偏离理论值1∶1。
综上，本发明提供了一种简便、准确地鉴定藏羚羊初生性别及性别比例的方法。

Claims (9)

1.一种藏羚羊性别的鉴定方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)搜集藏羚羊的胎盘；
(2)从胎盘中抽提DNA；
(3)以抽提的DNA为模板，用牛科动物性别鉴定通用引物对扩增目标DNA；
(4)对扩增产物进行检测。
2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述藏羚羊为野生藏羚羊。
3.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；进一步地，对扩增产物进行检测是指用琼脂糖凝胶电泳检测目标产物，凝胶成像，若有两条长度分别约为220bp和180bp的条带，为雌性，若只有一条长度约为180bp的条带，为雄性。
4.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；进一步地，对扩增产物进行检测是指用琼脂糖凝胶电泳检测目标产物，凝胶成像，若有两条长度分别约为280bp和220bp的条带，为雌性，若只有一条长度约为220bp的条带，为雄性。
5.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；进一步地，对扩增产物进行检测是指用琼脂糖凝胶电泳检测目标产物，凝胶成像，若无条带，为雌性，若有一条长度约为300bp的条带，为雄性。
6.如权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，扩增反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性1min，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
7.一种藏羚羊初生性别比例的鉴定方法，其特征在于，它是采用权利要求1～6任意一项所述鉴定方法鉴定性别，再计算性别比例即可。
8.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述胎盘数量为大于或等于2的整数。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：胎盘数量大于100。
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