CN106795192B - Ibs微生物群及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供诊断和治疗患有IBS的受试者的方法。在某些实施方案中，所述方法还包括诊断将对用利福昔明的IBS治疗有反应的受试者。所述方法包括确定胃肠(GI)道中细菌群落的身份和流行性。在某些实施方案中，微生物组包含GI道微生物组(microbiome)。在某些实施方案中，微生物组包括GI道细菌群。在某些实施方案中，微生物组包括粪便细菌。所述方法包括分析胃肠(GI)微生物组中细菌群落的身份以产生细菌群落的多样性概况。

Description

IBS微生物群及其用途
相关申请
本申请要求于2014年5月4日提交的美国临时申请号61/988,293，于2014年5月5日提交的美国临时申请号61/988,841，于2014年8月11日提交的美国临时申请号62/036,085，于2015年3月19日提交的临时申请号62/135,658的权益。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
背景
肠易激综合征(IBS)是以频繁和虚弱的症状(例如腹泻，腹胀，腹痛，紧急排便，排气，和粪便失禁)为特征的不同种类的胃肠(GI)病症，常常伴有周期性症状加强和减弱。IBS导致健康相关的生活质量(QOL)实质性损害，工作和生产力的损失，社交尴尬和高医疗保健成本。认为IBS的流行率为美国(US)人口的10％至15％；然而，只有15％的IBS患者实际上寻求医疗，这可能部分是由于缺乏有效的治疗。尽管IBS的巨大负担，但在患者和保健系统上，仍然存在对有效和安全的治疗的显著未满足的需求，特别是对于伴有腹泻的IBS(IBS-D)。
IBS的确切原因是未知的，但已经提出了几个假设。牵涉肠道细菌失调的一个流行假说表明IBS症状是由肠微生物组的改变和异常定居引起的，所述肠微生物组也参与正常的生理功能。最好将肠道细菌性失调视为改变的微生物生态系统，而不是感染本身。
本领域需要诊断需要IBS治疗的那些。本领域还需要提供待治疗IBS的那些或正在或已经进行IBS治疗的那些的预后指示。
本领域还需要一种在短期治疗过程之后为IBS-D受试者提供症状缓解以及不利促成多药物抗生素抗性问题的低风险的方法。
发明内容
本文提供诊断和/或治疗IBS的方法。
在某些实施方案中，方法还包括诊断将对IBS治疗反应的受试者。
在某些实施方案中，方法还包括诊断将对IBS的利福昔明治疗反应的受试者。
在某些实施方案中，方法还包括诊断将对IBS的利福昔明治疗和再治疗反应的受试者。
在某些实施方案中，治疗包括550mg利福昔明TID，持续14天。
在某些实施方案中，再治疗包括在第一次或其它治疗复发后550mg利福昔明TID，持续14天。
所述方法包括确定胃肠(GI)道中细菌群落(例如，群体)的身份。
所述方法包括确定胃肠(GI)道中细菌群落的身份和流行性。
在某些实施方案中，微生物组包括胃肠道微生物组。在某些实施方案中，微生物组包括胃肠道细菌群体。在某些实施方案中，微生物组包括粪便细菌。
所述方法包括测定胃肠(GI)道中的细菌的身份。
所述方法包括通过宏基因组学分析微生物组。
所述方法包括分析胃肠(GI)微生物组中的细菌群落的身份以产生细菌群落的多样性概况。
所述方法包括通过宏基因组学确定胃肠(GI)道GI微生物组的身份，流行性和多样性。
所述方法包括通过宏基因组学分析胃肠(GI)微生物组。
所述方法包括确定皮肤，鼻和胃肠道中的一个或多个上的细菌的身份。
所述方法包括通过宏基因组学确定皮肤，鼻和胃肠道中的一个或多个上的细菌的身份。
所述方法包括确定皮肤，鼻和胃肠道中的一个或多个上的细菌的身份和流行性。
本文提供了使用例如宏基因组学来治疗受试者的IBS的方法，包括确定和/或检测和/或分析受试者的GI道微生物组。
在某些实施方案中，所述方法包括通过宏基因组学治疗受试者的IBS，包括，确定和/或检测和/或分析受试者的GI道微生物组。
在某些实施方案中，所述方法包括向具有特定细菌的受试者施用利福昔明，其中反应者对药物的相对丰度高于无反应者的相对丰度确定为存在的。
在某些实施方案中，微生物组包括胃肠道微生物组。在某些实施方案中，微生物组包括胃肠道细菌群体。在某些实施方案中，微生物组包括粪便细菌。
在某些实施方案中，检测包括分析16S rRNA基因。
在某些实施方案中，分析16S rRNA基因的V4超变区。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析，其中平均反应者数目高于平均无反应者数目确定为存在的，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析，其中平均反应者数目低于平均无反应者数目确定为不存在的，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析，其中平均无反应者数目高于平均反应者数目确定为存在的，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析，其中平均无反应者数目低于平均反应者数目确定为不存在的，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果其中平均反应者数目高于平均无反应者数目的细菌种类确定为存在的，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果其中平均反应者数目低于平均无反应者数目的细菌种类确定为不存在的，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果其中平均无反应者数目高于平均反应者数目的细菌种类确定为存在的，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果其中平均无反应者数目低于平均反应者数目的细菌种类确定为不存在的，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科在平均反应者中以较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科在平均反应者中以显著较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果叶杆菌科在平均反应者中以较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果叶杆菌科在平均反应者中以显著较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果热厌氧杆菌科在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果热厌氧杆菌科在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesincertae sedis)在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesincertae sedis)在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果黄杆菌科在平均反应者中以较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果黄杆菌科在平均反应者中以显著较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种以大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种以显著大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应和/或如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种以大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应和/或如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科，或黄杆菌科中的一种或多种以显著大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
本文还提供了提供IBS治疗的预后的方法。
本文提供选择用利福昔明治疗的受试者的方法。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中后续治疗在IBS相关腹痛的病征或症状复发后开始，或在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％后开始，并且其中对受试者的粪便微生物群(microbiota)或受试者对其它抗生素的交叉抗性或受试者对利福昔明后续治疗后微生物出现的倾向没有影响。
在一个实施方案中，对受试者的总粪便微生物群没有影响。
在一个实施方案中，通过Bray-Curtis相似性测量来评价对受试者的粪便微生物群的影响。
在一个实施方案中，通过Shannon多样性指数评价对受试者的粪便微生物群的影响。
在一个实施方案中，对受试者对除利福平之外的抗生素的抗性没有影响。
在一个实施方案中，对受试者对利福平的抗性有影响。
在一个实施方案中，对受试者对非利福霉素抗生素的交叉抗性没有影响。
在一个实施方案中，通过从受试者的粪便拭子样品生长的分离株培养物来评价对受试者对抗生素的交叉抗性的影响。
在一个实施方案中，通过从受试者的皮肤样品生长的分离株培养物来评价对受试者对抗生素的交叉抗性的影响。
在一个实施方案中，抗生素包括利福昔明，利福平，万古霉素，非达霉素，甲硝唑，头孢他啶，头孢曲松，头孢噻吩，环丙沙星，亚胺培南，美罗培南，哌拉西林或三唑巴坦，甲氧苄啶，磺胺甲噁唑或万古霉素。
在一个实施方案中，抗生素包括利福昔明，利福平，万古霉素，非达霉素，甲硝唑，头孢他啶，头孢曲松，环丙沙星，亚胺培南，美罗培南，哌拉西林或三唑巴坦。
在一个实施方案中，抗生素包括利福昔明，利福平，头孢他啶，头孢曲松，头孢噻吩，环丙沙星，亚胺培南，美罗培南，哌拉西林或三唑巴坦，甲氧苄啶，磺胺甲噁唑或万古霉素。
在一个实施方案中，对受试者在利福昔明的后续治疗后出现微生物的倾向没有影响。
在一个实施方案中，利福昔明的后续治疗不影响受试者对受试者粪便中微生物出现的倾向。
在一个实施方案中，利福昔明的后续治疗不影响受试者对受试者皮肤上微生物出现的倾向。
在一个实施方案中，微生物是酵母。
在一个实施方案中，微生物是病原菌。
在一个实施方案中，微生物是革兰氏阳性细菌。
在一个实施方案中，微生物是革兰氏阴性细菌。
在一个实施方案中，病原菌包括以下种类：大肠杆菌，克雷伯氏菌，假单胞菌，肠杆菌，沙雷氏菌，变形杆菌，拟杆菌，肠球菌，葡萄球菌或艰难梭菌。
在一个实施方案中，病原菌是葡萄球菌。
在一个实施方案中，病原菌是肠球菌。
在一个实施方案中，病原菌是梭菌。
在一个实施方案中，对受试者对利福平的抗性有影响。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括：向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中后续治疗在IBS相关腹痛的病征或症状复发后开始，或在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％后开始，并且其中利福平抗性遵循(track)利福昔明抗性。
在一个实施方案中，在表现出利福昔明抗性增加的受试者中观察到利福平抗性的增加。
在一个实施方案中，在没有表现出利福昔明抗性增加的受试者中没有观察到利福平抗性的增加。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括：向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中后续治疗在IBS相关腹痛的病征或症状复发后开始，或在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％后开始，并且其中受试者表现出利福昔明最小抑制浓度(MIC)的瞬时变化。
在一个实施方案中，MIC的变化随时间可逆。
在一个实施方案中，针对葡萄球菌显示MIC的瞬时增加。
在一个实施方案中，所述方法还包括利福平MIC的瞬时变化。
在一个实施方案中，MIC的变化随时间可逆。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括：向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中后续治疗在IBS相关腹痛的病征或症状复发后开始，或在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％后开始，并且其中利福平MIC的变化类似于利福昔明MIC的变化。
在一个实施方案中，类似于，包括例如遵循，为在相同的方向上相似的量或水平的改变。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中后续治疗在IBS相关腹痛的病征或症状复发后开始。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中后续治疗在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％后开始。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，然后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中对受试者的粪便微生物群体没有影响。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中受试者对除利福平之外的抗生素的交叉抗性没有变化。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，随后进行利福昔明的一次或多次后续治疗，其中在利福昔明的后续治疗后受试者对微生物出现的倾向没有可检测的变化。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括施用第一治疗，施用一次或多次利福昔明的后续治疗，其中没有证据表明所述一次或多次后续治疗对受试者的粪便或皮肤样品中的病原体出现产生显著影响，并且其中所述利福昔明的治疗和各后续治疗包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明，持续14天。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括施用第一治疗，施用一次或多次利福昔明的后续治疗，其中没有证据表明所述一次或多次后续治疗对受试者的粪便或皮肤样品中的病原体易感性产生显著影响，并且其中所述利福昔明的治疗和各后续治疗包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明，持续14天。
本文提供了用利福昔明治疗患有腹泻型IBS(d-IBS)的受试者的方法，包括施用第一治疗，施用一次或多次利福昔明的后续治疗，其中没有证据表明所述一次或多次后续治疗对受试者的粪便或皮肤样品中的总体微生物群体产生显著影响，并且其中所述利福昔明的治疗和各后续治疗包括向受试者每天三次(TID)施用550mg利福昔明，持续14天。
本文提供诊断或治疗受试者的肠易激综合征(IBS)的方法。该方法包括分析受试者的样品中是否存在一种或多种细菌，所述细菌属于平均反应者数目高于平均无反应者数目的分类群，其中如果检测到所述细菌，则所述受试者对利福昔明有反应，并且其中所述受试者的样品包括来自受试者的胃肠微生物群；和向受试者施用利福昔明。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，利福昔明以550mg每天三次持续14天的给药方案施用。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在与IBS相关的一种或多种症状复发后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种症状包括腹痛或松散或水样粪便。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％或更多后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，样品是粪便样品。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过从样品分离的细菌DNA，更具体地16S rRNA基因或16S rRNA基因的V4超变区的基因组分析来确定所述细菌存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过扩增16S rRNA基因的V4超变区并测序V4超变区的扩增序列来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过细菌培养，任选地与基因组分析组合来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科，热厌氧杆菌科，分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黄杆菌科。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，热厌氧杆菌科，和分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)，叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，基于对施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃肠微生物群数据集的监督分类来确定平均反应者数目和平均无反应者数目。
本文提供了治疗肠易激综合征(IBS)的方法，所述方法包括将利福昔明施用给已知具有一种或多种属于平均反应者数目高于平均无反应者数目的分类群的细菌的受试者，其中利福昔明以550mg每天三次持续14天的给药方案施用给受试者。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在与IBS相关的一种或多种症状，例如，不排除地，腹痛和/或松散或水样粪便复发后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％或更多后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科，热厌氧杆菌科，分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黄杆菌科。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，热厌氧杆菌科，和分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)，叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，基于对施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃肠微生物群数据集的监督分类来确定平均反应者数目和平均无反应者数目。
本文还提供了在受试者中治疗腹泻型IBS(d-IBS)的方法，所述方法包括以550mg利福昔明每天三次(TID)的给药方案向受试者施用利福昔明，持续14天；和在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％或更多后重复给药方案。
本文还提供了通过分析受试者的样品中细菌的存在或不存在来诊断受试者中利福昔明反应性IBS的方法，所述细菌具有高于平均无反应者数目的平均反应者数目，其中如果检测到所述细菌，则所述受试者诊断为患有利福昔明反应性IBS，并且其中受试者的样品含有来自受试者的胃肠微生物群。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，IBS是d-IBS。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，样品是粪便样品。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过从样品分离的细菌DNA的基因组分析，例如通过分析16S rRNA基因，例如通过分析16S rRNA基因的V4超变区来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过扩增16S rRNA基因的V4超变区并测序V4超变区的扩增序列来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过细菌培养，任选地与基因组分析组合来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，基于对施用550mg利福昔明TID持续14天的患者的胃肠微生物群数据集的监督分类来确定所述平均反应者数目和平均无反应者数目。
以下公开了其它实施例。
附图说明
图1显示了研究设计。
图2显示了具有449个样品* 2配对端的排序图。根据就诊日期没有明显的聚类。
图3显示了根据反应者/无反应者状态的聚类。
图4显示来自V3的配对端读数之一的样品。
图5显示来自V4的配对端读数之一的样品。
图6显示了表1标记物的相对丰度。
图7显示了V3和V4之间的不同(n = 100)。
图8显示通过使用配对的Wilcoxon检验来询问谁在V3和治疗结束之间是不同的(n= 94)，其可以显示微生物群落具有长期的恢复力。
图9显示在抗生素抑制的细菌和预测反应者的细菌之间没有一般性关系。
图10显示统计建模的结果，其表明微生物群落在利福昔明治疗时间点内的个体中是高度稳定的。
图11显示了开放标签期的微生物组丰富度。
图12显示了开放标签期丰富度自基线的变化。
图13显示了接受双盲的受试者中丰富度自基线的变化。
图14显示接受双盲利福昔明的受试者中丰富度自基线的变化。
图15显示了在开放标签和双盲期的双盲安慰剂治疗的受试者中粪便微生物群的丰富度。
图16显示了在开放标签和双盲期的双盲利福昔明治疗的受试者中粪便微生物群的丰富度。
发明详述
多重证据已经暗示肠道微生物组的生态失调，以及宿主对该生态失调的反应，作为肠易激综合征(IBS-D)的原因。利福昔明在治疗IBS-D中的功效已经在许多研究中确立，所述研究在药物单一和多疗程治疗后显示出统计学和临床学显著作用。利福昔明的临床药理学特征使其与其它经测试用于治疗IBS-D的抗生素区分开。具体地，其是肠靶向的，导致最少的全身暴露(比全身抗生素或其它最少吸收的抗生素低数个数量级)，并组合了在口服给药后在GI道中的高局部浓度。利福昔明激活人类孕烷X受体，导致宿主解毒机制的上调和炎症过程的调节，其可以调节宿主对生态失调的反应。尽管利福昔明在体外具有可证明的抗微生物作用，但在公开的文献中的数据表明其不根除有益的肠道菌群；在这项研究中收集的数据提供了在这方面以前发表的发现结果的验证。此外，已显示利福昔明改变细菌毒力和附着到宿主上皮。
抗生素给药的普遍问题是细菌对多药抗生素抗性的发展。文献中已经论述了细菌对利福霉素的抗性的机制；并且本文提供的本发明的一个方面显示，对非利福霉素抗生素的交叉抗性的发生的可能性低，利福霉素抗性细菌的适合度差，以及缺乏用于发展临床显著抗性的明显信号。
本文提供的本发明部分基于16S rRNA细菌深度基因测序数据的预期评估。根据这些数据，证明利福昔明治疗对安慰剂与利福昔明治疗的IBS-D受试者之间的Shannon多样性或均匀度没有显著影响，并且导致微生物群丰富度的瞬时变化。这些在丰富度方面的减少在利福昔明治疗过程结束后恢复。
还显示，受利福昔明治疗影响的细菌科中，16S rRNA基因的测序显示低丰度分类群比更高丰度分类群更受利福昔明治疗的影响。总的来说，与使用单一疗程的开放标签利福昔明，然后双盲安慰剂的受试者相比，在使用利福昔明重复治疗期间，在受试者中未观察到粪便微生物群的干扰。
本文的发明还部分基于3期研究，其设计用于评估利福昔明550 TID在IBS-D受试者中重复治疗2周的功效，所述受试者先前已经对利福昔明550 mg TID的2周治疗反应并且正经历IBS症状的复发。
利福昔明的低全身吸收以及该微生物学数据和总体安全性特征支持使用口服利福昔明作为IBS-D治疗的最合适和充分表征的选择，并且满足本领域中对于在短期治疗过程之后为IBS-D受试者提供症状缓解，且不利促成多药物抗生素抗性问题的风险低的方法的需要
关于利福昔明抗性的一个临床考虑是对利福平(利福昔明的化学类似物)产生交叉抗性的可能性。利福平作为传染病抗生素的价值主要在于其治疗结核病。在结核病的治疗中，利福平不用作单一药剂，而是与其它抗结核抗生素组合以减少临床显著抗性的可能性。
利福昔明是由利福霉素O产生的半合成抗生素。利福昔明是属于利福霉素类抗生素例如吡啶并咪唑并利福霉素的分子。利福昔明例如在胃肠道中对引起感染性腹泻，肠易激综合征，小肠细菌过度生长，克罗恩病和/或胰腺功能不全的局部胃肠道细菌发挥广泛的抗菌活性。
利福昔明也描述于意大利专利IT 1154655和EP 0161534中。EP专利0161534公开了使用利福霉素O作为起始材料生产利福昔明的方法(The Merck Index, XIII Ed.,8301)。US 7,045,620公开了利福昔明的多晶型形式，如同USSN 11/658,702; USSN 61/031,329; USSN 12/119,622; USSN 12/119,630; USSN 12/119,612; USSN 12/119,600;USSN 11/873,841; 公开WO 2006/094662;和USSN 12/393012。这里引用的申请和专利为了所有目的通过引用整体并入本文。
本文所用的“利福昔明”包括该分子的溶剂合物和多晶型，包括例如利福昔明的晶型α, 晶型β, 晶型γ, 晶型δ, 晶型ε, 晶型ζ, 晶型η, 晶型ι, 晶型κ, 晶型θ, 晶型μ,晶型ω, 晶型π, 晶型λ, 晶型ξ，甲磺酸盐形式，无定形形式或固体分散体形式。这些形式更详细地描述于例如2005年3月3日提交的EP 05 004 635.2;美国专利号7,045,620;美国专利号7,612,199;美国专利号7,709,634;美国专利号7,915,275;美国专利号8,067,429;美国专利8,193,196;美国专利8,227,482; GC Viscomi等人，CrystEngComm，2008,10,1074-1081(2008年4月)，美国专利公开号2010/0174064，美国专利公开号2009/0028940，美国专利公开号2005/0272754，美国专利公开号2012/0077835和美国专利公开号2012/0108620。这些参考文献中的每一篇通过引用整体并入本文。
如在“获得GI特异性抗生素”中的术语“获得”意在包括购买，合成或以其它方式获取GI特异性抗生素。例如，获得利福昔明可包括购买，合成或以其它方式获取利福昔明。
本文所用的术语“药剂组合物”(或药剂或药物)是指当适当地施用于患者时能够诱导所需治疗效果的化合物，组合物，药剂或药物。它不一定需要多于一种类型的成分。
如本文所使用的，“反应的持久性”包括例如在去除治疗后充分缓解症状，在去除治疗后连续充分缓解症状，或反应大于或优于安慰剂反应。受试者的反应可以被认为是持久的，例如，如果将利福霉素类抗生素(例如利福昔明)从治疗中去除后，他们对利福霉素类抗生素(例如利福昔明)具有反应。反应持续时间可以是例如2天，7天，2周，3周，4周，12周，约1周至约24周或更长。在一些实施方案中，反应的持久性是在三个月期间内观察到的至少两个月的治疗效果。可以例如使用以下概述的一种或多种方法测量反应，包括例如受试者对他们的症状的主观评价，或医疗保健提供者或看护者对受试者症状的评估。
如本文所使用的，“选择反应的受试者”，“反应的受试者的选择”等包括例如基于肠疾病(BD)或IBS症状的减少和/或遵循标签说明书施用产品(例如，利福霉素类抗生素)一段时间等，确定受试者对治疗反应。所述确定或选择可以基于标签(例如，包装或包装说明书)说明或基于受试者对其症状的主观评价或医疗保健提供者或护理者对受试者症状的评估。
如本文所用，“反应者”是经施用利福昔明用于治疗本文所述的疾病，病症或感染的受试者，其通过经历症状缓解，不适或疼痛缓解，或相对于基线的一般健康改善而作出反应。例如，反应者可以是经施用利福昔明用于治疗IBS的受试者，其基于每周对腹痛和粪便稠度的反应的每天问题，在4周中的至少2周期间具有阳性反应。在一个实施方案中，反应者的每周平均腹痛评分减少和每周腹痛天＃减少，其中至少1次粪便的稠度大于或等于6 (根据Bristol粪便量表)，如由Rome III标准定义的。
在一些实施方案中，反应者可以被鉴定为具有以下一种或多种的IBS-D受试者：中度腹胀和腹痛，粪便松散和/或恼人的排便紧急。例如，以下标准中的任一个可用于鉴定可能对利福昔明治疗反应的受试者：腹痛大于或等于例如2、2.5、3或3.5；腹胀大于例如2、2.5、3或3.5；粪便松散，且平均粪便稠度评分大于或等于3、3.5、4、4.5；或恼人的排便紧急，例如大于或等于3.0、3.5、4.0或4.5天排便紧急。或者，两种或更多种上述标准可用于鉴定可能对利福昔明治疗反应的受试者。例如，腹痛和腹胀；腹痛和粪便松散，腹痛和恼人的排便紧急；腹痛，腹胀和粪便松散等。
反应者也可以定义为：1)腹痛的改善≥30％，粪便稠度＜4％，每天IBS症状≥1分降低；2)与基线相比，在给定的一周内腹痛改善≥30％，和松散/水样粪便减少≥50％；3)在给定周内使用3个最差的每天项目，平均腹痛疼痛评分从基线降低≥30％；4)与基线相比，在给定周内，排便紧急天数减少≥30％；5)所选最差基线症状改善≥30％；或6)在给定周内至少50％的天数，每天反应者评分为0(完全没有)或1(几乎没有)；或者在选定的最差基线症状中，在给定周内100％的天数，每天反应者评分为0(完全没有)，1(几乎没有)或2(稍微有点)。
在具体实施方案中，如果已经向受试者施用利福昔明并且在治疗后2周被认为是反应者，其中治疗包括施用利福昔明14天，则受试者被定义为“一个月反应者”。
如本文所使用的，当在4周时间内，反应的标准在至少3周不存在时，受试者被认为具有“复发”。或者，“复发”可以定义为粪便稠度，腹痛或粪便稠度和腹痛中的一种或多种的恶化。
本文提供了治疗，预防或缓解疾病，病症或感染的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的利福昔明。感染可以是例如由艰难梭菌引起的感染。疾病或病症可以是例如肠相关病症。肠相关病症(例如肠疾病)包括以下的一种或多种：肠易激综合征(IBS)，交替型IBS，腹泻型肠易激综合征(d-IBS, IBS-D)，克罗恩病，旅行者腹泻，溃疡性结肠炎，肠炎，小肠细菌过度生长，慢性胰腺炎，胰腺功能不全，结肠炎，憩室病，肝性脑病，与IBS和/或囊炎相关的腹痛。在一些实施方案中，肠相关病症是肝性脑病。在一些实施方案中，肠相关病症是IBS。在一个实施方案中，通过本文所述的方法治疗的IBS是轻度，中度或重度。在具体实施方案中，IBS是严重的。在另一个具体实施方案中，IBS是IBS-D。
艰难梭菌是革兰氏阳性厌氧细菌，并且被认为是引起从轻度腹泻到暴发性假膜性结肠炎(PMC)的一系列疾病的重要人病原体。该细菌是医院特有的，研究表明，在急性护理医疗病房中接受抗生素治疗的约三分之一的患者在医院中被艰难梭菌定居(Kyne, L.,等人, 2002, Clin. Infect. Dis. 34(3), pp346-53, PMID: 11774082)。患有CDI的患者对万古霉素的治疗反应良好。然而，使用万古霉素是最后的手段之一，因为它与几个问题相关。其不仅可能引起肾毒性，耳毒性，骨髓毒性和红人综合征，而且万古霉素治疗通常对于治疗CDI无效。另外，有证据表明艰难梭菌变得至少部分地耐万古霉素，表明在治疗CDI中需要新的替代品。
因此，本文提供了治疗，预防或缓解受试者中的艰难梭菌感染(CDI)的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的利福昔明。在一些实施方案中，受试者是对其它治疗或用利福昔明以外的抗生素治疗无反应的受试者。在一些实施方案中，受试者是对万古霉素治疗无反应的受试者。
本文还提供了治疗，预防或缓解抗生素抗性的艰难梭菌感染的方法，其包括向有需要的受试者施用利福昔明，其中施用利福昔明有效治疗抗生素抗性的CDI。在本发明的实施方案中，提供了预防CDI的方法，其中所述方法包括向需要对病症进行抗生素治疗的受试者施用非全身性抗生素。在一些实施方案中，所述病症选自：克罗恩病，旅行者腹泻，肝性脑病，轻微型肝性脑病，肠易激综合征，不宁腿综合征，皮肤感染，小肠细菌过度生长，慢性胰腺炎，胰腺功能不全，憩室炎，肠炎和结肠炎，皮肤感染，粘膜病症，囊炎，阴道感染，肛裂，耳感染，肺部感染，牙周病症，酒渣鼻和其它皮肤感染和/或其它相关病症。在一些实施方案中，非全身性抗生素是利福昔明。
利福昔明可用于各种治疗方案。这些方案可以根据受试者和治疗的类型而变化。例如，利福昔明可以例如每天两次，每天三次，或每天四次或根据需要更频繁地施用。利福昔明可以以例如约2mg每天一次至约3000mg TID的剂量施用。例如，利福昔明可以以下列的日剂量施用：约5 mg- 100 mg, 约5 mg, 约10 mg, 约15 mg, 约20 mg, 约25 mg, 约30mg, 约35 mg, 约40 mg, 约45 mg, 约50 mg, 约55 mg, 约60 mg, 约65 mg, 约70 mg,约75 mg, 约80 mg, 约85 mg, 约90 mg, 约95 mg或约100 mg。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的日剂量施用：约125 mg, 约150 mg, 约175 mg, 约200 mg, 约225 mg, 约250 mg, 约275 mg, 约300 mg, 约325 mg, 约350 mg, 约375 mg, 约400 mg, 约425 mg,约450 mg, 约475 mg或约500 mg。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的日剂量施用：约550 mg, 约600 mg, 约650 mg, 约700 mg, 约750 mg, 约800 mg, 约850 mg, 约900mg, 约950 mg或约1000 mg。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的日剂量施用：约1100 mg, 约1200 mg, 约1300 mg, 约1400 mg, 约1500 mg, 约1600 mg, 约1700 mg, 约1800 mg, 约1900 mg, 约2000 mg, 约2100 mg, 约2200 mg, 约2300 mg, 约2400 mg, 约2500 mg, 约2600 mg, 约2700 mg, 约2800 mg, 约2900 mg或约3000 mg。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约25 mg BID, 约30 mg BID, 约35 mg BID, 约40mg BID, 约45 mg BID, 约50 mg BID, 约55 mg BID, 约60 mg BID, 约65 mg BID, 约70mg BID, 约75 mg BID, 约80 mg BID, 约85 mg BID, 约90 mg BID, 约95 mg BID或约100 mg BID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约125 mg BID, 约150mg BID, 约175 mg BID, 约200 mg BID, 约225 mg BID, 约250 mg BID, 约275 mg BID,约300 mg BID, 约325 mg BID, 约350 mg BID, 约375 mg BID, 约400 mg BID, 约425mg BID, 约450 mg BID, 约475 mg BID或约500 mg BID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约550 mg BID, 约600 mg BID, 约650 mg BID, 约700 mg BID, 约750 mg BID, 约800 mg BID, 约850 mg BID, 约900 mg BID, 约950 mg BID或约1000 mgBID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约1100 mg BID, 约1200 mgBID, 约1300 mg BID, 约1400 mg BID, 约1500 mg BID, 约1600 mg BID, 约1700 mgBID, 约1800 mg BID, 约1900 mg BID, 约2000 mg BID, 约2100 mg BID, 约2200 mgBID, 约2300 mg BID, 约2400 mg BID, 约2500 mg BID, 约2600 mg BID, 约2700 mgBID, 约2800 mg BID, 约2900 mg BID或约3000 mg BID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约25 mg TID, 约30 mg TID, 约35 mg TID, 约40 mg TID, 约45mg TID, 约50 mg TID, 约55 mg TID, 约60 mg TID, 约65 mg TID, 约70 mg TID, 约75mg TID, 约80 mg TID, 约85 mg TID, 约90 mg TID, 约95 mg TID或约100 mg TID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约125 mg TID, 约150 mg TID, 约175mg TID, 约200 mg TID, 约225 mg TID, 约250 mg TID, 约275 mg TID, 约300 mg TID,约325 mg TID, 约350 mg TID, 约375 mg TID, 约400 mg TID, 约425 mg TID, 约450mg TID, 约475 mg TID或约500 mg TID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约550 mg TID, 约600 mg TID, 约650 mg TID, 约700 mg TID, 约750 mg TID, 约800 mg TID, 约850 mg TID, 约900 mg TID, 约950 mg TID或约1000 mg TID。在一些实施方案中，利福昔明可以以下列的剂量施用：约1100 mg TID, 约1200 mg TID, 约1300 mgTID, 约1400 mg TID, 约1500 mg TID, 约1600 mg TID, 约1700 mg TID, 约1800 mgTID, 约1900 mg TID, 约2000 mg TID, 约2100 mg TID, 约2200 mg TID, 约2300 mgTID, 约2400 mg TID, 约2500 mg TID, 约2600 mg TID, 约2700 mg TID, 约2800 mgTID, 约2900 mg TID或约3000 mg TID。利福昔明可以例如以片剂形式，粉末形式，液体形式或胶囊形式施用。在一些实施方案中，利福昔明可以以时间释放的制剂施用。
在一些实施方案中，利福昔明作为可溶性固体分散体施用。例如，利福昔明可以以约2mg至550mg的利福昔明的可溶性固体分散体施用。
在一些实施方案中，向受试者施用利福昔明持续约1周至约6周，持续约8周至约12周，或持续约1天至约21天。在一个实施方案中，施用利福昔明10天。利福昔明可以在约1天至约1年，或1周至约52周施用。利福昔明可以在治疗过程中间歇地或连续地施用。治疗的时间长度可以根据疾病的类型和时间长度而变化，并且受益于本公开的本领域技术人员可以容易地确定适当的治疗时间长度。
对于任何实施方案，可以向受试者施用利福昔明，例如每天一次，每天两次，每天三次，或每天四次(或者对于特定受试者而言根据需要更频繁地)。在一些实施方案中，所述方法包括每天一次向受试者施用利福昔明，因为其可以例如使副作用最小化并增加患者依从性。在一些实施方案中，利福昔明每天施用两次和/或三次。
根据某些优选的实施方案，剂量范围为每天施用约50至约6000mg的利福昔明。例如，可以向受试者每天三次施用400mg的剂量，或者可以每天两次向受试者施用550mg的剂量，或者可以每天三次施用550mg剂量。本文公开的方法的其它合适剂量可以由保健专业人员或受试者确定。每天施用的利福昔明的量可以基于受试者的体重，年龄，健康，性别或医学状况而增加或减少。本领域技术人员将能够基于本公开确定受试者的适当剂量。
虽然以前已经注意到(Bajaj JS等人，Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol.2012; 302(1)：G168-G175)，患者的微生物组，认知不良和炎症标记物与肝硬化和HE之间存在相关性；以及大多数认知测试的损伤与肝硬化患者中的产碱杆菌科(Alcaligeneceae)和卟啉单孢菌科(Porphyromonadaceae)分类群的相对丰度之间存在相关性，以及(Bajaj JS等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2012; 303(6)：G675-G685)在具有HE病史的患者中，利福昔明维持治疗对粘膜肠微生物群有影响(利福昔明组中自身细菌和荣球菌科(Veillonellaceae)的丰度减少，但是丙酸杆菌的丰度增加)，本文令人惊奇地发现，存在特定细菌，其在受试者预治疗中存在或不存在可预测IBS中对利福昔明治疗的反应和无反应。
本文提供诊断IBS的方法。
在某些实施方案中，方法还包括诊断将对IBS治疗反应的受试者。
在某些实施方案中，方法还包括诊断对IBS的利福昔明治疗反应的受试者。
在某些实施方案中，方法还包括诊断将对IBS的利福昔明治疗和再治疗反应的受试者。
在某些实施方案中，治疗包括550mg利福昔明TID持续14天。
在某些实施方案中，再治疗包括在第一次或其它治疗复发后550mg利福昔明TID持续14天。
所述方法包括确定胃肠(GI)道中细菌群落(例如，群体)的身份。
所述方法包括确定胃肠(GI)道中细菌群落的身份和流行性。
在某些实施方案中，微生物组是胃肠道微生物组。在某些实施方案中，微生物组是胃肠道微生物组。在某些实施方案中，微生物组是由粪便细菌群体代表的胃肠道微生物组。
所述方法包括测定胃肠(GI)道中的细菌的身份。
所述方法包括通过宏基因组学分析微生物组。
所述方法包括分析胃肠(GI)道微生物组中的细菌群落的身份以产生细菌群落的多样性概况。
所述方法包括通过宏基因组学确定胃肠(GI)道GI微生物组的身份，流行性和多样性。
所述方法包括通过宏基因组学分析胃肠(GI)微生物组。
所述方法包括确定皮肤，鼻和胃肠道的一个或多个上的细菌的身份。
所述方法包括通过宏基因组学确定皮肤，鼻和胃肠道的一个或多个上的细菌的身份。
所述方法包括确定皮肤，鼻和胃肠道的一个或多个上的细菌的身份和流行性。
本文提供了治疗受试者的IBS的方法，包括使用例如宏基因组学来确定和/或检测和/或分析受试者的GI道微生物组。
在某些实施方案中，所述方法包括治疗受试者的IBS，包括通过宏基因组学确定和/或检测和/或分析受试者的GI道微生物组。
在某些实施方案中，所述方法包括向具有特定细菌的受试者施用利福昔明，对于该特定细菌，反应者对药物的相对丰度被确定为高于无反应者的相对丰度。
在某些实施方案中，微生物组是胃肠道微生物组。在某些实施方案中，微生物组是胃肠道细菌群体。在某些实施方案中，微生物组是由粪便细菌群体代表的胃肠道细菌群体。
在某些实施方案中，检测包括分析16S rRNA基因。
在某些实施方案中，分析16S rRNA基因的V4超变区。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析和检测(其平均反应者数目高于平均无反应者数目)表明受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析和确定的不存在(其平均反应者数目低于平均无反应者数目)表明受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析和检测(其平均无反应者数目高于平均反应者数目)表明受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，表1中分类群的分析和确定的不存在(其中平均无反应者数目低于平均反应者数目)，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果细菌种类(其平均反应者数目高于平均无反应者数目)确定为存在的，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果细菌种类(其平均反应者数目低于平均无反应者数目)确定为不存在的，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果细菌种类(其平均无反应者数目高于平均反应者数目)确定为存在的，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果细菌种类(其平均无反应者数目低于平均反应者数目)确定为不存在的，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科在平均反应者中以较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科在平均反应者中以显著较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果叶杆菌科在平均反应者中以较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果叶杆菌科在平均反应者中以显著较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果热厌氧杆菌科在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果热厌氧杆菌科在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesincertae sedis)在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesincertae sedis)在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果黄杆菌科在平均反应者中以较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果黄杆菌科在平均反应者中以显著较大的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种以大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种以显著大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者中以较大的量存在，则受试者不会对治疗反应和/或如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种以大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种在平均无反应者中以显著较大的量存在，则受试者不会对治疗反应和/或如果鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科，或黄杆菌科中的一种或多种以显著大于平均反应者的量存在，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在Sutterellaacae，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在鞘氨醇杆菌科，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在叶杆菌科，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在热厌氧杆菌科，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesincertae sedis)，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在黄杆菌科，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种，则受试者不会对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种，则受试者将对治疗反应。
在某些实施方案中，如果存在Sutterellacae，热厌氧杆菌科或分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一种或多种，则受试者不会对治疗反应和/或如果存在鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科或黄杆菌科中的一种或多种，则受试者将对治疗反应。
本文还提供了提供IBS治疗的预后的方法。
本文提供选择用利福昔明治疗的受试者的方法。
本文提供诊断或治疗受试者的肠易激综合征(IBS)的方法。该方法包括分析受试者的样品中一种或多种细菌的存在或不存在，所述细菌属于平均反应者数目高于平均无反应者数目的分类群，其中如果检测到所述细菌，则受试者将对利福昔明反应，并且其中所述受试者的样品包括来自所述受试者的胃肠微生物群；和给受试者施用利福昔明。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，利福昔明以550mg每天三次持续14天的给药方案施用。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在与IBS相关的一种或多种症状复发后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种症状包括腹痛或松散或水样粪便。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％或更多后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，样品是粪便样品。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过从样品分离的细菌DNA，更具体地16S rRNA基因或16S rRNA基因的V4超变区的基因组分析来确定所述细菌存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过扩增16S rRNA基因的V4超变区并测序V4超变区的扩增序列来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过细菌培养，任选地与基因组分析组合来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科，热厌氧杆菌科，分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黄杆菌科。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，热厌氧杆菌科，和分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)，叶杆菌科和黄杆菌科。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，基于对施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃肠微生物群数据集的监督分类来确定平均反应者数目和平均无反应者数目。
本文提供了治疗肠易激综合征(IBS)的方法，所述方法包括将利福昔明施用给已知具有一种或多种属于平均反应者数目高于平均无反应者数目的分类群的细菌的受试者，其中利福昔明以550mg每天三次持续14天的给药方案施用给受试者。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在与IBS相关的一种或多种症状复发后重复给药方案，例如，不排除地，腹痛和/或松散或水样粪便。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述方法还包括在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％或更多后重复给药方案。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科，热厌氧杆菌科，分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黄杆菌科。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：Sutterellaceae，热厌氧杆菌科，和分类位置未定的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，所述一种或多种细菌属于选自下组的一个或多个分类群：鞘氨醇杆菌科，叶杆菌科和黄杆菌科。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，基于对施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃肠微生物群数据集的监督分类来确定平均反应者数目和平均无反应者数目。
本文还提供了在受试者中治疗腹泻型IBS(d-IBS)的方法，所述方法包括以550mg利福昔明每天三次(TID)的给药方案向受试者施用利福昔明，持续14天；和在一周内松散或水样粪便的每天数量增加50％或更多后重复给药方案。
本文还提供了通过分析受试者的样品中细菌的存在或不存在来诊断受试者中利福昔明反应性IBS的方法，所述细菌具有高于平均无反应者数目的平均反应者数目，其中如果检测到所述细菌，则所述受试者诊断为患有利福昔明反应性IBS，并且其中受试者的样品含有来自受试者的胃肠微生物群。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，IBS是d-IBS。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，样品是粪便样品。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过从样品分离的细菌DNA的基因组分析，例如通过分析16S rRNA基因，例如通过分析16S rRNA基因的V4超变区来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过扩增16S rRNA基因的V4超变区并测序V4超变区的扩增序列来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，通过细菌培养，任选地与基因组分析组合来确定细菌的存在或不存在。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，基于对施用550mg利福昔明TID持续14天的患者的胃肠微生物群数据集的监督分类来确定所述平均反应者数目和平均无反应者数目。
实施例
应当理解，本发明不应解释为限于现在描述的实施例；相反，本发明应解释为包括本文提供的任何和所有应用以及普通技术人员的技术范围内的所有等效变化。
实施例1
一项研究，检查了在所有收集时间的粪便样品，在组成和多样性方面表征肠道微生物群。(图1显示了研究设计并定义了V3，V4，V6时间点)。在研究期间，受试者分别在基线和开放标签利福昔明550mg TID两周后提供粪便样品；在使用利福昔明550mg TID或安慰剂双盲再治疗两周之前和之后立即提供粪便样品，并在研究结束时提供粪便样品。将粪便样品在聚丙烯冷冻管中分成2-mL等分试样，在≤-20℃下在临床地点存储，在干冰上运输并且在≤-70℃下长期储存。
从粪便样品中分离细菌DNA，并使用利用Illumina HiSeq2000测序技术的两步PCR扩增16S rRNA基因的V4超变区。
设计测序反应，使得正向和反向配对的Illumina读数不重叠。正向和反向读数作为技术重复用独立分析处理。
通过两种方法分析序列。
OTU(操作分类单位)，其是具有平均97％同一性的序列簇。
测序样品数：
治疗2(V3) 101
治疗2结束(V4) 102
治疗3(V6) 69
治疗3结束(V7) 72
随访/研究结束 96
共有449个样品* 2个配对端
通过RDP pipeline以50％置信度归为每个分类水平的序列数
Figure DEST_PATH_IMAGE002
图2显示了具有449个样品2个配对端的排序图。根据就诊日期没有明显的聚类。
图3是根据反应者/无反应者状态的聚类。
在治疗之前，反应者具有比无反应者更低的多样性。减少的分类群是IBS的可能原因
在治疗期间，利福昔明主要通过影响低丰度分类群暂时抑制多样性。已经发现利福昔明在治疗IBS中是有效的。令人惊讶的是，我们已经发现了用于预测将从IBS的利福昔明治疗中获益的受试者的方法。
本文使用微生物群落的分析作为反应者状态的预测因子。
基于该研究，表1显示了根据分类群的平均反应者和无反应者数目。可以看出，当平均反应者数目高于平均无反应者数目确定为存在时，则受试者将对治疗反应。在某些实施方案中，如果表1中的分类群，其中平均反应者数目低于平均无反应者数目确定为不存在的，则受试者将对治疗反应。
因此，来自表1的这些分类群将来自V3数据的反应者与无反应者区分开。
表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
标记物通常具有相当低的丰度(参见图6)。使用监督分类以从V3数据区分反应者与无反应者。
在研究中，有数据显示微生物群落的长期恢复力。
实施例2
GI微生物群表征
在这项研究中，我们检查了研究群体的大约10％中在所有收集时间的粪便样品，并在组成和多样性方面表征肠道微生物群。
在研究期间，受试者在就诊3和4(分别在基线和开放标签利福昔明550mg TID两周[治疗2]后)，就诊6和7(在利福昔明550mg TID或安慰剂的双盲再治疗[治疗3]两周之前和之后立即)，和就诊11(研究结束)提供粪便样品。从粪便样品中分离细菌DNA，并使用利用Illumina HiSeq2000测序技术的两步PCR扩增16S rRNA基因的V4超变区。
设计测序反应，使得正向和反向配对的Illumina读数不重叠。因此，正向和反向读数将作为技术重复处理，并在我们的pipeline中进行独立分析，以确保我们的结论不依赖于利用16S rRNA基因的任何特定亚区。
除去所有非微生物序列，具有低质量评分的序列和与预期引物序列不具有精确匹配的序列。通过两种方法分析序列。程序AbundantOTU将被用于以不依赖于数据库的方式执行序列的从头聚类。
在IBS-D重复治疗研究TARGET 3中利福昔明对肠微生物群的影响通过两种方法评估：传统培养技术和在试验中从约100个随机选择的受试者收集的粪便样品的下一代基因测序。还从另外113个随机选择的受试者获得皮肤拭子，并培养葡萄球菌细菌。
使用下一代16S rRNA基因测序方法，我们从约100个随机选择的受试者在研究过程中收集的粪便样品产生约22亿个碱基对。数据显示，根据多样性(参见表2)和Bray-Curtis相似性(参见表3)量度，与采用单一疗程的利福昔明接着在试验剩余部分采用安慰剂的受试者相比，采用利福昔明重复疗程的受试者中的粪便微生物群没有受到干扰。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE008
培养和易感性试验的结果证明，没有证明表明在从粪便或皮肤拭子培养物生长的分离株中对非利福霉素抗生素的交叉抗性。利福昔明的重复治疗过程显示不会使患者对粪便或皮肤上潜在病原菌(例如艰难梭菌，肠球菌或葡萄球菌)的出现易感。考虑到在粪便中获得的高浓度的利福昔明，在一些正常菌群中观察到利福昔明最小抑制浓度(MIC，微生物对抗生素的敏感性的量度)的瞬时变化，但这些变化随时间可逆。在粪便样品中鉴定了非常少量的艰难梭菌分离株，该比率与一般群体中无症状携带者的文献报道一致，并且这些分离株中没有一个显示利福昔明抗性。
这是目前IBS患者中最全面的微生物组数据集，收集了超过20亿个数据点。纵向样品证明重复利福昔明给药的微生物组稳定性(参见图a)，并且在利福昔明重复使用时，对于潜在主要病原体的抗生素易感性的改变不明显。
实施例3
GI细菌培养和抗性
在本研究中，(参见图1的研究设计)，我们检查了研究群体中的在所有收集时间的粪便样品，并且我们还表征了粪便微生物群(包括革兰氏阴性杆菌和艰难梭菌)对临床重要的抗生素的易感性。如对于微生物群研究所述收集粪便样品。
将来自所选受试者的粪便等分试样接种到具有5％绵羊血液的胰蛋白酶大豆琼脂平板上以鉴定需氧生物体。将需氧板在34-36℃与5-7％CO2孵育24小时或在所需条件下孵育。将厌氧生物体的粪便等分试样接种到环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂或拟杆菌胆汁七叶苷琼脂上，用于选择艰难梭菌和拟杆菌种类。在厌氧条件下接种厌氧平板，并从粪便样品接种另外的样品。将厌氧平板在34-36℃下在厌氧条件(例如，厌氧室)下孵育48小时。
用受试者的标本将粪便样品接种在琼脂板的第一象限上。使用标准接种方法，将样品划线穿过琼脂平板的互连象限以分离细菌菌落。使用1+，2+，3+和4+的半定量标准评价琼脂平板的生长。标准关于接种的琼脂平板的四分位分法而定义。使用肉汤微量稀释法测试需氧分离株对一组抗生素的易感性。使用琼脂稀释法测试厌氧分离株对一组抗生素的易感性。
分离并测试抗菌素易感性的每种细菌被分组成更大类，即肠杆菌科，肠球菌科，拟杆菌科，葡萄球菌科，梭菌科或假单胞菌科。所研究的肠杆菌科包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，变形菌属，肠杆菌属和柠檬酸杆菌属的成员。通过就诊来汇编治疗组(双盲(DB)安慰剂，DB利福昔明，开放标签(OL)利福昔明)中每个受试者的MIC数据，以确定治疗群体的MIC范围。抑制≥50％的分离株的MIC浓度是群体的MIC50。MIC90值表示抑制≥90％群体的MIC值。
对于对特定细菌种类具有CLSI限定的分割点的所有抗生素(M100-S24)，使用那些分割点解释MIC值。然而，对于该分析，如果抗生素定义了敏感和中间类别，则两者都被分类为敏感的。如果没有为抗生素确定分割点，但抗生素产品标签指出了体外易感性的范围，则那些值用于分类MIC。在所有其它情况下，在MIC组中测试的最高稀释度或以上的MIC值被认为是抗性的，并且低于最高稀释度的MIC值被认为是敏感的。
从RFIB3053中测试的粪便样品中分离的细菌总结如下。
革兰氏阴性
大肠杆菌
克雷伯氏菌
假单胞菌属
肠杆菌属
沙雷氏菌属
变形杆菌属
拟杆菌属
革兰氏阳性
肠球菌属
葡萄球菌属
艰难梭菌
使用以下抗生素，通过肉汤微量稀释(对需氧细菌)和通过琼脂稀释(对厌氧细菌)进行敏感性测试：
利福昔明 - 厌氧菌
利福平 - 厌氧菌
万古霉素 - 厌氧菌
非达霉素-厌氧菌
甲硝唑 - 厌氧菌
利福昔明 - 需氧菌
利福平 - 需氧菌
头孢他啶 - 需氧菌
头孢曲松 - 需氧菌
环丙沙星 - 需氧菌
亚胺培南 - 需氧菌，
美罗培南 - 需氧菌，
哌拉西林/三唑巴坦 - 需氧菌
从分离的粪便培养物中分离的主要细菌家族是拟杆菌科(525个分离株，占总分离株的36.7％)，肠杆菌科(484个分离株，代表总分离株的33.9％)和肠球菌科(286个分离株，占总分离株的20％)。在各就诊中，不管治疗组，从粪便培养了22个艰难梭菌分离株。艰难梭菌占总培养细菌的1.5％。葡萄球菌分离株仅占总分离株的约6.4％。
在研究的OL期登记并接受治疗2的受试者在第1天总共有336个从粪便培养的分离株。肠杆菌科(124个分离株)和拟杆菌科(122个分离株)家族占分离株的大部分。在第1天，葡萄球菌占总分离株的18个(5.4％)。在第1天鉴定出艰难梭菌的四个分离株。该分离株比例在整个OL期保持一致，艰难梭菌和假单胞菌分离株是罕见的，并且在就诊中偶发培养。
在DB期的第1天，从登记在安慰剂组的受试者的粪便中鉴定出113个分离株，并且从登记在利福昔明治疗组中的受试者中鉴定出131个分离株。与OL期一样，来自拟杆菌科和肠杆菌科的细菌代表了两组中从粪便培养的大多数分离株。在第1天在安慰剂治疗的受试者中发现两种艰难梭菌分离株，在第1天随机化接受利福昔明的受试者中鉴定出4个艰难梭菌分离株。在用利福昔明或安慰剂治疗2周后，在2个治疗组中分离相似数目的细菌。在第2周，从安慰剂治疗的受试者的粪便中回收了2个艰难梭菌分离株，并从利福昔明治疗的受试者中回收了1个分离株。在整个随访期间，分离株的相对百分比与在第1天和第2周观察到的一致。在随访期间在利福昔明治疗的受试者中没有发现艰难梭菌分离株，而在随访期间从安慰剂治疗的受试者中培养5个艰难梭菌分离株。
从14个受试者中分离出7个酵母菌株，总共17个酵母分离株。总体上，酵母培养物代表从粪便分离的培养物的1.2％(1429个总培养物，包括细菌和酵母)。从利福昔明治疗前取得的治疗2样品培养4个分离株。只有一个受试者在多次就诊时分离了酵母。
在培养生物体的能力和对利福昔明，利福平和非利福霉素抗生素的易感性方面，本文所述研究中的利福昔明治疗显示出对粪便微生物群具有很小的影响。除了在治疗组中培养的生物体数目的一些微小变化外，利福昔明治疗没有出现过度生长。此外，存在从粪便培养的最少酵母分离株，符合正常的传播模式。
用从粪便培养的葡萄球菌分离株观察到利福昔明和利福平的MIC值的瞬时增加。在OL期的治疗2结束时和在DBR期的治疗3结束时观察到MIC的增加。在随访(其根据受试者返回的时间分组)中，葡萄球菌的MIC返回到基线，因为自从最后一次利福昔明治疗以来的时间增加。虽然利福昔明对某些物种(例如拟杆菌)的MIC50或MIC90有一些增加，但是增加均在基线时报告的MIC范围内。对于肠杆菌科，MIC50在RFIB3053中增加1至2倍稀释，快速恢复至基线易感性水平。这种在粪便中的快速恢复与来自粪便的利福昔明抗性细菌，特别是需氧细菌快速消失(其似乎迅速恢复)的报道一致。连同观察到的MIC的最小变化，从粪便培养的潜在病原体的数量没有增加。在粪便细菌对其它抗生素的易感性方面没有明显的治疗相关作用，鉴于利福昔明抗性的机制这是可以预期的。利福昔明和其它利福霉素抗生素是细菌RNA合成的抑制剂，其通过结合细菌DNA依赖性RNA聚合酶的β亚基而起作用。对利福霉素类的细菌抗性的已知机制，编码聚合酶的基因的突变是染色体介导的，而不是质粒介导的。已知突变在rpoB基因的两个特异性位点中以最高频率发生，并导致抗性但次最佳功能的酶。因此，对其它抗生素类的交叉抗性受到质粒转移缺乏的限制，并且利福昔明具有低的将抗性扩散至非利福霉素抗生素的风险。
在本文所述的研究中，在来自粪便样品的培养物中仅鉴定了对葡萄球菌物种的瞬时抗性，并且未观察到对非利福霉素抗生素的交叉抗性。当利福昔明治疗停止时，利福昔明和利福平的MIC值的瞬时增加迅速恢复，支持没有药物压力下的缺乏突变适应性的证据。对于在粪便中培养的任何细菌，没有证据表明利福昔明介导的对任何测试的非利福霉素抗生素的交叉抗性。此外，虽然在粪便中培养的葡萄球菌的MIC瞬时增加，但它们随时间可逆。其它细菌的敏感性似乎不受利福昔明治疗的影响。在IBS患者中使用利福昔明单次或重复治疗疗程后没有增加的感染率，这与利福昔明用于治疗IBS的长期安全性和功效一致。
利福昔明治疗导致针对葡萄球菌的MIC瞬时增加。这种MIC增加在利福昔明治疗中断后迅速恢复，因此不能长期维持。换句话说，利福昔明对微生物对其或其它抗生素的易感性不具有长期效应。令人惊讶地发现，在重复治疗中利福平MIC和MIC的变化与利福昔明的相当。总体而言，在研究的OL和DB期，利福平具有MIC的瞬时升高和对细菌例如葡萄球菌的抗性，该抗性在中断利福昔明治疗时恢复。没有观察到与其它抗生素的模式。
本文提供的是来自3期研究的粪便培养物和抗生素易感性数据的预期评估。该数据证明，总体上没有证据表明，与从受试者培养的粪便样品中的安慰剂相比，病原体(例如艰难梭菌)的水平增加。所有培养的艰难梭菌在易感性试验期间对利福昔明高度敏感。没有证据表明，对于在粪便中培养的任何细菌，利福昔明介导的对测试的任何非利福霉素抗生素的交叉抗性。尽管在粪便中培养的葡萄球菌的利福昔明最小抑制浓度暂时增加，但它们随时间可逆。其它细菌的敏感性不受利福昔明治疗的影响。
令人惊讶地发现，利福昔明的重复治疗过程不会使患者对粪便的潜在病原菌(例如艰难梭菌，肠球菌或葡萄球菌)的出现易感。在粪便样品中鉴定了非常少量的艰难梭菌分离株，该比率与一般群体中无症状携带者的文献报道一致，并且这些分离株中没有一个显示利福昔明抗性。考虑到在粪便中获得的高浓度的利福昔明，在一些正常菌群中观察到利福昔明最小抑制浓度(MIC，微生物对抗生素的敏感性的量度)的瞬时变化，但这些变化随时间可逆。
实施例4
皮肤拭子
在这项伴随腹泻的肠易激综合征(IBS-D)患者的研究中，我们描述了来自IBS-D患者的皮肤拭子样品培养的葡萄球菌菌株的生长和抗生素易感性。
对于皮肤拭子研究，在以下每次就诊时对受试者亚群(约10％的研究群体)进行皮肤拭子收集：就诊3和4(分别在基线和开放标签利福昔明550mg TID两周[治疗2]后)，就诊6和7(在利福昔明550mg TID或安慰剂的双盲再治疗[治疗3]两周之前和之后立即)，和就诊11(研究结束)。对于本研究中的每个受试者，从直肠周围，鼻孔，手掌和前臂收集皮肤拭子，并且将拭子在含有介质的管中在环境温度下立即运送到微生物学实验室。进行皮肤拭子培养以分离所有葡萄球菌种类。
在开放标签(OL)利福昔明期间(治疗2)，所有受试者接受利福昔明。对利福昔明治疗反应的受试者有资格参加本研究的双盲(DB)再治疗期。为了评估利福昔明单次治疗的效果而没有潜在再治疗的并发症，对于参与研究的DB期的受试者，来自治疗3开始的其皮肤拭子样品用作研究的开放标签期的“研究结束”样品。
将参与研究的DB期的受试者随机化以接受利福昔明或安慰剂。在治疗3就诊，EOT3就诊和EOS就诊时比较受试者。
使用以下程序收集拭子：
•左下臂和右下臂的皮肤：下臂用单个棉签擦拭，总共用大约10次擦拭。使棉签随着每次擦拭旋转，使得棉签的所有侧面暴露于皮肤。一个棉签用于各手臂。
•手掌：手的整个手掌被擦拭，旋转棉签，使所有侧面暴露于皮肤。两个手掌都用相同的棉签擦拭。
•鼻孔：将棉签的尖端小心地插入每个鼻孔，并旋转两次。注意确保棉签没有深插入到鼻孔中，因为棉签仅用于对外部鼻孔取样。对于每个鼻孔，棉签没有插入超过约¼英寸。使用相同的棉签对两个鼻孔取样。
•直肠周围：将棉签在直肠区域周围用力擦拭，并且随着每次擦拭旋转，以确保棉签的所有侧面暴露于皮肤。棉签没有插入直肠，并且仅在直肠的外侧周围擦拭。
在微生物学实验室收到时，将每个皮肤拭子涂布在含有5％绵羊血液的胰蛋白酶大豆琼脂和具有5％绵羊血液的Columbia-粘菌素萘啶酸琼脂上，以选择革兰氏阳性菌落。将样品拭子接种在琼脂平板的第一象限上。使用标准接种方法，将样品划线穿过琼脂平板的互连象限以分离细菌菌落。将接种的平板在35℃下在5-7％CO2培养箱中培养，在24和48小时检查平板中的细菌生长。使用1+，2+，3+和4+的半定量标准评价琼脂平板的生长。标准结合接种的琼脂平板的四分位分法而定义。
皮肤拭子分离株的培养和易感性试验
使用肉汤微量稀释法测试葡萄球菌分离株对一组抗生素的易感性。对于最小抑制浓度(MIC)测定，从继代培养平板中选择约3至5个分离的菌落以产生根据CLSI指南接近0.5McFarland标准品的悬浮液。在接种孵育平板之前立即制备细菌悬浮液。
制备抗生素储液，然后稀释到阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤中。将每个测试平板在35±1℃下在CO2中孵育合适的时间量。质量控制菌株包括在适当的测试平板中。每个样品运行包括纯度对照平板和阳性和阴性生长对照。
使用以下抗生素通过肉汤微量稀释进行敏感性测试：
利福昔明
利福平
头孢他啶
头孢曲松
头孢噻吩
环丙沙星
亚胺培南
美罗培南
哌拉西林
三唑巴坦
甲氧苄啶
磺胺甲噁唑
万古霉素
在研究的OL期中，从参与皮肤拭子研究的受试者(113个受试者)收集的皮肤拭子中鉴定了1115个葡萄球菌分离株。在治疗2就诊(第1天)，在OL利福昔明开始前，培养373个分离株，并在EOT2就诊(第2周)，培养336个葡萄球菌分离株。从皮肤拭子中鉴定的葡萄球菌最丰富的种是表皮葡萄球菌(S. epidermidis)，占总分离株计数的55％。在研究的OL期中鉴定了总共52个金黄色葡萄球菌(S. aureus)分离株(在OL期中所有分离株的4.7％)。在这些分离株中，在第1天培养22个，在第2周培养11个，在随访期间培养剩余的19个。关于位置，各次就诊的大多数分离株从鼻孔和直肠周围皮肤培养。
在研究的双盲(DB)重复治疗期中，从随机接受安慰剂的12名受试者中培养171个葡萄球菌分离株，并从随机接受利福昔明的18名受试者中培养208个葡萄球菌分离株。从安慰剂治疗的受试者中鉴定出81个表皮葡萄球菌分离株和9个金黄色葡萄球菌分离株，以及从利福昔明治疗的受试者中鉴定114个表皮葡萄球菌分离株和17个金黄色葡萄球菌分离株。关于位置，各次就诊的大多数分离株从鼻孔和直肠周围皮肤培养。
利福昔明的MIC分析
仅参与研究的OL期并且仅接受治疗2的受试者具有在治疗2就诊(第1天)培养的总共373个葡萄球菌分离株。治疗2的葡萄球菌分离株的利福昔明MIC50值为0.015μg/ mL，MIC90值为0.03μg/ mL。在EOT2就诊时(第2周)，利福昔明的MIC50为0.015μg/ mL，但是MIC90值增加至32μg/ mL。在第2周就诊时，MIC值的总体范围更宽，从≤0.001μg/ mL至128μg/mL。对于在第7周和第32周之间发生的OL最后一次评估就诊，利福昔明的MIC90值从第7周至第10周期间的2μg/ mL降低至从第11周开始的0.03μg/ mL的MIC90值。随着除去利福昔明治疗的时间推移，MIC浓度范围变得更窄，观察到最大MIC浓度从64μg/ mL降至0.06μg/ mL。
在DB期的第1天(治疗3)，从随机化接受参与皮肤拭子研究的安慰剂的12名受试者中回收48个葡萄球菌分离株，利福昔明MIC50值为0.015μg/ mL，MIC90值为0.03μg/mL。这些值在整个研究的其余部分保持一致，表明利福昔明治疗对葡萄球菌分离株对利福昔明的易感性没有长期影响。第1天的MIC范围很宽(≤0.001μg/ mL至64μg/ mL)，这至少部分是由于以下事实：受试者先前在OL治疗2中用利福昔明治疗，并且在葡萄球菌分离株完全恢复到预治疗易感性之前可能已经参与DB治疗3。对于所有DL最后一次评估就诊(发生在第11周和第38周之间)，利福昔明的MIC范围变窄(0.004μg/ mL至0.06μg/ mL)。
对于在研究的DB期(18名受试者)中随机接受利福昔明的皮肤拭子受试者，在第1天，初始MIC50和MIC90值分别为0.015μg/ mL和0.03μg/ mL，显示与安慰剂治疗组没有差异。在EOT3就诊时(第2周)，利福昔明的MIC90值为32μg/ mL。对DB最后一次评估就诊，MIC50值保持低(0.015至0.06μg/ mL)，而MIC90保持升高。对于在第11周和第14周之间取样的受试者，MIC90为64μg/ mL。在第15周至第22周之间，MIC90值降低至0.5μg/ mL，并且对于在第23周和第38周之间取样的受试者，MIC90值为0.06μg/ mL。在接受多达三次利福昔明治疗后，葡萄球菌分离株不表现出利福昔明MIC值的持续升高。
利福平的MIC分析
基于CLSI定义的葡萄球菌分割点分析利福平MIC，其中MIC≥4μg/ mL被认为是抗性的。为了分析的目的，所有MIC值<4μg/ mL被认为对利福平敏感。在使用利福昔明治疗之前，参与研究的OL期的受试者在治疗2的第1天具有≤0.015-0.12μg/ mL的MIC范围，在治疗2就诊时的MIC50和MIC90≤0.015μg/ mL。在使用利福昔明治疗后，在第2周，有39个分离株的MIC值≥4μg/ mL，297个分离株的MIC值<4μg/ mL。利福平抗性分离株主要位于直肠周围(32个抗性分离株)，且4个抗性分离株从手掌培养和3个抗性分离株从左下臂拭子培养。EOT2的MIC50≤0.015μg/ mL，MIC90为16μg/ mL。在第7周和第32周之间发生的OL最后一次评估就诊中，总共406个葡萄球菌分离株中的16个具有≥4μg/ mL的利福平MIC值。在第7至10周期间，利福平的MIC90为0.5μg/ mL，从第11周起降低至≤0.015μg/ mL。在第7周至第10周之间从皮肤拭子样品中分离出7个利福平抗性分离株(9.5％的分离株)，且大多数抗性分离株定位于直肠周围。在第11周和第14周之间，从皮肤拭子培养7个抗性分离株(2.8％的分离株)。在第15周至第32周的皮肤拭子样品中未观察到利福平抗性分离株。
在DB期接受安慰剂治疗的受试者在从第1天(治疗3)到DB最后一次评估就诊的所有就诊中具有≤0.015μg/ mL的利福平MIC50和MIC90值。与利福昔明一样，在第1天和第2周就诊时，利福平的最大观察到的MIC值升高，这可能归因于在DB期随机化之前没有完全返回易感水平。对于安慰剂治疗的受试者，在治疗期间有3个利福平抗性分离株：第1天的1个分离株和第2周的2个分离株，全部来自直肠周围。
对于其它抗生素，不管治疗组(OL利福昔明，DB安慰剂或DB利福昔明)，RFIB3053MIC变化没有模式。一些葡萄球菌分离株显示对抗生素(例如环丙沙星)的低水平抗性，其对随时间的利福昔明治疗没有实质性改变。
用利福昔明单次和重复治疗观察到利福昔明和利福平的MIC的瞬时变化。MIC的增加在长时间内不持续，并且受试者在研究结束时具有返回到易感水平的皮肤葡萄球菌菌群。大多数抗性分离株在直肠周围发现，在手前臂，手掌或鼻孔上具有最少的抗性分离株。
其它测试的抗生素没有显示可能由利福昔明治疗引起的MIC变化。
培养和易感性试验的结果证明，没有证据表明从粪便或皮肤拭子培养物生长的分离株中对非利福霉素抗生素的交叉抗性。利福昔明的重复治疗过程显示出不会使患者对皮肤上潜在致病性葡萄球菌菌株的出现易感。
利福昔明的重复治疗过程显示出不会使患者对粪便或皮肤上潜在病原菌(例如艰难梭菌，肠球菌或葡萄球菌)的出现易感。在粪便样品中鉴定了非常少量的艰难梭菌分离株，该比率与一般群体中无症状携带者的文献报道一致，并且这些分离株中没有一个显示利福昔明抗性。考虑到在粪便中获得的高浓度的利福昔明，在一些正常菌群中观察到利福昔明最小抑制浓度(MIC，微生物对抗生素的敏感性的量度)的瞬时变化，但这些变化随时间可逆。
总的来说，来自皮肤拭子培养物的数据表明用利福昔明治疗不导致临床上显著的抗生素抗性。没有观察到与其它测试的抗生素的交叉抗性。利福昔明或利福平的MIC50值没有变化。观察到利福昔明和利福平对于葡萄球菌分离株的MIC90值的瞬时变化，并且在研究结束时观察到回到基线值。这些瞬时变化预期不会导致对临床实践的干扰，因为利福昔明和利福平都不是葡萄球菌感染的一线治疗。此外，在研究的OL或DB期中没有观察到金黄色葡萄球菌分离株的数量增加，并且没有金黄色葡萄球菌分离株显示对利福昔明或利福平的抗性。
实施例5
研究设计
3期试验的整体研究设计如图1所示。
受试者进入筛选/治疗1期，其包括10(±3)天治疗，在此期间受试者接受单盲安慰剂TID并完成每天症状日记。筛选/治疗1期后，合格的受试者进入治疗2期，并接受开放标签的利福昔明550mg TID持续2周，伴随4周无治疗的随访。在治疗2期结束时，在4周随访期间的至少2周期间实现IBS相关腹痛和粪便稠度两者的治疗成功的受试者被分类为反应者，并进入无治疗的维持期1。治疗2期中的无反应者从研究中撤出，以提供对利福昔明治疗反应的受试者的富集群体。
无治疗的维持期1随时间变化(总共最长达18周)，并且取决于症状复发的时间。在维持期1结束时未满足复发标准的受试者从研究中撤出。
复发的受试者进入治疗3期，也称为双盲(DB)重复治疗期。在该期，受试者以1：1随机接受利福昔明550mg TID或安慰剂TID持续2周，伴随4周无治疗的随访。然后来自治疗3期的所有受试者进入6周维持期(维持期2)。来自维持期2的所有受试者然后进入第二重复治疗(SRT)期(即，治疗期4)，其中他们接受与之前在治疗3期(利福昔明550mg TID或安慰剂TID)中指定的治疗相同的治疗2周，伴随4周无治疗的随访。在SRT期结束后，所有受试者接受额外的4周，无治疗的随访，以研究结束(EOS)就诊作为终止。
在图1中，粪便收集时间点以深灰色方框表示。参与RFIB3053的所有受试者在治疗2(T2)就诊，治疗2结束(EOT2)就诊，治疗3(T3)就诊，EOT 3就诊和研究结束(EOS)就诊提供粪便样品。随访期对于受试者而言是可变的；因此，为了数据分析和解释的目的，随访被分为4周，以确定是否对葡萄球菌分离株的抗生素易感性在时间上有影响。此外，如果受试者具有症状的复发并且参与研究的DB期，则将治疗3就诊视为OL治疗期的最终就诊。治疗3就诊也作为参与研究的DB期的受试者的DB基线就诊。
16S rRNA基因测序：
冷冻运送来自所选受试者的粪便等分试样用于基因组测序。在测试时解冻样品。从粪便中提取DNA。使用下一代测序技术(Illumina HiSeq2500)来测序16S核糖体RNA的V4区。为此，使用F515(正向)：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和R806 (反向)：
GGACTACHVGGGTWTCTAAT引物(17)，扩增286个碱基对(bp)区。
首先使用Illumina的适配器信息对数据进行多路分配，然后进行第二轮多路分配。
随机选择总共103个受试者以包括在粪便微生物群分析中。中位年龄为48.0岁(最低，最高：19,85岁)，大多数受试者为白人(82.5％)，大多数为女性(73.8％)。这些受试者中总共73位参与了研究的双盲期：安慰剂组36位，利福昔明组37位。安慰剂和利福昔明受试者在人口统计学特征方面通常相似。
从所选粪便样品中产生总共约46亿个(约22亿x 2个配对端)序列。该分析基于在来自非重叠配对端的50％阈值处具有匹配的RDP(核糖体数据库项目)家族调用的大约19亿次读数。从随机选择的受试者中鉴定出172个独立科。为了集中在具有潜在临床相关性的分类群，从该172个科中鉴定分类群的子集，其包括从相同受试者培养的细菌科，通过测序方法将其鉴定为在IBS中被扰乱的细菌科，以及在3期研究过程中显示被改变的细菌科(表4)。该列表还包括含有已知病原体的细菌科。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
丰富度，多样性和相似性分析：
使用Shannon多样性指数来确定每次就诊时粪便微生物群的多样性(其不仅考虑存在的细菌科的数目，而且还考虑那些科的相对丰度)。在研究的OL期使用利福昔明治疗的粪便微生物群的多样性没有显著变化。
此外，在研究的OL期每次就诊时评估微生物群的均匀性。微生物群的均匀性不受利福昔明治疗的影响，仅在基线后就诊时微生物群的整体均匀性有微小的变化。
微生物群的丰富度，反映在粪便微生物群中观察到的细菌科的数量的量度，显示出在OL期中从治疗前基线至第2周稍微降低，这对应于利福昔明的治疗期(图11)。从基线到第2周，丰富度降低了1.235个科。在两周OL利福昔明治疗结束后的随访期间，丰富度被归一化为基线水平。图11显示提供数据的视觉印象，而图12显示在OL期第2周和随访期间自基线的变化。
对于从粪便微生物群测序的细菌科，在研究的OL期从受试者测序的最丰富的科如下：氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)，拟杆菌科(Bacteroidaceae)，双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)，科里氏杆菌科(Coriobacteriaceae)，肠球菌科(Enterococcaceae)，毛螺菌科(Lachnospiraceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，理研菌科(Rikenellaceae)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，韦荣球菌科(Veillonellaceae)和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)。这十一(11)个细菌科代表研究的OL期的第1天的读数的约90％。与第1天相比，就观察到在第2周(开放标签利福昔明治疗两周后立即)减少的细菌科而言，在第1天代表约2.0％的群体的双歧杆菌科在丰度上减少12％至49％。在第1天代表总群体的约14％的拟杆菌科在第2周时丰度增加1％至66％。重要的是注意到，一些细菌科例如乳杆菌科在研究的OL期中从第1天到第2周具有统计学显著的变化，但是具有低丰度，因此对整个群落结构具有较小的贡献。同样地，乳杆菌科在第2周减少8％至51％，但总体上代表测序群体的0.2％。因此，不仅要考虑每个科观察到的变化，而且还要考虑其对整个粪便微生物群的定量贡献。
双盲期的丰富度，多样性和相似性分析：
在研究的DB期的基线，在随机化接受安慰剂或利福昔明之前，DB安慰剂和DB利福昔明组的Shannon多样性相似，分别为1.733和1.786。在2周治疗期后，安慰剂组的Shannon多样性为1.743，DB利福昔明组为1.698，治疗之间没有显著差异(p值= 0.4335)。在随访期间，Shannon多样性基本保持不变，在治疗组之间没有统计学显著差异。
在研究的DB期，通过利福昔明或安慰剂治疗，微生物群中的均匀性的量度也没有改变。在治疗组内或治疗组之间没有观察到微生物群的均匀性的显著变化。
在研究的DB期，微生物群的丰富度被利福昔明治疗瞬时地影响。在用DB安慰剂治疗的受试者中微生物群的丰富度保持不变(图13)，而在利福昔明治疗的受试者中在第2周丰富度降低(对于利福昔明治疗组从基线到第2周的变化，p = 0.0331，而在第2周比较安慰剂与利福昔明治疗的受试者p = 0.0224)。在随访期间，利福昔明治疗引起的下降的丰富性逆转，并且在随访期间在任何就诊时安慰剂或利福昔明治疗的受试者的微生物群的丰富度没有显著差异(图14)。
关于从粪便微生物群测序的细菌科，在研究的DB期从受试者测序的最丰富的细菌科如下：氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)，拟杆菌科(Bacteroidaceae)，双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)，科里氏杆菌科(Coriobacteriaceae)，肠球菌科(Enterococcaceae)，毛螺菌科(Lachnospiraceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，理研菌科(Rikenellaceae)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，韦荣球菌科(Veillonellaceae)和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)。在研究的DB期的第1天，这11个细菌科代表安慰剂组和利福昔明组的读数的约90％。
如在研究的DB期，在几个细菌科中从基线到第2周治疗结束有变化，但是如在OL期中，许多这些变化发生在低丰度科中。在DB安慰剂组和DB利福昔明组中的变化是明显的。用利福昔明治疗的受试者中一些科的变化可能与利福昔明的抗菌活性相关，如在第2周时降低35％至88％(p值= 0.004)的梭菌科1科所观察到的。该科在安慰剂和利福昔明治疗的受试者中代表约0.2％的序列。利福昔明已显示对梭菌科中的物种具有有效的体外抗菌活性。该科的丰度恢复到随访期的基线。与在第2周用安慰剂治疗的受试者的样品相比，在梭菌科中观察到的减少不显著(p值= 0.062)。总体而言，低丰度类群显示利福昔明治疗的一些影响，但是改变是短暂的，并且在研究结束时恢复。
随机进行双盲治疗的受试者中的粪便微生物群的微生物丰富度的分析：
在随机化到研究的DB期以接受利福昔明(37名受试者)或安慰剂(36名受试者)的受试者中研究在RFIB3053的OL和DB两期过程中微生物丰富度的变化。在研究的OL期中接受利福昔明的DB安慰剂治疗的受试者在OL期的第2周显示丰富度减少，其在DB期的开始恢复(图15)。此外，丰富度在OL期的开始和DB期的结束时是类似的。
对于接受DB利福昔明的受试者，在OL第2周和DB第2周均观察到丰富度的减少，对应于各利福昔明治疗的结束(图16)。两种治疗后丰富度恢复，表明使用利福昔明单次或重复治疗后，不发生细菌分类群的长期抑制。利福昔明治疗对安慰剂和利福昔明治疗的IBS-D受试者之间的Shannon多样性或均匀性没有显著影响，并且导致微生物群丰富度的瞬时变化。这些在丰富度方面的减少在利福昔明治疗过程结束后恢复。在受利福昔明治疗影响的细菌科中，16S rRNA基因的测序显示低丰度分类群比更丰富分类群更受利福昔明治疗的影响。总的来说，与使用单一疗程的开放标签利福昔明，然后是双盲安慰剂的受试者相比，在使用利福昔明重复治疗期间，在受试者中未观察到粪便微生物群的干扰。
Figure IDA0001202530830000011

Claims (4)

1.利福昔明在制备用于患有腹泻型IBS的受试者的药剂组合物中的用途，其中所述受试者的特征在于所述受试者的胃肠(GI)道的细菌群中存在选自鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)的一个或多个细菌分类群，其中所述受试者的GI道的细菌群中存在所述一个或多个细菌分类群是通过下述确定：
分析受试者粪便中存在的细菌的16S rRNA基因的V4超变区；和
确定细菌的身份，其中所述一个或多个细菌分类群存在于所述受试者的GI道中。
2.权利要求1的用途，其中属于分类群鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)的细菌存在。
3.权利要求1的用途，其中属于分类群叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)的细菌存在。
4.权利要求1的用途，其中属于分类群黄杆菌科(Flavobacteriaceae)的细菌存在。
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