CN106804153B - 不同外源调节物质对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法 - Google Patents
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Abstract
不同外源调节物质对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法：配制Pro、GB溶液各6种为CK、T1～T5、T1*～T5*。(2)(10±1)℃用T1～T5、T1*～T5*溶液浸种、培养的种子作为试验处理；(25±1)或(10±1)℃用CK溶液浸种、培养的种子作为CK(+)或(‑)处理，测定萌发性状。(3)(10±1)℃用T1～T5、T1*～T5*溶液浸种、培养的幼苗作为试验处理；(25±1)或(10±1)℃用CK溶液浸种、培养的幼苗作为CK(+)或(‑)处理，测定幼苗性状。(3)新定义各性状的外源Pro或GB低温缓解指数，综合评价外源Pro或GB对玉米的综合低温缓解效果，为玉米制定安全可靠的低温冷害预防、抵御措施提供应用基础。
Description
技术领域
本发明属于农业技术应用领域，具体涉及一种不同外源调节物质对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法。
技术背景
低温冷害是农业可持续稳定发展最为重要的自然灾害之一，其具有大尺度性、综合性及地区差异性等特点。据统计，严重灾害年可使我国粮食减产100亿Kg左右。玉米是一种起源于热带、亚热带的喜温作物，萌发期和苗期对低温十分敏感。萌发期，遇到10℃以下低温时，玉米种子的发芽势、发芽率、种子活力明显降低；遇到5℃以下低温时玉米种子不能发芽，甚至引发烂种。苗期，遇到10℃以下低温时玉米幼苗生长明显受到抑制，生理生化代谢紊乱；6～8℃时幼苗停止生长；温度更低时细胞和组织产生不可逆的伤害，幼苗死亡。在中国北方，特别是东北地区，每年因低温冷害而造成这一区域春玉米减产幅度在15％以上。因而如何缓解玉米种子及幼苗对低温胁迫的伤害，进而提高萌发期和苗期玉米的耐寒性对保障玉米安全生产具有重要意义。
脯氨酸(Proline,Pro)是一种可溶性小分子有机物，是植物蛋白质组分之一，其游离状态广泛存在于植物体内。而甜菜碱(Glycine betaine,GB)是一种烷基烃类含氮化合物，属于甘氨酸的季铵衍生物，其广泛存在于动植物和微生物体内。当植物受到逆境如低温、盐渍、干旱等胁迫时，Pro或GB可作为渗透调节物质参与植物细胞的渗透调节、稳定膜和蛋白等亚细胞结构及清除活性氧，保护细胞抵御逆境胁迫的不利影响。
马文广等报道了外源Pro浸种能显著促进烟草种子发芽，提高了低温逆境下幼苗根长、苗高、幼苗干鲜重及SOD、POD、CAT和APX活性，10mg/L Pro综合效果较好，可作为提高烟草种子及幼苗抗寒性的处理方法。梁小红等报道了外源GB能够有效缓解低温胁迫下结缕草叶绿素含量的下降，减少电解质渗透率和丙二醛含量的升高，显著提高SOD、POD、CAT和APX的活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量，外施100mmol/L GB对提高结缕草的耐低温能力的效果最为显著。
截止目前，关于外源Pro或GB对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗生理生化特性的影响罕见报道，更不清楚外源Pro或GB对玉米种子萌发及幼苗综合低温缓解效果。玉米作为中国第一大粮食作物，在农业生产中，制定安全可靠的低温冷害预防及抵御措施，提高玉米耐寒性对保障粮食安全具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种不同外源调节物质对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法。本方法能有效提高萌发期和苗期玉米耐寒性，为玉米生长期制定安全可靠的低温冷害预防及抵御措施提供参考。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种不同外源调节物质对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法，包括材料收集、配制Pro或GB处理液、种子精选及消毒、浸种、低温发芽试验、幼苗低温试验、测定项目与测定方法、结果分析；具体步骤如下：
(1)材料收集：三份寒敏感自交系H105W、K22和B68；
(2)配制Pro或GB处理液：双蒸水配制6种不同浓度Pro溶液分别为：T1(200umol.L-1)；T2(400umol.L-1)；T3(600umol.L-1)；T4(800umol.L-1)；T5(1000umol.L-1)；CK(0umol.L-1，即双蒸水)；或双蒸水配制6种不同浓度GB溶液分别为：T1*(10umol.L-1)；T2*(20umol.L-1)；T3*(30umol.L-1)；T4*(40umol.L-1)；T5*(50umol.L-1)；CK(0umol.L-1，即双蒸水)；
(3)种子精选及消毒：从步骤(1)中精选饱满、均匀一致、无破损的种子，先用体积百分比为0.5％的NaClO溶液消毒10min，然后用双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，得3份寒敏感玉米自交系消毒种子；
(4)浸种：常温(20℃)下将步骤(3)所得到的消毒种子分别浸泡于步骤(2)配制的各溶液中24h；
(5)低温发芽试验：
(5.1)发芽盒用体积百分比为0.5％的NaClO溶液消毒10min后用双蒸水冲洗3次，发芽盒内铺入双层灭菌滤纸做发芽床；
(5.2)将步骤(4)所得的种子各30粒，分别置于消毒发芽盒中，然后分别加入6种相应浓度Pro或GB溶液；
(5.3)试验处理组为T1～T5和T1*～T5*溶液培养的种子，将种子先置于10±1℃低温气候培养箱中暗培养7d后，再转置于25±1℃气候培养箱中继续暗培养7d；对照处理组为CK溶液中培养的种子，其中将种子置于25±1℃暗培养7d的种子作为正向对照处理CK(+)，将种子置于10±1℃和25±1℃暗培养各7d的种子作为负向对照处理CK(-)；所有试验处理下气候培养箱相对湿度60％～80％，培养期间每隔2d补一次相应浓度溶液各15mL；
(5.4)试验设3次重复，待T1～T5、T1*～T5*、CK(-)和CK(+)处理的种子暗培养第10d和4d统计发芽势，第14d和7d统计发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重；
(6)幼苗低温试验：
(6.1)双蒸水与灭菌蛭石按1mL：5g比例混合均匀后，将步骤(4)所得的种子各30粒分别播种于含灭菌蛭石的营养钵中，在昼/夜(25±1)/(20±1)℃的气候培养箱中培养；
(6.2)待CK溶液浸种的种子长至三叶一心期时，用双蒸水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，然后将各幼苗置于300mL、相应浓度的Pro或GB溶液中；
(6.3)试验处理组为T1～T5和T1*～T5*溶液培养的相应幼苗，将幼苗置于昼/夜温度为(10±1)/(6±1)℃的气候培养箱中继续培养7d；对照处理组为CK溶液中培养的相应幼苗，其中将幼苗置于昼/夜温度为(25±1)/(20±1)℃的气候培养箱中培养的幼苗作为正向对照处理CK(+)，将幼苗置于昼/夜温度为(10±1)/(6±1)℃的气候培养箱中培养的幼苗作为负向对照处理CK(-)；幼苗培养期间，每天光照12h，光照强度600μmol/(s·m2)，相对湿度60％～80％；
(6.4)试验设3次重复，待T1～T5、T1*～T5*、CK(-)和CK(+)处理后的玉米幼苗叶片的各生理生化性状，即相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性、CAT活性；
(7)测定项目与方法：
(7.1)萌发种子性状测定：分别测定步骤(5.4)中各试验处理下的玉米种子发芽势(Germinationpotential；GP)＝规定时间内发芽种子数/供试种子数*100(％)，发芽率(Germination rate；GR)＝发芽种子数/供试种子数*100(％)，胚芽长(Plumule length；PL)＝胚芽基部到胚芽顶部的长度，胚根长(Radicallength；RL)＝最长胚根长度，胚芽鲜重(Shoot fresh weight；SFW)和胚根鲜重(Root fresh weight；RFW)；
(7.2)幼苗叶片生理生化性状测定：测定步骤(6.4)中所述的幼苗叶片的各生理生化性状；包括有第3片叶片的相对电导率(Relative conductivity；RC)、丙二醛含量(Malondialdehyde content；MDA)、脯氨酸含量(Proline content；Pro)、可溶性糖含量(Soluble sugar content；SS)、超氧化物岐化酶活性(Superoxide dismutase activity；SOD)、过氧化物酶活性(Peroxidase activity；POD)及过氧化氢酶活性(Catalaseactivity；CAT)；
(7.3)各性状的外源调节物质低温缓解指数：为方便评价外源Pro或GB对低温胁迫的缓解效果，本试验根据低温胁迫下不同浓度外源Pro或GB处理下的各测定性状值，新定义了各性状的外源Pro或GB低温缓解指数(Ease index，EI)，其公式为：
式中：EIiTn为第i个性状在第Tn种浓度下的外源调节物质低温缓解指数；XTn为第Tn种浓度处理下的相应性状测定值；XCK(+)为正向对照CK(+)处理下的测定值；XCK(-)为负向对照CK(-)处理下的测定值；若相应性状与耐寒性呈正相关，则采用(1)式计算，反之，则用(2)式计算；EI为正值表示相应浓度的外源Pro或GB对低温胁迫起正向缓解作用，EI为负值表示相应浓度外源Pro或GB对低温胁迫起负向缓解作用；
(7.4)不同外源调节物质低温缓解综合评价：以各测定性状的外源Pro或GB低温缓解指数为低温缓解评价指标，采用隶属函数法综合评价外源Pro或GB的低温缓解效果，其公式为：
式中：UiTn为第i个性状在第Tn种浓度下的外源Pro或GB低温缓解隶属值，EIiTn为第i个性状在第Tn种浓度下的外源调节物质低温缓解指数，EImax为第i个性状在n种浓度下的最大外源调节物质低温缓解指数，EImin为第i个性状在n种浓度下的最小外源调节物质低温缓解指数。若所测EI与耐寒性呈正相关，则采用(3)式计算，反之，则用(4)式计算，累加各浓度外源Pro或GB的EI隶属值，并求出均值后进行比较，均值越大，外源Pro或GB的低温缓解效果越大；
(8)结果分析：所有试验数据均采用Microsoft Excel2013软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS19.0软件对数据进行Duncan多重比较方差分析。
本发明以3份寒敏感玉米自交系为试材，萌发期和苗期在10℃低温胁迫下，研究了低温胁迫对玉米种子6个萌发性状及幼苗7个生理生化性状的影响；添加6种不同浓度外源Pro或GB后，研究了不同浓度外源Pro或GB低温胁迫对玉米种子萌发和幼苗叶片生理生化特性的影响，及萌发期和苗期外源Pro和GB对玉米低温缓解的原因；在此基础上，根据各萌发及幼苗相关性状，新定义了单个性状的外源Pro或GB低温缓解指数EI，并以EI作为外源Pro或GB的综合低温缓解指标，采用隶属函数法科学、客观、综合评价了不同生育时期外源Pro或GB的综合低温缓解效果，比较了外源Pro与GB对玉米种子萌发及幼苗的综合低温缓解优劣。
本发明提供的方法操作简便易行，重复性好，结果客观可靠，不仅能全面揭示萌发期和苗期外源Pro或GB对玉米低温缓解的原因，而且在不同生育时期，分别客观、综合评价了不同浓度外源Pro或GB的低温缓解效果，并能直观比较不同外源Pro与GB对玉米萌发期和苗期的低温缓解效果优劣，为萌发期和苗期提高玉米耐寒性奠定理论基础，为玉米制定安全可靠的低温冷害预防及抵御措施提供技术参考，具有很高的应用价值。
附图说明
图1萌发期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米种子发芽势的影响；
图2萌发期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米种子发芽率的影响；
图3萌发期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米种子胚芽长的影响；
图4萌发期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米种子胚根长的影响；
图5萌发期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米种子胚芽鲜重的影响；
图6萌发期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米种子胚根鲜重的影响；
图7苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片相对电导率的影响；
图8苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片丙二醛含量的影响；
图9苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片脯氨酸含量的影响；
图10苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片可溶性糖含量的影响；
图11苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片SOD活性的影响；
图12苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片POD活性的影响；
图13苗期低温胁迫下不同外源调节物质对玉米幼苗叶片CAT活性的影响。
具体实施方法
本发明下述实施例中所用方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材、试剂。
一种不同外源调节物质对玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法，按以下步骤进行：
1.材料收集：三份寒敏感自交系H105W、K22和B68。
2.配制Pro或GB处理液：用双蒸水各配制6种不同浓度Pro和GB处理液分别为：T1(200umol.L-1)；T2(400umol.L-1)；T3(600umol.L-1)；T4(800umol.L-1)；T5(1000umol.L-1)；CK(0umol.L-1)和T1*(10umol.L-1)；T2*(20umol.L-1)；T3*(30umol.L-1)；T4*(40umol.L-1)；T5*(50umol.L-1)；CK((0umol.L-1)，备用。
3.种子精选及消毒：精选饱满、均匀一致、无破损的种子，先用体积百分比为0.5％的NaClO溶液消毒10min，然后用双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，备用。
4.浸种：常温(20℃)下将消毒种子分别浸泡于相应浓度Pro或GB处理液中24h。
5.低温发芽试验：将不同浓度外源Pro或GB浸种的种子各30粒，分别置于消毒发芽盒中，然后分别加入相应浓度Pro或GB处理液。试验处理组为T1～T5和T1*～T5*溶液培养的种子，将种子先置于(10±1)℃低温气候培养箱中暗培养7d后，再转置于(25±1)℃气候培养箱中继续暗培养7d。对照处理组为CK溶液中培养的种子，其中将种子置于(25±1)℃暗培养7d的种子作为正向对照处理CK(+)，将种子置于(10±1)和(25±1)℃暗培养各7d的种子作为负向对照处理CK(-)。所有试验处理下气候培养箱相对湿度60％～80％，培养期间每隔2d补一次相应浓度溶液各15mL，待T1～T5、T1*～T5*、CK(-)和CK(+)处理的种子暗培养第10d和4d统计发芽势，第14d和7d统计发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重。试验设3次重复。
6.幼苗低温试验：将不同浓度外源Pro或GB浸种的种子各30粒分别播种于含灭菌蛭石的营养钵中，在昼/夜(25±1)/(20±1)℃的气候培养箱中培养，待CK溶液浸种的种子长至三叶一心期时，用双蒸水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，然后将各幼苗置于相应浓度的Pro或GB溶液(300mL)中。试验处理组为T1～T5和T1*～T5*溶液培养的相应幼苗，将幼苗置于昼/夜温度为(10±1)℃/(6±1)℃的气候培养箱中继续培养7d。对照处理组为CK溶液中培养的相应幼苗，其中将幼苗置于昼/夜温度为(25±1)/(20±1)℃的气候培养箱中培养的幼苗作为正向对照处理CK(+)，将幼苗置于昼/夜温度为(10±1)/(6±1)℃的气候培养箱中培养的幼苗作为负向对照处理CK(-)。幼苗培养期间，每天光照12h,光照强度600μmol/(s·m2)，相对湿度60％～80％。试验设3次重复，每一试验处理后测定幼苗叶片的各生理生化指标。
7.实验结果：
7.1低温胁迫下外源Pro或GB对玉米种子萌发的影响
由图1、2、3、4、5、6可知：CK(-)低温胁迫处理明显抑制玉米种子萌发，与CK(+)常温处理相比，CK(-)处理下，3份玉米的发芽势、发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重和胚根鲜重分别降低了76.44％、63.08％、68.09％、71.91％、54.06％和83.20％。低温胁迫下添加外源Pro或GB能明显促进玉米种子萌发，一般而言，适当低浓度外源Pro或GB促进玉米种子萌发程度较大，而高浓度外源Pro或GB促进种子萌发程度较小，且不同浓度外源Pro或GB对各萌发性状的影响程度不同，说明外源Pro或GB可显著缓解低温对玉米种子萌发的伤害。
7.2低温胁迫外源Pro或GB对玉米幼苗的影响
由图7、8、9、10、11、12、13可知：CK(-)低温胁迫处理下，玉米幼苗明显受到伤害，玉米幼苗叶片的7个生理生化性状都明显升高，分别是CK(+)常温处理的5.83、3.19、2.00、1.93、4.72、2.84和3.06倍。低温胁迫下添加外源Pro或GB可明显降低玉米叶片的相对电导率和丙二醛含量，可明显升高玉米叶片的脯氨酸含量、可溶性糖含量及3种保护酶活性，且不同浓度外源Pro或GB对各生理生化性状的影响程度不同，说明外源Pro或GB可显著缓解低温对玉米幼苗的伤害。
7.3低温胁迫下添加外源Pro或GB后玉米萌发、幼苗性状的方差分析
由表1可知，萌发期低温胁迫下，添加不同浓度外源Pro后，6个萌发性状在自交系间达到1％差异水平；6个性状在Pro浓度间达到1％差异水平；除胚根鲜重外其余5个性状在自交系与Pro浓度互作间达到5％或1％差异水平。另外，萌发期低温胁迫下，添加不同浓度外源GB后，除发芽势外其余5个性状在自交系间达到1％水平；6个性状在GB浓度间达到1％差异水平；6个性状在自交系与GB浓度互作间达到5％或1％差异水平。说明萌发期低温胁迫下，添加不同浓度外源Pro或GB可显著影响玉米的各萌发性状，且萌发期低温胁迫下，不同玉米自交系对外源Pro或GB的敏感程度不同。
表1低温胁迫下不同外源调节物质后各萌发性状的方差分析
注：“**”或“*”分别表示“1％”或“5％”水平差异显著。下同。
由表2可知，萌发期低温胁迫下，添加不同浓度外源Pro或GB后，玉米幼苗的7个生理生化性状在自交系间达到1％差异水平；7个性状在Pro或GB浓度间达到1％差异水平；除丙二醛含量、可溶性糖含量外，其余5个性状在自交系与Pro浓度互作间达到1％差异水平，另外，除可溶性糖含量外，其余6个性状在自交系与GB浓度互作间达到1％差异水平。说明苗期低温胁迫下，添加不同浓度外源Pro或GB可显著影响幼苗的生理生化特性，且苗期低温胁迫下，不同玉米自交系对外源Pro或GB的敏感程度不同。
表2低温胁迫下添加不同外源调节物质后各幼苗性状的方差分析
7.4低温胁迫下添加外源调节物质后玉米相关性状的低温缓解指数
由表3可知，萌发期低温胁迫下，不同浓度外源Pro或GB对玉米各萌发性状的缓解方向和大小存在差异，其缓解指数不尽相同。就外源Pro而言，低温胁迫下，T4(800μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米发芽势、发芽率、胚芽长的缓解指数最大，分别为1.115、0.966和1.013，T3(600μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米胚根长的缓解指数最大，为0.578，T2(400μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米胚芽鲜重的缓解指数最大，为0.620，T3(600μmol.L-1)或T4(800μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米胚根鲜重的缓解指数最大，都为0.365；低温胁迫下，T1(200μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米发芽势、发芽率的缓解指数最小，分别为0.473和0.554，T5(1000μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重的缓解指数最小，分别为0.559、0.163、0.092、0.184。就外源GB而言，低温胁迫下，T2*(20μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米发芽势、胚芽长和胚根鲜重的缓解指数最大，分别为1.151、0.723和0.362，T1*(10μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米胚根长和胚芽鲜重的缓解指数最大，分别为0.091和0.314，T3*(30μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米发芽率的缓解指数最大，为0.614；低温胁迫下，T5*(50μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米发芽势、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重的缓解指数最小，分别为0.128、-0.237、-0.081、-0.794和0.005，T1*(10μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米发芽率的缓解指数最小，为0.134。
表3低温胁迫下添加不同外源调节物质后各萌发性状的缓解指数
续表3
表3中：EI1，EI2，EI3，EI4，EI5和EI6分别表示发芽势，发芽率，胚芽长，胚根长，胚芽鲜重和胚根鲜重的缓解指数。
由表4可知，苗期低温胁迫下，不同浓度外源Pro或GB对玉米各幼苗生理生化性状的缓解方向和大小存在差异，其缓解指数不尽相同。就外源Pro而言，低温胁迫下，T2(400μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米叶片相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性、CAT活性的缓解指数最大，分别为0.757、0.931、0.639、0.544、0.445和1.492，T4(800μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米叶片脯氨酸含量的缓解指数最大，为0.746；低温胁迫下，T4(800μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米叶片相对电导率的缓解指数最小，为0.457，T1(200μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米叶片脯氨酸含量的缓解指数最小，为0.098，T5(1000μmol.L-1)浓度外源Pro作用下玉米叶片丙二醛含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性、CAT活性的缓解指数最小，分别为0.579、0.015、0.200、0.029和0.199。就外源GB而言，低温胁迫下，T1*(10μmol.L-1)浓度外源GB作用下7个生理生化性状的缓解指数都最大，分别为0.727、0.542、0.420、0.627、0.069、0.399和0.820，低温胁迫下，T3*(30μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米叶片相对电导率的缓解指数最小，为0.404，T5*(50μmol.L-1)浓度外源GB作用下玉米叶片其余6个性状的缓解指数最小，分别为-0.112、0.055、0.172、-0.133、0.010和0.136。
表4低温胁迫下添加不同外源调节物质后各幼苗性状的缓解指数
续表4
表4中：*EI1，*EI2，*EI3，*EI4，*EI5，*EI6，*EI7分别表示相对电导率，丙二醛含量，脯氨酸含量，可溶性糖含量，SOD活性，POD活性和CAT活性的缓解指数。
7.5不同外源调节物质低温缓解综合评价
由表5可知，就外源Pro而言，萌发期低温胁迫下，外源Pro对玉米的综合低温缓解效果随Pro浓度的增大而呈先增强后降低的趋势；T3和T4(600μmol.L-1和800μmol.L-1)浓度外源Pro对玉米的综合低温缓解效果最佳，隶属值都为0.882；T5(10000μmol.L-1)浓度外源Pro对玉米的综合低温缓解效果最小，隶属值为0.513。就外源GB而言，萌发期低温胁迫下，外源GB对玉米的综合低温缓解效果也随GB浓度的增大而呈先增强后降低的趋势；T2*(20μmol.L-1)浓度外源GB对玉米的综合低温缓解效果最佳，隶属值为0.647；T5(50μmol.L-1)浓度外源GB对玉米的综合低温缓解效果最小，隶属值仅为0.022。就外源Pro和GB比较而言，萌发期低温胁迫下，各浓度外源Pro对玉米的综合低温缓解效果远远大于外源GB对玉米的综合缓解效果，前者为后者的1.858倍。
表5萌发期低温胁迫下不同外源调节物质的缓解效果综合评价
由表6可知，就外源Pro而言，苗期低温胁迫下，外源Pro对玉米的综合低温缓解效果随Pro浓度的增大而呈先增强后降低的趋势；T2(400μmol.L-1)浓度外源Pro对玉米的综合低温缓解效果最佳，其隶属值为0.577；T5(1000μmol.L-1)浓度外源Pro对玉米的综合低温缓解效果最小，其隶属值仅为0.246。就外源GB而言，苗期低温胁迫下，外源Pro对玉米的综合低温缓解效果随GB浓度的增大而呈降低的趋势；T1*(10μmol.L-1)浓度外源GB对玉米的综合低温缓解效果最佳，隶属值为0.500；T4(40μmol.L-1)浓度外源GB对玉米的综合低温缓解效果最小，隶属值仅为0.289。就外源Pro和GB而言，各浓度外源Pro对玉米的综合低温缓解效果与各浓度外源GB对玉米的综合低温缓解效果差异不大，前者仅为后者的1.064倍。
表6苗期低温胁迫下不同外源调节物质的缓解效果综合评价
从上述实例可以看出，本发明不仅揭示了10℃低温胁迫对玉米种子萌发和幼苗生理生化特性的影响，揭示了萌发期和苗期外源Pro和GB对玉米低温缓解的原因，而且新定义了单个性状的外源Pro或GB低温缓解指数EI，并以EI为综合低温缓解评价指标，采用隶属函数法，科学、客观、综合评价了外源Pro或GB对玉米种子萌发及幼苗的缓解效果，比较了萌发期和苗期外源Pro与GB的综合低温缓解优劣，为萌发期和苗期提高玉米耐寒性奠定理论基础，为玉米制定安全可靠的低温冷害预防及抵御措施提供技术参考，应用前景广阔。
Claims (1)
1.一种不同外源调节物质对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗缓解的应用方法，包括材料收集、配制Pro或GB处理液、种子精选及消毒、浸种、低温发芽试验、幼苗低温试验、测定项目与测定方法、结果分析；具体步骤如下：
(1)材料收集：三份寒敏感自交系H105W、K22和B68；
(2)配制Pro或GB处理液：双蒸水配制6种不同浓度Pro溶液分别为：T1 200umol.L-1；T2400umol.L-1；T3 600umol.L-1；T4 800umol.L-1；T5 1000umol.L-1；CK 0umol.L-1；或双蒸水配制6种不同浓度GB溶液分别为：T1*10umol.L-1；T2*20umol.L-1；T3*30umol.L-1；T4*40umol.L-1；T5*50umol.L-1；CK0 umol.L-1；
(3)种子精选及消毒：从步骤(1)中精选饱满、均匀一致、无破损的种子，先用体积百分比为0.5％的NaClO溶液消毒10min，然后用双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，得3份寒敏感玉米自交系消毒种子；
(4)浸种：常温下将步骤(3)所得到的消毒种子分别浸泡于步骤(2)配制的各溶液中24h；
(5)低温发芽试验：
(5.1)发芽盒用体积百分比为0.5％的NaClO溶液消毒10min后用双蒸水冲洗3次，发芽盒内铺入双层灭菌滤纸做发芽床；
(5.2)将步骤(4)所得的种子各30粒，分别置于消毒发芽盒中，然后分别加入6种相应浓度Pro或GB溶液；
(5.3)试验处理组为T1～T5和T1*～T5*溶液培养的种子，将种子先置于10±1℃低温气候培养箱中暗培养7d后，再转置于25±1℃气候培养箱中继续暗培养7d；对照处理组为CK溶液中培养的种子，其中将种子置于25±1℃暗培养7d的种子作为正向对照处理CK(+)，将种子置于10±1℃和25±1℃暗培养各7d的种子作为负向对照处理CK(-)；所有试验处理下气候培养箱相对湿度60％～80％，培养期间每隔2d补一次相应浓度溶液各15mL；
(5.4)试验设3次重复，待T1～T5、T1*～T5*、CK(-)和CK(+)处理的种子暗培养第10d和4d统计发芽势，第14d和7d统计发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重；
(6)幼苗低温试验：
(6.1)双蒸水与灭菌蛭石按1mL：5g比例混合均匀后，将步骤(4)所得的种子各30粒分别播种于含灭菌蛭石的营养钵中，在昼/夜(25±1)/(20±1)℃的气候培养箱中培养；
(6.2)待CK溶液浸种的种子长至三叶一心期时，用双蒸水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，然后将各幼苗置于300mL、相应浓度的Pro或GB溶液中；
(6.3)试验处理组为T1～T5和T1*～T5*溶液培养的相应幼苗，将幼苗置于昼/夜温度为(10±1)/(6±1)℃的气候培养箱中继续培养7d；对照处理组为CK溶液中培养的相应幼苗，其中将幼苗置于昼/夜温度为(25±1)/(20±1)℃的气候培养箱中培养的幼苗作为正向对照处理CK(+)，将幼苗置于昼/夜温度为(10±1)/(6±1)℃的气候培养箱中培养的幼苗作为负向对照处理CK(-)；幼苗培养期间，每天光照12h，光照强度600μmol/(s·m2)，相对湿度60％～80％；
(6.4)试验设3次重复，待T1～T5、T1*～T5*、CK(-)和CK(+)处理后的玉米幼苗叶片的各生理生化性状，即相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性、CAT活性；
(7)测定项目与方法：
(7.1)萌发种子性状测定：分别测定步骤(5.4)中各试验处理下的玉米种子发芽势(Germination potential；GP)＝规定时间内发芽种子数/供试种子数*100(％)，发芽率(Germination rate；GR)＝发芽种子数/供试种子数*100(％)，胚芽长(Plumule length；PL)＝胚芽基部到胚芽顶部的长度，胚根长(Radical length；RL)＝最长胚根长度，胚芽鲜重(Shoot fresh weight；SFW)和胚根鲜重(Root fresh weight；RFW)；
(7.2)幼苗叶片生理生化性状测定：测定步骤(6.4)中所述的幼苗叶片的各生理生化性状；包括有第3片叶片的相对电导率(Relative conductivity；RC)、丙二醛含量(Malondialdehyde content；MDA)、脯氨酸含量(Proline content；Pro)、可溶性糖含量(Soluble sugar content；SS)、超氧化物岐化酶活性(Superoxide dismutase activity；SOD)、过氧化物酶活性(Peroxidase activity；POD)及过氧化氢酶活性(Catalaseactivity；CAT)；
(7.3)各性状的外源调节物质低温缓解指数：为方便评价外源Pro或GB对低温胁迫的缓解效果，本试验根据低温胁迫下不同浓度外源Pro或GB处理下的各测定性状值，新定义了各性状的外源Pro或GB低温缓解指数(Ease index，EI)，其公式为：
式中：EIiTn为第i个性状在第Tn种浓度下的外源调节物质低温缓解指数；XTn为第Tn种浓度处理下的相应性状测定值；XCK(+)为正向对照CK(+)处理下的测定值；XCK(-)为负向对照CK(-)处理下的测定值；若相应性状与耐寒性呈正相关，则采用(1)式计算，反之，则用(2)式计算；EI为正值表示相应浓度的外源Pro或GB对低温胁迫起正向缓解作用，EI为负值表示相应浓度外源Pro或GB对低温胁迫起负向缓解作用；
(7.4)不同外源调节物质低温缓解综合评价：以各测定性状的外源Pro或GB低温缓解指数为低温缓解评价指标，采用隶属函数法综合评价外源Pro或GB的低温缓解效果，其公式为：
式中：UiTn为第i个性状在第Tn种浓度下的外源Pro或GB低温缓解隶属值，EIiTn为第i个性状在第Tn种浓度下的外源调节物质低温缓解指数，EImax为第i个性状在n种浓度下的最大外源调节物质低温缓解指数，EImin为第i个性状在n种浓度下的最小外源调节物质低温缓解指数；若所测EI与耐寒性呈正相关，则采用(3)式计算，反之，则用(4)式计算，累加各浓度外源Pro或GB的EI隶属值，并求出均值后进行比较，均值越大，外源Pro或GB的低温缓解效果越大；
(8)结果分析：所有试验数据均采用Microsoft Excel2013软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS19.0软件对数据进行Duncan多重比较方差分析。
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