CN106793970B - 用于诊断及治疗的纳米载剂及其加工 - Google Patents

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Abstract

本发明组合物和方法提供组织优先靶向以输送治疗剂或诊断剂的组合物和方法。例如，这些化合物可用于处置影响接合关节的关节病症如损伤诱发的骨关节炎，以及影响关节组织的自体免疫疾病如类风湿性关节炎。

Description

用于诊断及治疗的纳米载剂及其加工
相关申请
基于35U.S.C.§119(e)，本申请主张2015年2月6日提交的美国专利临时申请案US62/113,335和2014年3月14日提交的美国专利临时申请案US 61/953,495的优先权，上述两件临时申请案通过引用而整体并入本文。
政府权益声明
本发明在美国国立卫生研究院(NIH)和美国国家研究资源中心(NCRR)给予的1P20RR024484以及NIH和美国国立综合医学研究所(NIGMS)给予的P20GM104937下由政府支持完成。联邦政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于输送剂至细胞内或身体组织内的纳米颗粒。
背景技术
尽管已有使用纳米技术输送药物的制程的记录，仍存在若干挑战，尤其是关于靶向及毒性的挑战。目前的输送系统受困于显着障碍，如低靶向效率。造成这些缺点的主要原因是组织具有细胞外间质。
发明内容
本发明的组合物和方法提供使用纳米技术进行选择性输送中存在已久的挑战的解决方法。据此，本发明提出化合物、这些化合物的组装体、系统、或将包含纳米颗粒的药物选择性输送至任何身体组织(包括那些包括细胞外间质组织的组织)的方法。纳米颗粒如玫瑰形纳米件、脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒组合物，包含舱化合物，其中，在pH 7至7.5荷正电的纳米颗粒和带净负电荷(net negative charge)的舱络合物组合物集中在或渗透入带负电的组织，或者，在pH 7至7.5带负电(或带弱正电荷)的纳米颗粒和带净负电荷(或带弱正电)的舱络合物组合物集中在或渗透入带正电的组织。“带负电”指电动电势(zetapotential)小于等于0毫伏特(mV)(其为减“-”mV)。“带正电”指电动电势大于等于0毫伏特(mV)(其为加“+”mV)。“带弱正电荷”指电动电势为0mV至+30mV。纳米颗粒被调整为优先集中至靶标身体组织并将其舱输送至该靶标身体组织。例如，带相对负电荷的纳米颗粒被用来优先集中至、蓄积于、及/或渗透入荷正电的组织；带相对正电荷的纳米颗粒被用来优先集中至、蓄积于、及/或渗透入荷负电的组织。例如，与不含纳米颗粒的舱的集中/输送水平相比，含有纳米件的舱在靶向组织的集中度高至少10％、20％、50％、75％、2倍、5倍、8倍、10倍或更多。因此，该纳米件选择性集中至所希望的身体组织并将舱输送至该处。
所输送的药物或剂包含诊断试剂或治疗化合物。一个实施例中，净正电荷包含+0mV至+60mV范围内(如，0.1mV、1、5、10、20、30、45、60mV)的电动电势；例示性荷负电的组织包括软骨组织或软骨细胞。另一实施例中，使用包含电动电势在-60mV至+30mV范围内(如，-60、-50、-40、-30、-20、-10、1、10、20、30mV)的电荷来选择性或优先以带正电的组织为靶向；例示性荷正电的组织包括神经元组织或神经元。
又，本发明中提出用于将包含纳米颗粒组合物的药物选择性输送至身体组织的系统，该纳米颗粒组合物包含舱化合物，且该组合物的尺寸作成集中在或渗透入靶标组织。该纳米颗粒的至少一个维度为至少0.1纳米(nm)。例如，至少一个维度上尺寸为≤150nm(如，0.1、10、25、50、75、100、125、150nm)的纳米颗粒集中在或渗透入滑膜、眼组织、皮肤组织、粘膜组织、或肺组织，至少一个维度上尺寸为≤100nm(e.g.,0.1、10、25、50、75、100nm)的纳米颗粒集中在或渗透入肾组织，或至少一个维度上尺寸为≤30nm(0.1、2、5、10、20、25、30nm)的纳米颗粒集中在或渗透入心组织。至少一个维度上尺寸为≤90nm(0.1、2、5、10、25、50、75、80、90nm)的纳米颗粒集中在或渗透入具有炎症或缺陷的软骨，而至少一维度上尺寸为≤30nm(0.1、2、5、10、20、25、30nm)的纳米颗粒集中在或渗透入健康、完整的软骨。
该系统或方法包括对那些影响关节接合的关节病变的处置，该关节病变如损伤诱发的骨关节炎以及影响关节组织的自体免疫疾病如类风湿性关节炎。本发明的组合物和方法进一步提供在处置影响身体内上皮组织、结缔组织、肌肉组织及/或神经组织的疾病及/或病变中存在已久的挑战的解决方法。本发明提供使用玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分将治疗剂或诊断剂引入细胞或组织或组织基质中的方法。本公开的具体实施例包括一种或多种剂如治疗剂或诊断剂与玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分的复合物、络合物或组合的形成，其中，该一种或多种剂接合至或键结至该玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分。本公开的具体实施例进一步指向通过下述进程作成的产物：将本文中揭示的玫瑰形纳米管或形成本文中揭示的玫瑰形纳米管的模块与一种或多种剂在水性介质中混合在一起，混合条件为造成该玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分与该一种或多种剂组合在一起以在水性介质中形成络合物或组合，其中，该一种或多种剂通过位阻力、离子力、或其它力接合至或键结至该玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分。根据一方面，该一种或多种剂通过非共价力键结。
该纳米件组合物自纳米管作成，该纳米管自可自组装的末端如包含式I的化合物(模块I)或包含式II的化合物(模块II)作成。根据本公开的纳米管包括下式I的化合物：
Figure GDA0001238979400000031
其中，X为CH或氮；n是整数1、2、3、或4；R2为氢或链结基如(CH2)n或本文中揭示的其它链结基；当R2为氢时Y不存在，或者Y为具有共价键结至氨基酸α-碳的胺基的氨基酸或多肽，且该胺基共价键结至该链结基R2；以及，R1为氢或脂肪族部分如烷基，直链或支链，饱和或不饱和；及其盐。R1优选为C1至C10烷基、C1至C5烷基、C1至C3烷基、或甲基。例如，式(I)化合物的一个子集包括其中X为氮的那些化合物。另一实施例中，式(I)化合物的一个子集包括其中(CH2)n为链结基的那些化合物。另一具体实施例中，式(I)化合物的一个子集包括其中(CH2)n为链结基且n为2的那些化合物。另一实施例中，式(I)化合物的一个子集包括其中Y为选自赖氨酸、精氨酸及组氨酸的氨基酸的那些化合物。另一具体实施例中，式(I)化合物的一个子集包括其中X为氮、(CH2)n为链结基、n为2、且Y为选自赖氨酸、精氨酸及组氨酸的氨基酸的那些化合物。
本发明范畴内的化合物包括那些Y基团可通过氨基酸或多肽的胺基或羧基连接至链结基的化合物。例示性链结基显示于下式中。
Figure GDA0001238979400000041
式I范畴内的例示性模块连同纳米管的示意图和从该临时性模块形成的纳米管的影像一起显示于图1中。
供选择的链结基R2可将Y基团通过该氨基酸或多肽的胺基或羧基结合至该(CH2)n基团的碳或N原子。
本公开范畴内供选择的R2基团选自包含下列的组：
Figure GDA0001238979400000051
，其中，Y不存在。
式I化合物可通过单独使用通过引用并入本文的US 6,696,565中揭示的方法制备，或通过将该方法与该领域技术人员已知的方法合用而制备。额外的描述提供于US 8,795,691及/或US 20140171482(USSN13/977,138)中，上述各专利通过引用而并入本文。玫瑰形纳米管通过式(I)化合物的组装而作成。
例示性式I化合物显示如下：
Figure GDA0001238979400000052
根据本公开的模块也包括下式II的化合物：
Figure GDA0001238979400000061
其中，X为CH或氮；R2为氢或链结基如(CH2)n，其中，n为整数1、2、3、或4，或R2为(CH2)3CO、本文中揭示的其它链结基；当R2为氢时Y不存在，或Y为具有共价键结至该氨基酸α-碳的胺基的氨基酸或多肽，且该胺基共价键结至该链结基R2；以及，R1为氢或脂肪族部分如烷基，直链或支链，饱和或不饱和；及其盐。例如，式(II)化合物的一个子集包括其中X为氮的那些化合物。另一实例中，式(II)化合物的一个子集包括其中(CH2)n为链结基的那些化合物。另一具体实施例中，式(II)化合物的一个子集包括其中(CH2)n为链结基且n为2的那些化合物。另一实施例中，式(II)化合物的一个子集包括其中Y为选自赖氨酸、精氨酸及组氨酸的氨基酸的那些化合物。另一具体实施例中，式(II)化合物的一个子集包括其中X为氮、(CH2)n为链结基、n为2且Y为选自赖氨酸、精氨酸及组氨酸的氨基酸的那些化合物。
R1优选为C1至C10烷基、C1至C5烷基、C1至C3烷基、或甲基。例示性链结基显示于下式中。
Figure GDA0001238979400000071
本公开范畴内的化合物包括其中Y基团可通过氨基酸或多肽的胺基或羧基连接至该链结基的那些化合物。本公开范畴内供选择的R2基团选自包含下列的组：
Figure GDA0001238979400000072
，其中，Y不存在。TBL结构通过式(II)化合物的组装作成。
例示性式II化合物显示如下：
Figure GDA0001238979400000081
一些具体实施例中，式II化合物包含氨基酸官能团构造。这些化合物含有天然氨基酸侧链中存在的官能团，或可含有整个氨基酸侧链。例如，赖氨酸官能团构造含有整个氨基酸侧链官能度(-CH2CH2CH2CH2NH3 +)，而组氨酸官能团构造含有整个侧链或仅含有组氨酸中存在的杂芳基咪唑基团。
一些具体实施例中，式II化合物包含氨基酸构造。这些化合物含有整个氨基酸或可含有经修饰的及/或非天然氨基酸。例如，赖氨酸氨基酸类似物含有赖氨酸的整个氨基酸官能度，而组氨酸氨基酸构造含有经修饰的组氨酸氨基酸。
一些具体实施例中，式II化合物优于式I化合物。
一些具体实施例中，式II化合物为赖氨酸官能团构造
Figure GDA0001238979400000091
一些具体实施例中，该纳米颗粒自脂质组分及/或聚合物组分构建。
此等模块的三维示意图显示于图65中。具体实施例进一步包括将该复合物输送至活体细胞内。具体实施例进一步包括处置需要进行处置的个体的方法，该方法包含将玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分的络合物以及一种或多种治疗剂以将该络合物引入细该个体的细胞或组织内的方式给药至该个体。具体实施例进一步包括诊断需要进行诊断的个体的方法，该方法包含将玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分的络合物以及一种或多种诊断剂以将该络合物引入该给他的细胞或组织内的方式给药至该个体。
玫瑰形纳米管或RNT包括自具有成对基础的模块形成的具链结基或TBL的纳米管。本文中，此等玫瑰形纳米管可指代为“TBL”。根据这一方面，该剂被输送至细胞内。根据一方面，该剂在玫瑰形纳米管进入该细胞后从玫瑰形纳米管中释放。根据额外的方面，该剂保持为结合至、键结至该玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分，或与该玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分络合或组合。
脂质纳米颗粒包含脂质芯和表面活性剂，其中，该脂质芯可包括脂肪酸、丙烯酰基甘油、甾体、蜡、将上述全部的混合物；而表面活性剂可含有带正电的氨基酸、带负电的磷酸盐或羧酸。根据一方面，通过将可自组装的玫瑰形纳米管的模块与一种或多种剂于介质中组合而制造络合物，其中，该模块可自组装为玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分，该玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分与该一种或多种剂合并以形成玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分与该一种或多种剂的络合物。根据一额外的方面，通过将自组装的玫瑰形纳米管与一种或多种剂于介质中合并而制造络合物，于是，该一种或多种剂被并入该玫瑰形纳米管以形成玫瑰形纳米管与一种或多种剂的络合物。随后，该络合物可与细胞接触，于是，该络合物进入该细胞。不欲受缚于科学理论，据信，该络合物可通过内吞作用进入细胞。根据某些具体实施例，该细胞可为转化细胞、重组细胞、恶性细胞、或来自原代细胞株的细胞。该转染方法可于体外或体内细胞上实施。
该模块可以是该领域技术人员已知的那些中的任何模块，如G∧C模体和A∧T模体，该模块未经修饰或经修饰以包括部分或侧链，并自组装为螺旋玫瑰形纳米管。根据一个具体实施例，将模块置于水性介质中，该模块在该介质中自组装为子结构如环结构如玫瑰形，且该环结构随后通过将一个堆栈到另一个顶部而自组装以形成管状结构，该管状结构通常指代为纳米管。这些模块、子结构及纳米规格分子结构及其自组装体揭示于US 6,696,565、Fenniri et al,J.Am.Chem.Soc.2001,123,3854-3855；Moralez et al.,J.Am.Chem.Soc.,2005,127,8307-8309；Fine et al.,International Journal ofNanomedicine 2009:4 91-97；及Zhang et al.,Biomaterials 2009；30(7)：1309-1320中，为任何目的，上述文献各自通过引用而以其整体并入本文。
本公开的玫瑰形纳米管在水中非常稳定，且在约1微克(μg)/毫升(ml)缺乏病毒相关的安全性关注及毒性。见Int.J.Nanomedicine,2008,3(3)：373-383；Small.2008,4(6)：817-823；及Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol.2005,Nov,289(5)：L698-708，上述文献各自通过引用而以其整体并入本文。
根据本发明的一方面，所提供的方法为，前体或模块的自组装体将该剂并入该自组装的玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分或将该剂与该自组装的玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分络合。根据另一方面，完全组装的玫瑰形纳米管可使用一种或多种或复数种剂孵化，且该一种或多种或复数种剂可与完全组装的玫瑰形纳米管络合以形成复合物。根据又一方面，该一种或多种或复数种剂通过位阻、离子、范德华、分散、或其它非共价相互作用被加入或键结至该自组装的玫瑰形纳米管，以形成可用作待给药至个体的玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分与剂的络合物。本发明的另一方面，该剂包含治疗剂如核酸、肽或小分子。本发明的又一方面，该治疗剂包含IL-1受体拮抗剂。本发明的再一方面，该剂包含诊断剂如分子探针或分子信标。例如，该分子信标或探针包含MMP-13或ADAMTS-5。
根据本发明的某些方面，用于处置关节病的方法包含给药有效量的含有玫瑰形纳米管-剂络合物的组合物。这种诊断关节病的方法包含给药有效量的含有玫瑰形纳米管-剂络合物的组合物。本发明的另一方面包含关节病如自体免疫性、退行性、炎性、感染性、癌性、病毒性、真菌性、损伤性、创伤性、遗传性、外伤性、机械性、营养性或源自排列不整的关节病。本发明的另一具体实施例揭示关节病，包含类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎的青少年发病(JRA)、银屑病性关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、肌腱炎、或疝形成。使用治疗剂来处置关节病，如，这些剂包括止痛剂、抗炎剂、免疫功能抑制剂、抗真菌剂、抗生素、润滑剂、抗癌剂、NMDA受体拮抗剂、或抗病毒剂。
根据本发明的某些方面，处置组织及/或器官疾病的方法包含给药有效量的含有玫瑰形纳米管-剂络合物的组合物。这些诊断组织及/或器官疾病的方法包含给药有效量的含有玫瑰形纳米管-剂络合物的组合物。本发明的另一方面包含组织及/或器官疾病如自身免疫性、退行性、炎性、感染性、癌性、病毒性、真菌性、损伤性、创伤性、基因性、外伤性、机械性、营养性或源自排列不整的疾病。本发明的另一具体实施例揭示包含眼、皮肤、脑、脊柱、肠、肾、肝、及胃的组织及/或肌肉疾病。本发明的另一方面揭示处置关节、组织、及/或器官疾病的治疗剂，如该剂包括止痛剂、抗炎剂、免疫功能抑制剂、抗真菌剂、抗生素、润滑剂、抗癌剂、NMDA受体拮抗剂、或抗病毒剂。
根据某些方面，使用核酸如DNA或小RNA将玫瑰形纳米管功能和以形成络合物，例如，将RNA键结至该玫瑰形纳米管，将该络合物转移至细胞或组织内，且该细胞内小RNA(如，siRNA)以足以造成基因静默的量存在于该细胞内，导致对靶标蛋白质制造的抑制。在这一方面，该玫瑰形纳米管是将小RNA送入细胞内用于RNA干扰用途的输送载具或载剂。或者，该何时可由该细胞表达。例如，该细胞包含滑膜细胞或软骨细胞。或者，该靶标组织是软骨。根据某些方面，提供方法和技术以加工并组装玫瑰形纳米管(RNTs)用于诊断和治疗用途的舱输送。方法指向为实现体外和体内的细胞间/细胞内输送。根据某些方面，制备玫瑰形纳米管(RNT)与舱剂的络合物。该舱剂包括诊断分子，例如，基于寡聚物的分子信标；或治疗剂如核酸、肽、或小分子。这些诊断剂和治疗剂是该领域技术人员熟知的。通过静电力、π-π相互作用、或亲水/疏水效应促进RNT与该舱试剂之间的这种合并，以形成相对稳定的整体，本文中，该整体指代为“纳米件”。根据某些方面，提供方法以作成某些尺寸的玫瑰形纳米管(具备或不具备对于跨基质如细胞外间质组织输送为稳定的剂(如，舱组合物))。例如，提供方法用于改变纳米件的至少一个维度或其它参数如宽度，以渗入靶标组织基质的孔尺寸。
根据某些方面，提供方法和技术以加工并组装玫瑰形纳米管(RNT)用于诊断和治疗用途的舱输送。方法指向为实现体外和体内的细胞间/细胞内输送。根据某些方面，制备玫瑰形纳米管(RNT)与舱剂的络合物。该舱剂包括诊断分子，例如，基于寡聚物的分子信标；或治疗剂如核酸、肽、或小分子。这些诊断剂和治疗剂是该领域技术人员熟知的。通过静电力、π-π相互作用、或亲水/疏水效应促进RNT与该舱试剂之间的这种合并，以形成相对稳定的整体，本文中，该整体指代为“纳米件”。根据某些方面，提供方法以作成某些尺寸的玫瑰形纳米管，该玫瑰形纳米管具备或不具备对于跨基质组织输送为稳定的剂。例如，提供方法用于改变纳米件的至少一个维度或其它参数如宽度，以渗入靶标组织基质的孔尺寸。
根据某些方面，提供方法用于作成某些长度及尺寸参数的玫瑰形纳米管，如，1)在组装前，经由改变物理及/或化学条件如稳定、分子运动/振动(如声波处理)和pH来控制RNT的长度和捆束；2)在组装过程中，经由改变包括浓度、pH和离子强度的物理及/或化学条件来调节组装条件，以增强/减少纳米件的形成和堆栈；3)在组装后，经由改变包括增强分子运动/振动(如声波处理)的物理及/或化学条件来打破长纳米件或堆栈纳米件。
根据某些方面，提供方法用于跨基质/组织输送或玫瑰形纳米管或其组分或件的络合物，通过控制RNT与舱试剂之间的比来形成存在表面电荷的纳米件，该纳米件对于吸引力、定位、渗透、或滞留在组织内或该组织的一个或多个细胞内为稳定。例如，由于很多组织或细胞含有荷负电的分子(如蛋白聚糖)，可制造荷正电的RNT并用其与荷负电的核酸以某些比组装，获得荷正电的用于输送的纳米件。如此，纳米件集中在、结合至、以及蓄积在该基质/组织上/内，导致更长的滞留时间以实现更有效的输送。因此，通过所加工的纳米件实现高效且通用的跨基质/组织输送。本文中，术语“纳米件”可用来指代可加工为某些维度的玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管的组分。
根据某些方面，提供方法用于将玫瑰形纳米管或纳米件用于诊断应用，应用程度为分子探针可经由纳米件输送以检测特异性基因表达(或蛋白质活性)。通过同时输送用于非特异性信号的阴性对照和内部阳性对照，可实时、原位、及非侵入方式精确诊断靶标基因表达。
根据某些方面，预期治疗性应用，如消除(knocking down)一种或多种疾病基因表达(如，经由siRNA、miRNA或反义输送)，如，抑制与疾病状态下高于正常状态的异常表达相关的一种或多种基因或金银产物、上调一种或多种有益基因/蛋白质(如，经由DNA、mRNA或蛋白质输送)、或两种方法的组合。
根据某些方面，提供方法用于作成某些长度及尺寸参数的玫瑰形纳米管，如，1)在组装前，经由改变物理及/或化学条件如稳定、分子运动/振动(如声波处理)和pH来控制RNT的长度和捆束；2)在组装过程中，经由改变包括浓度、pH和离子强度的物理及/或化学条件来调节组装条件，以增强/减少纳米件的形成和堆栈；3)在组装后，经由改变包括增强分子运动/振动(如声波处理)的物理及/或化学条件来打破长纳米件或堆栈纳米件。
根据某些方面，提供方法用于跨基质/组织输送或玫瑰形纳米管或其组分或件的络合物，通过控制RNT与舱试剂之间的比来形成存在表面电荷的纳米件，该纳米件对于滞留在该组织内为稳定。例如，由于很多组织或细胞含有荷负电的分子(如蛋白聚糖)，可使用荷正电的RNT与荷负电的核酸舱以某些比组装，获得荷正电的用于输送的纳米件(见表1)。如此，纳米件集中在、结合至、以及蓄积在该基质/组织上/内，导致长得多的滞留时间以实现更有效的输送。因此，通过所加工的纳米件实现高效且通用的跨基质/组织输送。
根据某些方面，提供方法用于将玫瑰形纳米管或纳米件用于诊断应用，应用程度为分子探针可经由纳米件输送以检测特异性基因表达(或蛋白质活性)。通过同时输送用于非特异性信号的阴性对照和内部阳性对照，可实时、原位、及非侵入方式精确诊断靶标基因表达。
根据某些方面，预期治疗性应用，如消除一种或多种疾病基因表达(如，经由siRNA输送)；上调一种或多种有益基因/蛋白质(如，经由DNA、mRNA或蛋白质输送)；或两种方法的组合。
根据某些方面，依据加工条件，可创建不同尺寸的玫瑰形纳米管如纳米件，用于不同的输送用途如用以进入细胞基质或组织基质。例如，软骨组织基质具有约60纳米(nm)目径的胶原II纤维状网络(Comper et al in Cartilage:Molecular Aspects(eds Hall,B.&Newman,S.)59–96(CRC Press,Boston,1991))和约20nm侧链间隔的蛋白多糖网络(Torzilli et al J.Biomech.30,895–902(1997))。在siRNA的软骨基质内输送中，小尺寸的纳米件(至少一个维度小于60nm及/或20nm)显示优异效率。其次，通过调节RNT与舱试剂之间的比，整体荷正电的表面令纳米件能与荷负电的基质/组织组分粘合，导致更长的滞留时间。第三，纳米件可输送多种舱类型，且可同时输送多种舱试剂。第四，在纳米件上使用非共价或共价涂层可实现全身循环中的更长时间稳定性，并更有效地渗透入靶标组织基质及/或器官内。最后，所加工的纳米件在下列条件下显现成功输送：体外、间接体内、及体内。因此，提供方法用于将纳米件用于跨基质/组织输送。
根据某些方面，玫瑰形纳米管或纳米管组分或纳米件与剂的络合物可用于研究目的，以及作为有效输送剂(尤其是体内)用于分子诊断和治疗。根据某些方面，玫瑰形纳米管或纳米管组分或纳米件与剂的络合物可用于治疗目的，用于处置多种疾病，如将通过输送白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)来调制基于IL-1的炎症作为对关节炎的治疗，其中，IL-1Ra是IL-1的天然蛋白质抑制剂。例如，该舱包含IL-1R SiRNA。玫瑰形纳米管或纳米管组分或纳米件与剂的络合物可用来输送siRNA，以消除该疾病蛋白质，从而实现有效处置。
根据某些方面，玫瑰形纳米管或纳米管组分或纳米件与剂的络合物可用于诊断，如通过输送分子探针或分子信标。提供方法来输送分子信标至软骨基质内部的软骨细胞内以及组织及/或器官如心、胃、肾、肝、脾、脑、肠、脊柱、胸腔、及四肢内。通过同时输送多种分子信标来检测作为靶标的疾病基因表达、作为阴性对照的非特异性信号、以及作为内部阳性对照的看家基因，可实时、原位、及非侵入方式地定量靶标基因表达水平。
本公开的具体实施例指向为经自组装的玫瑰形纳米管与一种或多种或复数种剂的络合物。这些剂包括生物活性剂及/或诊断剂。将该络合物给药至个体，其中，该生物活性剂及/或诊断剂被输送至该个体体内的位点，包括该个体的细胞内，且该络合物被作成可用于治疗或诊断用途。根据一方面，该剂从该玫瑰形纳米管解离，以处置个体或提供诊断能力。根据额外方面，该剂保持为粘附、键结至该玫瑰形纳米管，或保持为与该玫瑰形纳米管络合或组合。
根据一个方面，通过将经自组装的玫瑰形纳米管模块与一种或多种剂如治疗剂或诊断剂在介质中组合而制造输送络合物，在该介质中，该模块自组装为玫瑰形纳米管，且该玫瑰形纳米管与该一种或多种剂合并以形成玫瑰形纳米管与一种或多种剂的络合物。根据额外方面，通过将经自组装的玫瑰形纳米管与一种或多种剂如治疗剂或诊断剂在介质中组合而制造输送络合物，于是，该一种或多种剂被并入该玫瑰形纳米管中以形成玫瑰形纳米管与一种或多种剂的络合物。该输送络合物可随后被给药至个体用于治疗或诊断用途。本发明的进一步目标为创建剂与玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管组分的络合物，该络合物可输送至靶标细胞内及细胞内基质中，且该络合物可于该处发生功用。本发明的进一步目标为提供处置个体的方法，该方法为使用玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管组分与剂的络合物的输送系统，其中，该剂进入细胞。该领域技术人员将会从下述公开和例示性具体实施例的说明中明了本发明的这些及其它目标、特征和优点或本发明的某些具体实施例。
本发明的进一步目标为创建剂与玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管组分的络合物，该络合物可被输送至靶标细胞内及细胞内基质中，且该络合物于该处发生功用。本发明的进一步目标为提供处置个体的方法，该方法为使用玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管组分的络合物的输送系统，其中，该剂进入细胞。因此，本发明涵盖一种组合物，该组合物包含舱分子及包含式I或式II的纳米结构，且该组合物用于将治疗性药物或诊断剂选择性如优先输送至靶标身体组织。或者，该纳米结构包含脂质或聚合物而非式I或II的化合物。
从下述对于其较佳具体实施例的说明及权利要求书中可明了本发明的其它特征和优点。除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员所通常认知的相同意义。尽管与本文中揭示者类似或等价的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但适宜的方法和材料揭示如下。本文中引用的全部已公开的外国专利和专利申请案通过引用而并入本文。由本文中引用的登录号所指明的基因银行和NCBI提交物通过引用而并入本文。本文中引用的其它全部已出版的参考文献、文档、手稿和科学文献通过引用而并入本文。若有冲突，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法、及实施例仅做例示性说明用而非欲以限制。
附图说明
图1是显示RNT与siRNA间组装的图解。
图2是显示RNT与DNA间组装的图解。
图3是显示RNT与Matrilin-3间组装的图解。
图4例示性说明方案1，其显示组装机制和加工途径。
图5A是在标准条件下组装的纳米件尺寸分布柱状图。
图5B是在标准条件下组织的纳米件宽度分布柱状图。
图6A是在组装前加工(淬火)的纳米件尺寸分布柱状图。
图6B是在组装前加工(淬火)的纳米件宽度分布柱状图。
图7A是在组装前加工(声波处理)的纳米件尺寸分布柱状图。
图7B是在组装前加工(声波处理)的纳米件宽度分布柱状图。
图8A是在组装过程中加工(增加离子强度)的纳米件尺寸分布柱状图。
图8B是在组装过程中加工(增加离子强度)的纳米件宽度分布柱状图。
图9A是在组装后加工(增加声波处理时间)的纳米件尺寸分布柱状图。
图9B是在组装后加工(增加声波处理时间)的纳米件宽度分布柱状图。
图10是显示在声波处理前(左)和声波处理后(右)组装的纳米件被输送至细胞内的一系列影像。
图11是显示具有不同RNT/siRNA比的纳米件的电动电势(反映表面电荷)的图。
图12显示说明与RNT结合的软骨、荧光标记的siRNA、及RNT/siRNA纳米件在关节软骨上的一系列影像和柱状图。
图13是显示被输送至猪软骨的荧光标记的siRNA/RNT纳米件(右)与对照(仅siRNA)比较的一系列影像。
图14是显示经加工的GAPDH分子信标/RNT纳米件有效输送至鼠软骨组织基质中和软骨细胞内部的一系列影像。
图15是显示经加工的GAPDH分子信标/RNT纳米件有效输送至人软骨组织基质中和软骨细胞内部的一系列影像。
图16是显示经加工的GAPDH分子信标/RNT纳米件有效输送至鸡软骨组织基质中和软骨细胞内部的一系列影像。
图17是显示经加工的MATN3 siRNA/RNT纳米件功能性输送至鼠软骨组织基质中和软骨细胞内部的图。
图18是显示经加工的MATN3 siRNA/RNT纳米件功能性输送至鼠软骨组织基质中和软骨细胞内部的图。
图19是显示经加工的miRNA365/RNT纳米件功能性输送至人软骨组织基质中和软骨细胞内部的图。
图20是显示经加工的miRNA365/RNT纳米件功能性输送至血清中及无血清介质中的人软骨组织基质中和软骨细胞内部的图。
图21是显示将试剂注射入鼠膝关节的影像。
图22是显示通过注射经加工的RNT/信标纳米件，鼠软骨组织基质内荧光信号随时间变化的一系列影像。
图23是显示通过仅注射分子信标，鼠软骨组织基质内荧光信号随时间变化的一系列影像。
图24是显示鼠软骨组织基质内定量荧光信号随时间变化的图。
图25是显示经加工的RNT/信标纳米件体内输送至大鼠软骨组织基质中和软骨细胞内部与仅输送信标比较的图和影像。
图26是显示经加工的RNT/信标纳米件体内定性(左)及定量(右)输送至大鼠软骨组织基质中和软骨细胞内部与仅输送信标比较的一系列影像和柱状图。
图27是显示将试剂注射入幼鼠关节内的影像。
图28是显示仅输送RNT(上)、仅输送信标(中)、及输送RNT/信标纳米件(下)的软骨组织学切片的一系列影像。
图29是显示MMP-13分子信标的体外校验的一系列影像。
图30是显示DMM膝与Sham膝(暗灰色为GAPDH；浅灰色为MMP-13)之间荧光信号比较的影像。
图31是显示DMM/Sham MMP-13信号随时间变化的图。
图32是显示DMM膝相对MMP-13表达水平的图。
图33是显示在IL-1R的治疗性消除之后，相对IL-1R、MMP-13、MMP-9及Col II基因表达水平的一系列图。
图34是显示鼠膝关节的组织学(中灰色着色为蛋白多糖)及免疫组化(暗灰色着色为来自聚集蛋白聚糖裂解的表位)的一系列影像。ADAMTS-5 siRNA/纳米件极大抑制了使用细胞因子刺激的软骨退化及聚集蛋白聚糖裂解。
图35是显示鼠膝关节组织学的一系列影像。ADAMTS-5 siRNA/纳米件极大抑制了DMM术后的软骨退化。
图36是显示鼠膝关节组织学评价的图。ADAMTS-5 siRNA/纳米件防止了DMM术后的骨关节炎进展。
图37是显示来自杂乱分子信标的荧光信号与表明MMP-13表达区域和关节软骨退化的来自MMP-13分子信标的信号进行比较的一系列影像。
图38是DMM术后鼠膝关节的组织学着色的影像。软骨退化的区域与MMP-13分子信标所表明的相同。
图39是显示通过纳米件输送至刺激下的软骨细胞内的GAPDH及杂乱分子信标的一系列影像。
图40是显示通过纳米件输送至无刺激下的软骨细胞内的GAPDH及ADAMTS-5分子信标的一系列影像。
图41是显示通过纳米件输送至刺激下的软骨细胞内的GAPDH及ADAMTS-5分子信标的一系列影像。
图42是术后6天时DMM及Sham膝内ADAMTS-5分子信标的荧光信号的图。
图43是显示术后DMM膝与Sham膝中ADAMTS-5分子信标的荧光信号比的图。
图44是例示性说明人关节软骨的免疫组化结果(着色处为来自聚集蛋白聚糖裂解的表位)的一系列影像。ADAMTS-4 siRNA及ADAMTS-4&5 siRNA/纳米件的组合极大抑制了使用细胞因子刺激的聚集蛋白聚糖裂解。
图45是显示人关节软骨的组织学结果(着色处为蛋白聚糖)的一系列影像。ADAMTS-4 siRNA以及ADAMTS-4&5 siRNA/纳米件的组合极大抑制了使用细胞因子刺激的软骨退化。
图46是显示鼠膝关节免疫组化结果(着色处为来自聚集蛋白聚糖裂解的表位)的一系列影像。ADAMTS-5 siRNA/纳米件极大抑制了DMM术后的聚集蛋白聚糖裂解。
图47是显示使用HPLC色谱纯化的使用HCl或TFA作为修饰剂的RNT细胞毒性研究的图。
图48是显示纳米管至纳米棒的转换的一系列影像。
图49是显示“制程-2”之前和之后的纳米件生成的一系列影像。
图50是显示鼠膝内荧光信号的定量分析的图。
图51是显示分子信标(MB)技术的示意图。
图52是显示纳米件至软骨细胞内的跨基质输送的示意图。
图53是用以获得纳米件的自组装、制程-1、制程-2的流程设计。
图54是显示术后4天时MMP表达增加的图。
图55是显示术后11天时MMP表达增加的图。
图56是显示增加声波处理功率时的纳米件尺寸和形貌的一系列图和影像。
图57是增加声波处理功率时纳米件尺寸和形貌的散点图。
图58是显示具有不同PEG摩尔过量比的纳米件的稳定性的线图。
图59是显示具有和不具有非共价链接的PEG的纳米件的稳定性的线图。
图60是显示将小纳米件输送入关节软骨内以导致与对照(仅MB)区分的荧光的影像。
图61是显示将大小两种纳米件输送入滑膜内以导致与对照(仅MB)区分的荧光的影像。
图62是显示使用小纳米件时肝捕获比使用脂质载具时降低的影像。
图63时显示使用小纳米件时肝捕获比使用脂质载具时降低的柱状图。
图64是显示使用小纳米件时至具有致密基质的组织或器官内的输送增加的棒状图。
图65是显示RNT结构的例示性说明。RNT是外直径为3.5nm且内直径为1.1nm的长管状结构。
图66是显示经纳米件(RNT或TBL)输送处理的细胞保持正常细胞形貌的一系列影像，表明纳米件的优异生物相容性；而经基于脂质的载具输送导致异常的细胞形貌及大量碎片，暗示基于脂质的载具的细胞毒性。
图67是显示大脂质纳米颗粒和小脂质纳米颗粒(与阴性对照和大脂质纳米颗粒相比，*p<0.05)的IL-1R表达水平的PCR结果的柱状图。
图68是显示大聚合物纳米颗粒和小聚合物纳米颗粒(与阴性对照和大聚合物纳米颗粒相比，*p<0.05)的IL-1R表达水平的PCR结果的柱状图。
具体实施方式
本发明的组合物和方法提供优先以组织为靶向以输送治疗剂的组合物和方法。该结构如纳米件被构建为包含电荷及/或尺寸，故该结构优先与特异性身体组织关联或结合。例如，本发明提供输送纳米件及其舱至关节、组织、及/或器官处/内的方法。成功输送至细胞内并不总是必需意为实现成功输送至组织内以获得有效的治疗或诊断成果。一个主要原因为，组织不像细胞一样具有细胞外间质。例如，具有大尺寸或不适当表明电荷的纳米件可能无法足够有效地渗入组织内以造成治疗或诊断响应。在组织渗透之前从纳米管中释放的药物分子不能在该组织内扩散至足以到达显着量细胞的深度。本发明解决这些问题，并提供将药物分子封装入纳米管/纳米棒中的方法，该纳米管/纳米棒选择性设计为改变其表面电荷及/或将其尺寸改变为小至足以渗透该组织基质。因此，以此方式，不是药物分子从纳米管中释放且随后扩散入该组织内，而是真实的纳米件/纳米棒(含有舱如药物)渗透该组织。为了将其舱有效输送至关节、组织及/或器官内以实现有效治疗或诊断，本发明进一步提供加工纳米管/纳米棒以控制尺寸和纳米件其它性质(如表面电荷及涂层)的方法。这些纳米件(Nanopieces)可能含有核酸、肽、蛋白质、以及芳香族或荷负电的小分子。因为不同的组织具有不同的表面电荷，经由输送舱与纳米棒数量的比来控制纳米件的表面电荷是重要的。太大的纳米件可能难以渗入组织基质，而纳米件不当的表面电荷可能与靶标组织相互排斥或该纳米件在体液或血液中可能不稳定。下表揭示优先集中在并输送至例示性身体组织的例示性纳米件。
纳米件至靶标组织的选择性输送
表1
Figure GDA0001238979400000211
Figure GDA0001238979400000221
Figure GDA0001238979400000231
Figure GDA0001238979400000241
Figure GDA0001238979400000251
Figure GDA0001238979400000261
Figure GDA0001238979400000271
Figure GDA0001238979400000281
Figure GDA0001238979400000291
Figure GDA0001238979400000301
诊断性应用
分子信标或分子信标探针是报告存在特异性核酸的寡核苷酸杂交探针。分子信标是具有内部淬火的荧光团的发夹形分子，当它们结合至靶标核酸序列时，恢复荧光。分子信标的用途为检测特异性核酸序列的非放射性方法。它们可用于或不可能或不希望从过量的杂交探针分离以该探针-靶标杂交体的情境，如临床诊断的情况下。
典型的分子信标探针长度为25个核苷酸。中间15个核苷酸与靶标DNA或RNA互补且彼此并不碱基配对，而各端的5个核苷酸彼此互补而非与靶标DNA互补。典型的分子信标结构可分为4个部分。环圈：分子信标中的18至30碱基对区域，其与靶标序列互补。茎干：信标茎干通过接合至位于该环圈两端的彼此互补的两个短(5至7个核苷酸残基)寡核苷酸而形成。5'荧光团：位于分子信标的5'端并接合有荧光染料。3'淬火剂(非荧光)：信标的淬火染料部分共价接合至该分子信标的3'端。当该信标为封闭环圈形状时，该淬火剂位置接近该荧光兔，这导致后者的荧光发射被淬火。
如果待检测的核酸与该环圈中的链互补，则出现杂交事件。该核酸与该环圈之间形成的双链比该茎干更稳定，因为所形成的双链牵涉更多碱基对。这造成该茎干的分开，并因此造成该荧光团及淬火剂的分开。一旦该荧光团远离该淬火剂，以光照明该杂交体导致荧光发射。该发光的存在报告已经出现杂交事件，且因此该靶标核酸序列存在于测试样品中。分子信标可用于SNP检测、实时核酸检测、实时PCR定量、等位基因分型及鉴定、多重PCR试验中，并可用于诊断。含有分子信标、或非放射性或放射性可检测标记物的纳米件特别渴用于临床诊断试验。
MMP
MMP13牵涉进骨关节炎的进展中中。基质金属蛋白酶(MMP)13是以软骨为靶标退化的主要酶。与其它MMP相比，MMP13的表达相对更加受限于结缔组织。其不仅以软骨中的II型胶原作为靶标退化，还退化软骨中的蛋白聚糖、IV型及IX型胶原、骨粘连蛋白、及基底膜聚糖。临床研究透露，患有关节软骨损毁的患者具有MMP13高表达，表明MMP13的增加与软骨退化有关。MMP13过表达的转基因鼠发展出自发性OA样关节软骨损毁表型。ADAMTS(具有血小板反应蛋白模体的解聚素和金属蛋白酶)家族的聚集蛋白聚糖酶也有贡献于蛋白聚糖/聚集蛋白聚糖损耗，且与OA过程中的软骨退化有关。ADAMTS 4和5被认为是OA发展过程中的主要聚集蛋白聚糖酶。
ADAMTS5
ADAMTS5是ADAMTS(具有血小板反应蛋白模体的解聚素和金属蛋白酶)蛋白家族的成员，并且是人软骨中的主要聚集蛋白聚糖酶。该家族的成员共有若干截然不同的蛋白质模块，包括前肽区域、金属蛋白酶域、解聚素样域、及1型血小板反应蛋白(TS)模体。这一家族的个体成员的不同之处在于C端TS模体的数目，且某些具有独特的C端域。由这一基因编码的酶含有两个C端TS模体，且作为聚集蛋白聚糖酶的功能以裂解聚集蛋白聚糖，而该聚集蛋白聚糖是软骨的主要蛋白聚糖。
ADAMTS5在关节炎中扮演角色，如在软骨中的聚集蛋白聚糖退化中扮演重要角色。例如，在骨关节炎的实验模型中，其体内ADAMTS5催化性域的经基因改造的鼠对软骨损毁具有抵抗力。ADAMTS5是炎性关节炎鼠模型中鼠软骨中的主要聚集蛋白聚糖酶。ADAMTS5也可作为生物标记物用于预报类风湿性关节炎患者体内对英夫利昔单抗(infliximab(IFX))的响应。
以组织为靶标的纳米颗粒的制造
用于个体组织的纳米件的制备实施例详述如下。
软骨/软骨细胞：
1)将处于50微升(μL)水中的30微克(μg)RNT加热至99℃，加热3分钟(min)，随后与0.1纳摩尔(nmol)MMP-13分子信标混合。所得混合物以100％功率声波处理10秒(s)。
2)使用700瓦(W)声波处理器将处于1μL水中的4.4μg RNT以50％功率处理10min，随后与0.1nmol miRNA-140混合。所得混合物以100％功率声波处理30min。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol ADAMTS-5 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理3min。
滑膜：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol IL-1β分子信标于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以1％功率处理10min，随后与0.1nmol IL-1受体拮抗蛋白混合。所得混合物以1％功率声波处理10s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol TNF-α siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
神经元：
1)使用700W声波处理器将处于50μL水中的15μg RNT以1％功率处理30min，随后与0.1nmol VEGF分子信标混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)将处于1μL盐水中的0.1μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol IL-1受体siRNA于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理30min。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol MMP-1 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理3min。
脑/BBB：
1)将处于50μL水中的20μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol MMP-9分子信标于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的1μg RNT以10％功率处理10min，随后与0.1nmol VEGF mRNA混合。所得混合物以10％功率声波处理10s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol TNF-α siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
眼组织：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol VEGF分子信标于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以1％功率处理10min，随后与0.1nmol VEGF拮抗蛋白混合。所得混合物以1％功率声波处理10s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol VEGF siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
真皮组织/皮肤：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol IL-1β分子信标于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以1％功率处理10min，随后与0.1nmol IL-6 siRNA混合。所得混合物以1％功率声波处理10s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol IL-8 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
肿瘤：
1)使用700W声波处理器将处于50μL水中的30μg RNT以1％功率处理30min，随后与0.1nmol VEGF分子信标混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)将处于1μL盐水中的0.1μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol TNF-αsiRNA于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理30min。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol MMP-1 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理3min。
肾：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol IL-12分子信标于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以5％功率处理10min，随后与0.1nmol IL-1受体相关蛋白siRNA混合。所得混合物以1％功率声波处理10s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol IL-8 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
粘膜：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol MMP-13分子信标于冰上混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以1％功率处理10min，随后与0.1nmol MMP-9 siRNA混合。所得混合物以1％功率声波处理10s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol MMP-1 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
肺：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol TNF-α分子信标于冰上混合。所得混合物以50％功率声波处理60s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以1％功率处理3min，随后与0.1nmol MMP-9 siRNA混合。所得混合物以1％功率声波处理5s。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以50％功率处理1min，随后与0.1nmol MMP-1 siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理60s。
心：
1)将处于50μL水中的30μg RNT加热至99℃，加热3min，随后与0.1nmol VEGF分子信标混合。所得混合物以100％功率声波处理10s。
2)使用700W声波处理器将处于1μL盐水中的4.4μg RNT以50％功率处理10min，随后与0.1nmol miRNA-365混合。所得混合物以100％功率声波处理30min。
3)使用700W声波处理器将处于10μL水中的10μg RNT以100％功率处理5min，随后与0.1nmol IL-1α siRNA混合。所得混合物以100％功率声波处理3min。
纳米件的涂层是用于组织输送的另一重要因子，且可用以改善该组织输送。例如，一般使用的涂层是聚乙二醇(PEG)和右旋糖酐。
本发明进一步提供作成玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管组分或玫瑰形纳米件与包括该领域已知者的治疗剂或诊断剂的复合物的方法。例如，剂包括核酸(DNA或RNA)，其中，该RNA可为小RNA如siRNA和miRNA。特别地，本文揭露的是新颖siRNA运输络合物，包含出乎意料地有益运输载具。本发明的方法包括令本文中揭示的转染络合物与一个或多个细胞接触，其中，该转染络合物包括玫瑰形纳米管和一种或多种核酸如DNA及RNA，例如，siRNA。该玫瑰形纳米管是从下文揭示的自组装模块和该领域认可的那些模块所形成的载剂。
用于自组装的化合物/模块
根据本公开的模块包括下式I化合物：
Figure GDA0001238979400000361
其中，X为CH或氮，优选氮；R2为氢或链结基如(CH2)n或本文中揭示的其它链结基，优选(CH2)n；n是整数1、2、3、或4，优选n＝2；当R2为氢时Y不存在，或者Y为具有共价键结至氨基酸α-碳的胺基的氨基酸或多肽，且该胺基共价键结至该链结基R2，Y优选为赖氨酸、精氨酸及组氨酸；以及，R1为氢或脂肪族部分如烷基，直链或支链，饱和或不饱和；及其盐。R1优选为C1至C10烷基、C1至C5烷基、C1至C3烷基、或甲基。本发明范畴内的化合物包括其中Y基团可通过氨基酸或肽的胺基或羧基连接至该链结基的那些化合物。例示性链结基显示于下式中。
Figure GDA0001238979400000362
式I范畴内的例示性模块与纳米管的示意图及从该例示性模块形成的纳米管的影像一起显示于图4中。
供选择的链结基R2可将Y基团通过氨基酸或肽的胺基或羧基加至该(CH2)n的碳原子上或N原子上。
本公开范畴内的供选择的R2基团选自包含下列的组：
Figure GDA0001238979400000371
，其中，Y不存在。
式I化合物可单独使用通过引用并入本文的US 6,696,565中揭示的方法制备，或使用该方法与该领域技术人员已知方法的组合方法制备。通过式(I)化合物的组合作成玫瑰形纳米管。
例示性式I化合物显示如下：
Figure GDA0001238979400000372
根据本公开的模块也包括下式II的化合物：
Figure GDA0001238979400000381
其中，X为CH或氮，优选氮；R2为氢或链结基如(CH2)n或(CH2)3CO或本文中揭示的其它链结基，优选(CH2)n；n是整数1、2、3、或4，优选n＝2；当R2为氢时Y不存在，或者Y为具有共价键结至氨基酸α-碳的胺基的氨基酸或多肽，且该胺基共价键结至该链结基R2，Y优选为赖氨酸、精氨酸及组氨酸；以及，R1为氢或脂肪族部分如烷基，直链或支链，饱和或不饱和；及其盐。R1优选为C1至C10烷基、C1至C5烷基、C1至C3烷基、或甲基。例示性链结基显示于下式中。
Figure GDA0001238979400000382
本公开范畴内的化合物包括其中Y基团可通过氨基酸或肽的胺基或羧基连接至该链结基的那些化合物。本公开范畴内的供选择的R2基团选自包含下列的组：
Figure GDA0001238979400000391
，其中，Y不存在。TBL结构由式(II)化合物的组装而作成。
例示性式II化合物显示如下：
Figure GDA0001238979400000392
Figure GDA0001238979400000401
一些具体实施例中，式II化合物包含氨基酸官能团构造。这些化合物含有天然氨基酸侧链中存在的官能团或可含有整个氨基酸侧链。例如，赖氨酸官能团构造含有整个氨基酸侧链官能度(-CH2CH2CH2CH2NH3 +)，而在哪上官能团构造仅含有组氨酸中存在的杂芳基咪唑基团。
一些具体实施例中，式II化合物包含氨基酸类似物。这些化合物含有整个氨基酸或可含有经修饰及/或非天然的氨基酸。例如，赖氨酸氨基酸类似物含有赖氨酸的整体氨基酸官能度，而组氨酸氨基酸类似物含有经修饰的组氨酸氨基酸。
一些具体实施例中，式II化合物优于式I化合物。
一些具体实施例中，式II化合物是赖氨酸官能团构造：
Figure GDA0001238979400000402
根据本公开的某些方面，式II的结构指代为具有链结基的双生碱基(TBL)或双生碱基链结基，只要两个相似的双环结构如式II中所示而存在且链接至胺基酸或多肽即可。但是，应理解，两个双环结构并不需要完全相同，他们仍可具有不同的X及R1基团。
本公开的具体实施例牵涉作成玫瑰形纳米管或玫瑰形纳米管组分或玫瑰形纳米件与治疗剂或诊断剂的复合物，该治疗剂或诊断剂包括该领域已知的那些且包括核酸如DNA或RNA。RNA可以是小RNA，包括siRNA和miRNA。特别地，本文揭露的是新颖的siRNA运输络合物，包含出乎意料地有益的运输载具。本发明的方法包括令本文中揭示的转染络合物与一个或多个细胞接触，其中，该转染络合物包括玫瑰形纳米管及一种或多种核酸如DNA及RNA，例如siRNA。该玫瑰形纳米管是从本文中揭示的自组装模块和该领域认可的那些模块形成的载剂。
TBL或双生碱基链结基包含式II中显示的结构且链接至氨基酸、氨基酸侧链结构、或多肽；式I化合物也可链接至氨基酸、氨基酸侧链结构、或多肽。但是，应理解，两个双环结构并不需要完全相同，它们仍可具有不同的X、Y、和R1基团。
氨基酸可分为含有亲水性侧链的氨基酸、含有疏水性侧链的氨基酸、及含有荷电侧链的氨基酸。参加下文图表，其中，该侧链以阴影表示：
根据本公开的方面，根据式I及式II的可自组装为子结构的模块(化合物)也称为超大环，在水中或水性溶液中，其自身将会自组装为纳米规格的架构或结构如离散纳米管柱组装体。本文中，超大环定义为就是大量有机分子共价或非共价键结在一起以形成环结构。例如，式I化合物将会自组装为6元环结构，有时指代为玫瑰形。使用本公开的模块形成纳米管的制程是分等级的。特别地，本发明的模块首先自组装为超大环，随后该超大环自组装为纳米管。这种自组装揭示于US 6,696,565中。对于指代为双生碱基链结基的式II化合物，该化合物也将会自组装为6元环结构。但是，由于每一式II化合物中存在两个碱基，所形成的单个超大环将包括两个碱基层。
本公开模块的实例包含式I化合物和式II化合物，且可包括由命名法指代为C∧G(Fenniri et al,J.Am.Chem.Soc.2001,123,3854-3855)和A∧T的低分子量合成DNA碱基类似物。指代为单个CG模体的C∧G部分，拥有Watson-Crick供体-供体-接受者的鸟嘌呤和接受者-接受者-供体的胞嘧啶，并通过氢键阵列提供能量进行自组装进程，以产生六元超大环或玫瑰形。这些玫瑰形的堆栈产生了纵横比非常高的纳米管。本发明范畴内的化合物包括双生G∧C模体，记为(C∧G)2。与单个C∧G模体类似，双生C∧G模体(C∧G)2也拥有Watson-Crick供体-供体-接受者的鸟嘌呤和接受者-接受者-供体的胞嘧啶，并通过氢键阵列提供能量进行自组装进程，以产生六元超大环或双生构型的环结构(玫瑰形)。这些双生玫瑰形的堆栈产生了纵横比非常高且稳定性更高的纳米管。同样，指代为单个AT模体的A∧T部分也拥有Watson-Crick供体-供体-接受者的腺嘌呤和接受者-接受者-供体的胸腺嘧啶，并通过氢键阵列提供能量进行自组装进程，以产生六元超大环或玫瑰形。这些玫瑰形的堆栈产生了纵横比非常高的纳米管。本发明范畴内的化合物包括双生A∧T模体，记为(A∧T)2。与单个A∧T模体类似，双生A∧T模体(A∧T)2也拥有Watson-Crick供体-供体-接受者的腺嘌呤和接受者-接受者-供体的胸腺嘧啶，并通过氢键阵列提供能量进行自组装进程，以产生六元超大环或双生构型的环结构(玫瑰形)。这些双生玫瑰形的堆栈产生了纵横比非常高且稳定性更高的纳米管。
应理解，上文揭示的式I及/或式II表明，在水性介质中，静电、堆栈和疏水作用可通过氢键有效地编排以引导螺旋纳米管架构的该分等级组装和建构。本发明范畴内的螺旋纳米管架构包括完全自式I化合物形成的那些。本发明范畴内的螺旋纳米管架构包括完全自式II化合物形成的那些。再者，本发明范畴内的螺旋纳米管架构包括从一种或多种式I化合物及一种或多种式II化合物形成的那些。例如，从式I化合物形成的具有特定氨基酸或多肽侧链的超大环结构可与从式II化合物形成的具有特定氨基酸或多肽侧链的超大环结构堆栈。从式I化合物及式II化合物形成的玫瑰形子结构可以任意所欲次序堆栈以形成本发明的纳米管结构。使用本发明的这一方面，可根据本发明的方法合成大量结构上不同的模块(如，化合物)并自组装为超大环结构，且随后自组装为纳米管结构。
本发明的另一方面为通过改变pH、温度、及物理方法的使用(如，声波处理、加热、及掺混)而将纳米管转化为纳米棒，从而制备不同尺寸的纳米件。
与输送舱组装之前，纳米管(基于式I或II)的长度尺寸范围为从1nm至999微米，如，10nm至999nm。纳米管的外部宽度尺寸范围为从0.5nm至100nm，如，1nm至10nm。纳米管的内部直径尺寸范围为从1埃至10nm，如，0.5nm至5nm。
与输送舱组装之后，纳米管(基于式I或II)的长度尺寸范围为从1nm至999微米，如，10nm至999nm。纳米件的宽度尺寸范围为从1nm至999nm，如，10nm至100nm。
本发明的另一方面为使用纳米管封装药物分子如治疗剂和诊断剂，以改变该药物分子的表面电荷且更重要地将这些纳米管加工为纳米件，该纳米件的形状和尺寸恰好渗入组织基质。因此，不是从纳米管释放的药物分子扩散入组织，而是纳米件本身渗入组织。经由输送舱与纳米管及/或纳米棒的比来进行对该纳米件表面电荷的控制。本发明的再一方面为，该纳米件的涂层在组织输送中的用途。例如，聚乙二醇及/或右旋糖酐是在使用时能改善组织输送的涂层。
本发明的又一方面为将舱输送至细胞内。这些药物分子可以是核酸、肽、蛋白质、芳香族小分子或荷负电的小分子。
一些具体实施例中，所制备的本发明的模块的整体产率不低于60％，如不低于70％，不低于80％，或不低于90％。
一些具体实施例中，本发明方法的模块含有超过80％的式I化合物或式II化合物。一些具体实施例中，本发明方法的产物含有超过85％、90％、92％、95％、97％、98％、98.5％、或99％的式I化合物及/或式II化合物。例如，该产物不含不希望的副产物或起始材料。
一些具体实施例中，本发明的纳米管的整体产率不低于60％，如不低于70％，不低于80％，或不低于90％。
一些具体实施例中，本发明方法的纳米管含有超过80％的式I化合物或式II化合物。一些具体实施例中，本发明方法的产物含有超过85％、90％、92％、95％、97％、98％、98.5％、或99％的式I化合物及/或式II化合物。例如，该产物不含不希望的副产物或起始材料。
一些具体实施例中，本发明的纳米件的整体产率不低于60％，如不低于70％，不低于80％，或不低于90％。
一些具体实施例中，本发明方法的纳米件含有超过80％的式I化合物或式II化合物。一些具体实施例中，本发明方法的产物含有超过85％、90％、92％、95％、97％、98％、98.5％、或99％的式I化合物及/或式II化合物。例如，该产物不含不希望的副产物或起始材料。
根据本发明的某些较佳方面，从单碱基环结构和双碱基环结构以任意所希望的次序制备纳米管。该纳米管可具有一个或多个单碱基环结构和一个或多个双碱基环结构。同源，本发明范畴内的纳米管可包括堆栈在一起的复数个从式I化合物形成的单碱基环结构和复数个从式II化合物形成的双碱基环结构，如，经由氢键一个接一个堆栈以形成该纳米管。
纳米管-剂络合物
根据某些方面，核酸或多肽包括作为双链的小RNA，其长度为约10至约30个核酸之间，约15至约25个核酸之间，以及约20至约23个核酸之间，以及其间的或重叠或不重叠的任何数值和范围。该小RNA可由一个或多个寡核苷酸形成。小RNA包括一般指代为干扰RNA、dsRNA、ssRNA、saRNA、siRNA或miRNA的RNA，或其衍生物、类似物、模拟物及抑制剂。根据某些方面，siRNA牵涉入RNA干扰(RNAi)路径，其中，该siRNA干扰特异性基因的表达。siRNA除了在RNAi路径中的角色外，也在RNAi相关路径中扮演角色。本公开范畴内的siRNA包括双链RNA，该双链RNA为约21个核苷酸，且在该siRNA各末端具有2个核苷酸的3’悬垂。每一siRNA链具有5’磷酸盐基团和3’羟基(-OH)。该结构是通过切丁酶加工的结果，切丁酶是将长dsRNA或小发夹形RNA转化为siRNA的酶。该领域技术人员可从已经出版的文献轻易获得siRNA的特定例示性序列，且siRNA可从例如德国凯杰(Qiagen)商购。应理解，本公开并不欲以限制任何特定的siRNA序列，相反，本公开广泛地揭示将siRNA并入符玫瑰形纳米管或与后者合并。该领域技术人员将会轻易确认，可使用本文中揭示的方法将具有给定的类似结构和共价连接核苷酸的功能的全部siRNA序列并入玫瑰形纳米管中或将前者与后者络合，且公众已知siRNA序列的详细清单不需要提供于本文中。
根据额外方面，DNA包括希望通过细胞表达的任何DNA。DNA包括具有已知功能且表达已知蛋白质的基因。同样，适用于转染细胞的DNA对于转染和基因表达领域的技术人员是显而易见的。
转染络合物的制造和用途
本公开指向形成转染络合物的方法，例如，通过将一种或多种核酸与完全成形的玫瑰形纳米管或可自组装为玫瑰形纳米管的模块如式I化合物或式II化合物混合。根据一方面，将粉末形式的完全成形的玫瑰形纳米管溶解于水中并加热至沸腾。随后将该溶液冷却至室温。溶液形式的一种或多种核酸随后被加入适当温度的纳米管溶液中，并持续适当时间，直至形成该纳米管与一种或多种核酸的络合物。该核酸与纳米管的适当的比包括约0.01:1(wt/wt)至约1:0.1(wt/wt)。
本发明进一步指向转染络合物，其包括小RNA如siRNA及玫瑰形纳米管。根据本发明的转染络合物可包括本发明的任何玫瑰形纳米管与该领域技术人员已知小RNA的组合。
根据某些方面，本发明范畴内的可转染细胞包括骨母细胞、成纤维细胞、干细胞、神经元细胞、结缔组织细胞、角化细胞、心肌细胞、软骨细胞、蛋白聚糖、滑膜细胞、脂肪细胞、噬菌细胞、血单核细胞、间充质干细胞、神经干细胞、岛细胞、肝细胞、平滑肌细胞、膀胱上皮细胞、神经元、施万细胞(Schwann cells)、微生物细胞、癌细胞及非癌细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌成纤维细胞、破骨细胞、巨噬细胞、白血球、骨细胞、星形胶质细胞等。额外的细胞包括细菌细胞如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、MRSA、大肠杆菌(E.coli)、念珠菌(酵母)、白色念珠菌(Candida albacans)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、梅毒螺旋菌(Treponema pallidum)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏杆菌(Shigella)、梭菌(Clostridium)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)等。上述列举的为例示性且并非全部。该领域技术人员将轻易能够鉴别本公开范畴内的其它细胞，该其它细胞指向关节、组织及/或器官中存在的细胞。
通常，待转染的细胞包括但不限于，在体外或体内，对使用本发明转染络合物将DNA或RNA如siRNA输送至细胞内的输送敏感的任何动物、植物或细菌细胞。例如，根据本公开，可使用来自不同物种如人、鼠、大鼠、猪、鸡等的细胞。同样，可使用来自不同组织或器官的细胞，如软骨(如，耳软骨、鼻软骨、胸腔软骨、支气管软骨、椎间盘软骨、透明软骨、纤维状软骨、弹性软骨)、结缔组织(如，松散结缔组织、致密结缔组织、脂肪结缔组织、纤维状结缔组织、弹性结缔组织、淋巴结缔组织)、结合组织、纤维(如，胶原纤维、弹性纤维、网状纤维)、滑膜、神经元组织、肌肉组织、韧带、腱、滑囊、成纤维细胞、乳腺细胞、来自免疫系统的巨噬细胞、以及来自神经系统的星形胶质细胞。同样，可使用直接来自动物、植物或细胞的原代细胞；且可使用细胞株如可商购的无限增殖化细胞。同样，可使用正常细胞和染病细胞如癌细胞。例如，适当的细胞性靶标包括，而不限于，上皮细胞；内皮细胞；角化细胞；成纤维细胞；肌肉细胞；肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；以及各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，如，自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的干细胞或祖细胞。某些方面，该细胞选自滑膜细胞、成纤维细胞、单核细胞、软骨细胞、胶原、内皮细胞、结缔组织细胞、神经元细胞、肌肉细胞、造血干细胞和肿瘤细胞组成的组。
根据某些具体实施例，该细胞包括选自变形、重组、恶性、及原代细胞株所组成组的一个或多个细胞。据信，在即使不是全部也是大多数细胞类型和细胞株中，本发明的玫瑰形纳米管将会有效作为DNA或RNA如siRNA的载剂。由于玫瑰形纳米管与核酸的络合物由共价键结的碱基对构成，该领域技术人员会预期，对于转染目的，这些络合物将被全部细胞类型普遍认可。
根据本发明转染细胞的方法也可包括，通过在水性介质中合并该玫瑰形纳米管的模块与一种或多种DNA序列及/或一种或多种RNA序列而形成转染络合物。允许形成络合物。随后令细胞与该络合物接触。根据一方面，该领域技术人员将会从本公开的益处确认，RNT/核酸合并的剂量、浓度、比和条件可处于下述范围内。例如，约1μL至约100μL之间如10μL的1mg/mL RNT可与约1μL至约100μL如20μL的5μM核酸如siRNA、miRNA、核酸探针或其它核酸在约0℃至约37℃之间的温度混合约0.5小时至约48小时，并加入1mL细胞培养基中进行转染。例如，可将RNT与核酸的组合在4℃保持24小时或在室温保持2小时。混合可通过简单混合、在约60℃至约100℃加热下混合、声波处理或该领域技术人员已知的其它方法实施。如果加热，则该组合可随后在约0℃至约37℃之间的温度加热约0.5小时至约48小时，以导致纳米管/核酸络合物的形成或组装。例如，可通过改变RNT/核酸的比而将包含一种或多种DNA序列及/或一种或多种RNA序列的纳米管修饰，以调整该纳米管的表面电荷。该领域技术人员将会确认，例如，软骨是荷负电的组织基质，因此载有整体正电荷的纳米管将会增加该纳米件在软骨组织中的滞留时间。
处置方法
本发明也提供处置组织、器官及/或关节疾病的方法，该方法包含使用本发明的络合物或组合物。特别地，所提供的方法为通过对患有组织、器官或关节疾病的患者给药治疗有效量的本发明的络合物或组合物而处置该患者。对于基于局部注射(如，关节内注射、肿瘤内注射、及肌肉注射)的体内治疗，该RNT/小RNA络合物较佳为水溶性且因此可作为水性注射液而给药。
根据本公开的多方面，对于治疗的目的，玫瑰形纳米管与小RNA的复合物可与药学可接受的剂组合并作为输送组合物而给药至个体。
根据某些实施例，本发明的络合物可并入适用于给药的药物组合物。这些组合物典型包含本文所揭露的络合物以及药学可接受的载剂。本文中，术语“药学可接受的载剂”倾向于包括可与药学给药相容的任何及全部溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂等。这些用于药学活性物质的介质和剂的使用在该领域中是已知的。除了与该活性化合物不形容的任何传统介质或剂之外，预期其它在该组合物中的使用。追加的活性化合物也可并入该组合物中。
治疗性应用
还包括通过对患有组织、器官及/或关节疾病的患者给药已经通过本文揭露的方法转染的细胞而处置该患者的方法。本发明的间接体内输送方法的一个方面可包括，例如，(i)从对象移除一个细胞；(ii)通过令该细胞与包含siRNA和玫瑰形纳米管的输送组合物(转染络合物或包含此转染络合物的组合物)接触而将siRNA引入该细胞；以及(ii i)将该细胞再引入该对象体内。此外，本文中揭示的络合有核酸的纳米管可于体内输送至需要进行处置的个体，其中，络合有核酸的纳米管进入该个体体内的细胞，且该核酸调节蛋白质的细胞表达。例如，核酸可以治疗的方式令基因静默至蛋白质不表达的程度而导致处置的结果，或核酸可由该细胞以治疗的方式表达以生成蛋白质而导致处置的结果。
该络合物、组合物及方法对其具有处置潜力的关节疾病(如，滑膜关节疾病、纤维性关节疾病、软骨性关节疾病)的实例包括但不限于下列：自体免疫性关节病、退行性关节病、炎性关节病、感染性关节病、癌性关节病、病毒性关节病、真菌性关节病、源自损伤或创伤的关节病。这些关节疾病可以是原发性疾病，或者可以由现有疾病及/或沉疴造成。实例包括风湿性多肌痛、类风湿性关节炎、多发性硬化、夏科关节(Charcot’s Joint)、骨关节炎、类风湿性关节炎的青少年发病(JRA)、全身性红斑狼疮(SLE)、银屑病性关节炎、炎症性肠病(IBS)关节炎、惠普尔病(Whipple’s disease)、肠脂代谢障碍、强直性脊柱炎(AS)、反应性关节炎、斯蒂尔病(Still’s disease)、缺血性坏死、黏液囊炎、纤维肌痛、痛风、血色沉着病、甲状腺功能减退、狼疮、莱姆病(Lyme disease)、第五病(Fifths disease)、软骨病、骨髓炎、骨佩吉特病(Paget’s disease of bone)、假性痛风、佝偻病、化脓性关节炎、肌腱炎、糖尿病、爱唐综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、肋软骨炎、佩特斯病(Perthes’disease)、马凡综合征(Marfan syndrome)、风湿热、结节性关节炎、色素绒毛结节性关节炎、硬皮病、多肌炎、结节性红斑、神经性关节病、镰状细胞病、肢端肥大症、淀粉样变性、急性结晶性滑膜炎、化脓性细菌感染、坏血病、血友病、软骨发育不全、疝形成、弥漫性特发性骨肥厚(DISH)、腱鞘囊肿、腰椎管狭窄、骶髂关节痛、SAPHO综合征、红细胞增多、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、羟磷灰石、白塞综合征(Behcet’s syndrome)、费尔特综合征(Felt’s syndrome)、乙肝、原发性干燥、及多软骨炎。
本发明的另一方面，关节疾病也可以是遗传、创伤(如，半月板撕裂)、机械性损伤(如，反复性动作)、营养缺乏及关节排列不整的结果。已经遭受初始损伤及/或创伤的关节往往在一段时间内发展为关节疾病。
该络合物、组合物及方法对其具有处置潜力的组织疾病(如，上皮组织、结缔组织、肌肉组合和神经组织)包括但不限于下列：自体免疫性组织疾病、退行性组织疾病、炎性组织疾病、感染性组织疾病、癌性组织疾病、病毒性组织疾病、真菌性组织疾病、源自损伤或创伤的组织疾病。这些组织及/或器官疾病可以是原发性疾病，或者可以由现有疾病及/或沉疴造成。实例包括淀粉样变性、心房颤动、惊厥、痉挛、皮肌炎、内生软骨瘤、纤维瘤、腰痛、遗传性结缔组织病变(如，马凡综合征、派罗尼病(Peyronie’s disease)、爱唐综合征、成骨不全症、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、先天性挛缩细长指)、自体免疫性结缔组织病变(如，全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征(Sjoegren’s syndrome)、混合结缔组织病变、银屑病性关节炎)、坏血病、肌肉疾病(如，肌肉肿瘤、肌肉萎缩症、废用性萎缩、失神经性萎缩、杜氏肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良)、肝病型重症肌无力、肌病、肌炎、骨化性肌炎、癌症、纤维肌痛、肌肉疲劳、痉挛、痉挛状态、扭伤、拉伤、脑损伤、脊髓损伤、神经胶质瘤、神经上皮瘤、高血压、心血管疾病、糖尿病、阿兹海默症(Alzheimer’s disease)、膀胱炎、AIDS、佝偻病、及神经鞘肿瘤。受到可使用本文揭示的组合物及方法处置的疾病影响的组织、器官及/或身体系统的实例包括但不限下列：免疫系统、感知器官(如，味觉、嗅觉、视觉、听觉器官)、消化系统(如，口、喉、咽、食道、腹部、胃、小肠、大肠、肝、胰)、泌尿生殖系统、内分泌系统、新陈代谢系统、心血管系统(如，心脏、血压、动脉)、血液学(如，血液化学)、泌尿器官(如，肾、输尿管、膀胱、男性尿道、女性尿道、男性生殖器官(如，睾丸及其包覆物、输精管、储精囊、射精管、阴经、前列腺、库珀氏腺)、女性生殖器官(如，卵巢、输卵管、子宫、阴道、阴蒂、巴氏腺(Bartholin’sglands)、外部器官、乳腺))、无管腺(如，甲状腺、甲状旁腺、胸腺、脑垂体、松果体、嗜铬系统和皮质系统、脾脏)、繁殖系统、呼吸系统(如，喉、气管、细支气管、肋膜、纵隔膜、肺)、中枢神经系统(如，神经、神经纤维)、皮肤、上皮(如，单层上皮、复层上皮、假复层柱状上皮、腺上皮)、结缔(如，松散结缔(如，蜂窝结缔、脂肪、网状结缔)、致密结缔(如，致密规则结缔、致密不规则结缔)、软骨(如，透明软骨、弹性软骨、纤维状软骨)、肌肉(如，骨骼肌(如，I型、II型、IIa型、IIx型、IIb型)、心肌、平滑肌)、神经(如，神经元(如，运动神经元、中间神经元、感觉神经元)、神经胶质、脊髓、神经、脑)。
本发明的另一方面，癌也可作为原发性肿瘤(如，肉瘤、血管外皮细胞瘤、结缔组织赘生物、软骨瘤、软骨肉瘤)或作为该对象身体不同部位原发性肿瘤转移的结果而存在于关节、组织及/或器官中。
使用siRNA的间接体内及体内基因治疗亦可用于关节、组织、及/或器官疾病中。这些朝向关节疾病的RNAi应用包括但不限于，1)以该疾病状态中相关的蛋白质或酶为靶向；2)以该疾病状态中相关因子的表达为靶向或降低该表达；以及3)以基因为靶向以保持或恢复化解健康和内稳态。例如，本发明的基因可包括ADAMTS(如，ADAMTS-4、ADAMTS-5)、MMPs(如MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13及其它MMPs)、ILs(如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-20、IL-21及其它ILs)、IL受体、IL受体关联蛋白质、IL受体拮抗剂、HLA-DRB1、PADI4、PTPN22、TNFAIP3、巨核细胞刺激因子、护骨素、NF-α配体的活化剂、STAT4、CCR6、TNFR-1、TNFR-2、RIP、TRADD、PAD2-PAD4、FOX3、CD-25、FAP、DPP、CD26、MK2、SIRT-1、FoxO3a、miR-24、miR-125-5p、muR-203、miR-140、miR-365、miR-146a、miR-27a、TNF-α、HLA、II型胶原、聚集蛋白聚糖、前列腺素、免疫球蛋白、IFN-γ、GM-CSF、PDGF、FGF、VEGF、BMPs(如，BMP-2、BMP-4、BMP-7、及其它BMPs)、TGF-β、IGF-1、IGF-2、及其相关受体蛋白等。例如，下述基因或蛋白质可促进关节炎如类风湿性关节炎：ADAMTS、MMPs、ILs、IL受体、IL受体关联蛋白、HLA、DRB1、PADI4基因、PTPN22基因、TNFAIP3基因、STAT4基因、TNFR-1、TNFR-2、RIP、TRADD、PAD2-PAD4蛋白、CCR6基因、miR-24、miR-125a-5p、mIR-365和miR-203。基因和蛋白质也可防止关节炎如青少年特发性关节炎：FOXP3及CD-25。此外，基因和蛋白质及其受体及其组合也可抑制关节炎如类风湿性关节炎或骨关节炎：IL受体拮抗剂、MK2、FAP、DPP-4/CD26、SIRT-1/FoxO3a、miR-140及miR-27a。最后，基因和蛋白质及其受体及其组合可介导关节炎进展和关节组织再生(如，软骨再生)：FGF、VEGF、BMPs、TGF-β、IGF-1、IGF-2、miR-146a。
纳米件输送siRNA、反义及/或抗-微RNA以消除基因及其相关蛋白质和蛋白质受体(如，ADAMTS、MMPs、IL-1)。另一实施例中，纳米件输送miRNA及/或mRNA以增加基因及其相关蛋白质和蛋白质受体的水平。例如，促进关节炎或其它关节疾病的基因及其分别编码的蛋白质的表达及/或相应蛋白质受体可以被消除；而抑制关节炎或其它其它关节疾病的基因及其分别编码的蛋白质的表达及/或相应蛋白质受体可以被增加。依据患者的需要或临床条件，介导关节炎进展和关节组织再生的基因表达和所编码蛋白质的产生及/或相应蛋白质受体可以被调节(或消除或增加)。
使用siRNA的间接体内和体内基因治疗也可用于组织及/或器官的癌症中。这些朝向癌症的RNAi应用包括但不限于，1)降低生长因子的表达，降低扩大细胞循环(如，Raf-1、PI-3激酶)的蛋白质、生长因子受体(如，EGFR、Her-2)、或对于支持肿瘤细胞(如，对于肿瘤血管内皮细胞，VEGF、VEGFR1-2)为关键的蛋白质；2)以抗凋亡因子(如，BCL-2)的表达为靶向或降低该表达；以及3)以朝向肿瘤降低免疫活化的蛋白质或酶为靶向。
本公开范畴内预期的癌症或赘生物包括但不限于，癌(即，源自上皮细胞的恶性肿瘤，例如，普通形式的乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌)、肉瘤(即，源自结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤)、淋巴瘤(即，源自造血细胞的恶性肿瘤)、白血病(即，源自造血细胞的恶性肿瘤)、生殖细胞肿瘤(即，源自全能性细胞的肿瘤，成人中最常见于睾丸或卵巢；胎儿、婴儿及幼儿中最常见于身体中线上，特别是尾骨尖端)、急变期肿瘤(即，类似于不成熟组织或胚胎组织的典型恶性肿瘤)等。
倾向于被本发明所涵盖的具体赘生物的实例包括但不限于，急性淋巴细胞白血病、髓细胞性白血病、急性儿童髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、与AIDS相关的癌症、与AIDS相关的淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(如，小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤)、非典型畸胎类/横纹肌样瘤、基底细胞癌、肝外胆管癌、盘灌溉、骨癌、骨肉瘤及恶性纤维组织细胞瘤、脑瘤(如，脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎类/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、髓质上皮瘤、中度分化型的松果体实质细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤及/或成松果体细胞瘤、视觉路径及/或下丘脑胶质瘤、脑及脊髓肿瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(如，胃肠类癌瘤)、未知原发性癌症、中枢神经系统(如，非典型畸胎类/横纹肌样肿瘤、胚胎性肿瘤(如，原发性淋巴瘤)、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、脊索癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性病变、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、尤文家族肿瘤(Ewing family oftumors)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(如，眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、胃癌、胃肠肿瘤(如，类癌瘤、间质瘤(gist)、间质细胞肿瘤)、生殖细胞瘤(如，颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、卵巢癌)、妊娠性滋养层细胞瘤、胶质瘤(如，脑干胶质瘤、大脑星形细胞瘤)、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑及视觉路径胶质瘤、眼内黑色素瘤、岛细胞肿瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、大细胞肿瘤、喉癌(如，急性成淋巴细胞性、急性髓细胞性)、白血病(如，急性髓细胞性、慢性淋巴细胞性、慢性髓细胞性、毛细胞性)、唇及/或口腔癌、肝癌、肺癌(如，非小细胞性、小细胞性)、淋巴瘤(如，AIDS相关、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、瓦尔登斯特伦
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巨球蛋白血症、骨的恶性纤维性组织细胞瘤及/或骨肉瘤、成神经管细胞瘤、髓质上皮瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性颈部鳞状细胞癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样真菌病(mycosis fungoides)、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓及外骨髓增殖疾病、髓细胞性白血病(如，慢性、急性、多发性)、慢性骨髓增殖性病变、鼻腔及/或鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌症、口咽癌、骨肉瘤及/或骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(如，卵巢上皮细胞癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤)、胰腺癌(如，胰岛细胞肿瘤)、乳头瘤病、鼻窦及/或鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中度分化的松果体实质细胞肿瘤、成松果体细胞瘤及幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、直肠细胞癌、肾、骨盆及/或输尿管移行细胞癌、牵涉括染色体15上nut基因的呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾腺癌、肉瘤(如，尤文家族肿瘤、卡波西肿瘤、软组织肿瘤、子宫肿瘤)、赛扎来综合征(Sézarysyndrome)、皮肤癌(如，非黑色素瘤性、黑色素瘤性、梅克尔细胞性)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、原发性不详的转移性颈部鳞状细胞癌、胃癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌、咽喉癌；胸腺瘤及/或胸腺癌、甲状腺癌、肾、骨盆及/或输尿管的移行细胞癌；滋养层肿瘤、原发位点未知的癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉路径及/或下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特美国国家癌症研究所的全球性网站(cancer.gov/cancertopics/alphalist)。该领域技术人员应理解，所列举的仅为例示性用且不详尽，基于本文所揭露内容，该领域技术人员将轻易能够鉴别其它癌症及/或赘生物。
作为关节疾病的原发性癌症是实例包含结缔组织赘生物、血管外皮细胞瘤、肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、骨等。
该络合物、组合物及方法对其具有处置潜力的基因性及/或非肿瘤性疾病的实例包括但不限于下列：腺苷脱氨酶缺乏；嘌呤核苷磷酸酯酶缺乏；p47phox缺陷的慢性肉芽肿性疾病；具HbS的镰状细胞性贫血，β-地中海贫血；范康尼贫血(Faconi’s anemia)；家族性高胆固醇血症；苯丙酮尿症；鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏；载脂蛋白E缺乏；甲型和乙型血友病；肌肉萎缩症；囊胞性纤维化；帕金森症、色素性视网膜炎、溶酶体贮积病(如，1型粘多糖、亨特氏(Hunter)症、赫勒氏(Hurler)症、及高雪氏(Gaucher)症)、糖尿病视网膜病变、人免疫缺陷病毒疾病病毒感染、后天性贫血、心血管及外周血管疾病、骨质疏松症和关节炎。一些此类疾病中，该治疗性基因可编码该基因性或后天下疾病的替代酶或蛋白质、反义或核糖酶分子、诱饵分子、或自杀基因产物。
重组细胞可使用本发明的络合物生产。所得重组细胞可通过该领域已知的多种方法输送至对象。某些具体实施例中，该重组细胞是例如皮下注射或关节内注射。重组血细胞(如，造血干细胞或祖细胞)优选静脉给药或关节内给药。该细胞也可密封在适当载具内，并随后植入该对象(见，例如，Dionne et al.PCT Publication WO92/19195,dated Nov.12,1992)。所给药的细胞量取决于该领域中已知的多个因子，例如，该领域技术人员可轻易确定所希望的效果、对象的状态、嵌合多肽的表达率等。
本公开的另一方面提供使用玫瑰形纳米管将治疗剂或诊断剂引入细胞或组织基质中的方法。生物活性剂也称为“治疗剂”或“药物”，与玫瑰形纳米管络合以形成纳米管-药物络合物，该络合物可进入该细胞及/或组织并释放该药物。该领域技术人员将会确认药物，该药物是包括任何合成元素或天然元素的化合物或是引入身体内时造成所希望的生物响应如改变身体功能的化合物。药物或生物活性剂或治疗剂的非限制性实例包括抗炎剂(如，甾体抗炎剂和非载体抗炎剂)、止痛剂、麻醉剂、化疗剂、抗恶性细胞增生剂、细胞毒素剂、甾体剂、抗真菌剂、抗病毒剂、免疫抑制剂，且包括小分子。药物或生物活性剂或治疗剂的进一步的非限制性实例包括肽(如RGD、KRSR、YIGSR、IKVAV等)；芳香族生物活性分子，如它莫西芬、地塞米松、维生素K等；抗生素，如青霉素、链霉素、庆大霉素等；葡萄糖胺、软骨素、可的松、糖皮质激素、氢化可的松、透明质酸、皮质醇、庆大霉素等；以及蛋白质，如骨形态发生蛋白、基质蛋白等。药物或生物活性剂或治疗剂可以是疏水的或亲水的。根据一方面，该玫瑰形纳米管包括位于该结构芯部分内的疏水性部位，其中，疏水性药物、生物活性剂或治疗剂可位于该复合物中。根据另一方面，本公开的玫瑰形纳米管可具有亲水性外表面，以促进该络合物在生理环境中的给药。
止痛剂的实例包括本公开范畴内可与玫瑰形纳米管络合的阿片类止痛剂和止痛助剂，包括氯压定、替扎尼定(tizanidine)、加巴喷丁(gapapentin)、普瑞巴林、拉莫三嗪、奥卡西平、托吡酯、左乙拉西坦(levitiracetam)、噻加宾(tigabine)、唑尼沙胺、卡巴咪嗪、丙戊酸(valprioc acid)、苯妥英、阿米替林、去甲替林、地昔帕明、丙咪嗪、多虑平、帕罗西汀、西酞普兰、依他普仑(escitalopram)、氟西汀、文拉法辛(venlafaxine)、度洛西汀、安非他酮(bupriopion)、美西律、利多卡因、巴氯芬、环苯扎林、邻甲苯海明、美他沙酮、美索巴莫、吗啡、氢可酮、氢化吗啡酮、反胺苯环醇、羟考酮、羟吗啡酮、芬太尼、美沙酮、辣椒素、洛哌丁胺、纳洛酮、杜冷丁、丁丙诺啡、布托啡诺、可待因、羟甲左吗喃(levorphanol)、哌替啶、美沙酮、纳丁啡(nabuphine)、丙氧酚(propoxyphene)、及喷他佐辛。
可与玫瑰形纳米管络合的本发明范畴内的非阿片类和抗炎剂的实例包括：对乙酰氨基酚、阿司匹林、二氟尼柳、三水杨酸胆碱镁、双水杨酯、布洛芬、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬(fluriprofen)、奥沙普秦、吲哚美辛、舒林酸、萘丁美酮、双氯灭痛、酮咯酸、托来汀(tolectin)、吡罗昔康、美洛昔康、甲灭酸、甲氯灭酸、塞来昔布、别嘌呤醇、右美沙芬、聚乙二醇重组尿酸酶(pegloticase)、右布洛芬(dexibuprofen)、依托度酸、非诺洛芬、氟灭酸、氟比洛芬(flupbiprofen)、氯诺昔康、氯索洛芬、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、吡罗昔康、替诺昔康、托美丁(tolmetin)、及托灭酸(tolfenamic acid)。
可与玫瑰形纳米管络合的本发明范畴内的免疫抑制剂的实例包括：烷基化剂、抗代谢物、高剂量皮质类固醇、咪唑硫嘌呤、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)、环孢霉素、甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、阿巴卡韦、阿昔单抗、阿达木单抗、阿地白介素、六甲蜜胺、氨鲁米特、amprevenir、阿那白滞素(anakinra)、阿那曲唑、天冬酰胺酶(aspariginase)、咪唑硫嘌呤、巴利昔单抗、倍他米松、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、西多福韦、顺铂、克拉屈滨、可的松、环孢霉素、阿糖胞苷、达卡巴嗪(decarbazine)、达卡珠单抗(dacuzumab)、更生霉素、柔红霉素、地拉夫定(delaviridine)、地塞米松、地达诺新、阿霉素、依法韦仑、表柔比星、雌莫司汀、依那西普、依托泊苷、依西美坦、氟脲苷(foxuridine)、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、氢化可的松、羟化氯喹、羟基脲、依达比星(idaubicin)、异环磷酰胺(ifosphamide)、茚地那韦、英利昔单抗(infliximab)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β-2b、干扰素β-2a、干扰素γ-1b、白介素-2、伊立替康、异维甲酸、拉米夫定(lamivudine)、来氟米特、来曲唑、亮丙瑞林、氮芥(mechloethamine)、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲基强的松龙(methylpregnisolone)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、麦考酚酯、奈非那韦、奈韦拉平、紫杉醇(paclitaxel)、培门冬酶、青霉胺、喷司他丁、吡美莫司(pimecroslimus)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、氢化泼尼松、波尼松(predisone)、普利昔单抗(priliximab)、甲基苄肼、利托那韦、利妥昔单抗、沙奎那韦、沙格司亭(sargamomstim)、司他夫定、链脲霉素(strepozocin)、他克莫司(tacrolismus)、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、曲妥珠单抗、维甲酸、去炎松、乌拉莫司汀(uracil mustard)、戊柔比星(valrubucin)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、扎西他滨、齐多夫定。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的抗真菌剂的实例包括：多烯、唑、烯丙胺、吗啉、以及抗代谢物抗真菌剂，如，两性霉素B、坎底辛(candicin)、菲律宾霉素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素、龟裂霉素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑(econozole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑、酮康唑、氟康唑(luiconazole)、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、曲康唑(traconazole)、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬(amorolfin)、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、灰黄霉素、托萘酯、及十一碳烯酸。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的抗生素的实例包括：氨基糖苷类(如，阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星(metilmicin)、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、奇霉素)、安莎霉素类(anasamycins)(如，格尔德霉素、除莠霉素、riflaximin)、罗拉卡比(loracerbef)、碳青霉烯类(如，厄他培南、多利培南、西司他丁、美罗培南)、头孢菌素类(如，头孢羟氨卡、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟唑、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑(cefdotoren)、头孢噻肟、头孢布烯、头孢唑肟、头孢吡肟、头孢洛林、头孢托罗(ceftobioprole)、替考拉宁(teichoplanin)、万古霉素、特拉万星、克林霉素、洁霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南(azetreonam)、呋喃唑酮(flurazolidone)、利奈唑胺、泼斯唑来(posizolid)、雷得唑来(radezolid)、特地佐利(torezolid)、氨比西林、阿洛西林(azolocillin)、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林(dicloxaxillin)、青霉素)、多肽类(如，杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B)、喹诺酮类(如，环丙沙星(ciproflaxin)、依诺沙星、吉米沙星、诺氟沙星)、磺胺类(如，磺胺米隆(malfenide)、磺胺甲二唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺嘧啶)、四环素类(如，地美环素、米诺环素、强力霉素(doxycycline)、四环素)、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平(riflampicin)、利福布丁、利福喷丁、链霉素、胂凡纳明、氯霉素(chloramthenicol)、磷霉素(foffmycin)、梭链孢酸、甲硝哒唑、莫匹罗星、平板霉素、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、及甲氧苄啶。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的药物的实例包括：葡萄糖胺、软骨素、可的松、糖皮质激素、氢化可的松、透明质酸、皮质醇、及润滑剂(如，粘膜多糖(lubricin))。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的抗癌药物的实例包括：硼替佐米([(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧代-3-苯基-2-[(吡嗪基羰基)胺基]丙基]胺基]丁基]硼酸；MG-341；
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)；MG-132(N-[(苯基甲氧基)羰基]-L-亮氨酰-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-L-亮氨酰胺)；嘧啶类似物(如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)；嘌呤类似物；叶酸盐拮抗剂及相关抑制剂(如，巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁及2-氯脱氧腺苷[克拉屈滨])；叶酸类似物(如，甲氨蝶呤)；抗肿瘤剂，包括长春生物碱(如，长春碱、长春新碱、及长春瑞滨)和丸烷基化剂如氮芥类(如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺及类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺类及甲基蜜胺类(如，六甲蜜胺和噻替哌)、烷基磺酸酯类(白消安)、亚硝基脲类(如，卡莫司汀(BCNU)及类似物、链脲菌素)、三氮烯类(氮烯咪胺(dacarbazinine)(DTIC))；微管破坏剂(如，紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和长春瑞滨、及替尼泊苷)；放线菌素、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺(Cytoxan)、更生霉素、道诺霉素、多西他赛、阿霉素、表柔比星、六甲蜜胺、奥沙利铂、异环磷酰胺、美法仑、二氯甲基二乙胺(merchlorethamine)、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、普卡霉素、甲基苄肼、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP 16)；更生霉素(放线菌素D)、道诺霉素、阿霉素(亚德里亚霉素)、伊达比星、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)及丝裂霉素；L-天冬酰胺酶；抗血小板剂；铂配位络合物(如，顺铂、卡铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素和激素类似物(如，雌激素、它莫西芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)；芳香化酶抑制剂(如，来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(如，肝素、合成肝素盐及凝血酶的其它抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如，组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、COX-2抑制剂、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗转移剂；抗分泌剂(如，布雷菲尔德菌素(breveldin))；免疫抑制剂(如，环孢霉素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、咪唑硫嘌呤、吗替麦考酚酯)；抗血管生成化合物(如，TNP-470、染料木素)和生长因子抑制剂(如，血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂、表皮生长因子(EGF)抑制剂)；血管紧张肽受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(如，曲妥珠单抗
Figure GDA0001238979400000591
)；细胞循环抑制剂和分化诱导剂(如，维甲酸)；mTOR(哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白)抑制剂(如，依维莫司、西罗莫司)；拓扑异构酶抑制剂(如阿霉素(亚德里亚美素)、安吖啶、喜树碱、道诺霉素、更生霉素、替尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、伊立替康(CPT-11)及米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)；皮质类固醇类(如，可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、强的松、及泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂；以及半胱天冬酶激活剂等。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的抗癌药物的实例包括：阿伦单抗(alemtuzumab)；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；天冬酰胺酶；贝伐单抗；比卡鲁胺；博来霉素；硼替佐米；戈舍瑞林(buserelin)；白消安；喜树碱；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；CeaVac；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；克拉屈滨；氯膦酸盐；秋水仙碱；环磷酰胺；环丙孕酮；阿糖胞苷；达卡巴嗪；达利珠单抗；更生霉素；道诺霉素；双烯雌酚；己烯雌酚；多西他赛；阿霉素；依觉洛单抗(edrecolomab)；表柔比星；依帕珠单抗；埃罗替尼；雌二醇；雌氮芥；依托泊苷；依西美坦；非格司亭；氟达拉滨；氟氢可的松；氟尿嘧啶；氟羟甲睾酮；氟他米特；吉西他滨；吉妥珠单抗；染料木素；戈舍瑞林；huJ591；羟基脲；替依莫单抗(ibritumomab)；伊达比星；异环磷酰胺；IGN-101；伊马替尼；干扰素；伊立替康；依洛替康(ironotecan)、来曲唑；亚叶酸；亮丙瑞林；左旋咪唑；林妥珠单抗；洛莫司汀；MDX-210；二氯甲基二乙胺；甲羟孕酮；甲地孕酮；美法仑；巯嘌呤；美司钠；甲氨蝶呤；丝裂霉素；米托坦；米托蒽醌；米妥莫单抗；尼鲁米特；诺考达唑；奥曲肽；奥沙利铂；紫杉醇；氨羟二磷酸二钠；喷司他丁；帕妥珠单抗；普卡霉素；卟菲尔钠(porfimer)、甲基苄肼；雷替曲塞；利妥昔单抗；链脲菌素；舒尼替尼；苏拉明；它莫西芬；替莫唑胺；替尼泊苷；睾酮；沙利度胺；硫鸟嘌呤；噻替哌；二氯环戊二烯钛；拓扑替康；托西莫单抗；曲妥珠单抗；维甲酸；瓦塔拉尼(vatalanib)；长春碱；长春新碱；长春地辛；及长春瑞滨等。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的NMDA受体拮抗剂的实例包括：LY274614(十氢-6-(膦酰甲基)-3-异喹啉甲酸)、LY 235959[(3S,4aR,6S,8aR)-十氢-6-(膦酰甲基)-3-异喹啉甲酸]、LY 233053((2R,4S)-rel-4-(1H-四唑-5-基-甲基)-2-哌啶甲酸)、NPC 12626(α-胺基-2-(2-膦酰乙基)-环己基丙酸)、还原型和氧化型谷胱甘肽、胺基甲酸硫酮(carbamathione)、AP-5(5-膦酰基-戊氨酸)、CPP(4-(3-膦酰丙基)-2-哌嗪-甲酸)、CGS-19755(seifotel，顺-4(膦酰-甲基)-2-哌啶-甲酸)、CGP-37849((3E)-2-胺基-4-甲基-5-膦酰基-3-戊烯酸、CGP 39551((3E)-2-胺基-4-甲基-5-膦酰基-3-戊烯酸-1-乙酯)、SDZ220-581[(αS)-α-胺基-2’-氯-5-(膦酰甲基)-[1,1’-联苯]-3-丙酸]、及S-亚硝基谷胱甘肽；金刚烷胺、阿替加奈(aptiganel)(
Figure GDA0001238979400000601
CNS 1102)、卡罗维林、去甲右美沙芬(dextrorphan)、右美沙芬、富勒烯、伊博格碱、氯胺酮、利多卡因、美金刚、地佐环平(MK-801)、neramexane(MRZ 2/579，1,3,3,5,5-五甲基-环己烷胺)、NPS 1506(德芦西明(delucemine)，3-氟-γ-(盐酸3-氟苯基)-N-甲基-苯丙胺)、苯环己哌啶、乙胺噻吩环己酮(tiletamine)和瑞玛西胺(remacemide)；阿坎酸、蚶碱(arcaine)、芋螺睡眠肽(conantokin)-G、依利罗地(eliprodil)(SL 82-0715)、氟哌丁苯、艾芬地尔、曲索罗地(traxoprodil)(CP-101,606)、及Ro 25-6981[(±)-(R,S)-α-(4-羟基苯基)-β-甲基-4-(苯基甲基)-1-哌啶丙醇]；胺基环丙甲酸(ACPC)、7-氯犬尿喹啉酸、D-环丝氨酸、加维斯替奈(gavestinel)(GV-150526)、GV-196771A(4,6-二氯-3-[(E)-(2-氧代-1-苯基-3-吡咯烷叉)甲基]-1H-吲哚-2-甲酸单钠盐)、力可替奈(licostinel)(ACEA1021)、MRZ-2/576(8-氯-2,3-二氢哒嗪并[4,5-b]喹啉-1,4-二酮5-氧化物2-羟基-N,N,N-三甲基-乙铵盐)、L-701,324(7-氯-4-羟基-3-(3-苯氧苯基)-2(1H)-喹啉酮)、HA-966(3-胺基-1-羟基-2-吡咯烷酮)、及ZD-9379(7-氯-4-羟基-2-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-1,2,5,10-四-氢化哒嗪并[4,5-b]喹啉-1,10-二酮钠盐)；氧化型和还原型谷胱甘肽、S-亚硝基谷胱甘肽、硝普钠、依布硒啉、及双硫仑、DETC-MeSO、胺基甲酸硫酮；CNQX(1,2,3,4-四氢-7-硝基-2,3-二氧代-6-喹恶啉甲腈)及DNQX(1,4-二氢-6,7-二硝基-2,3-喹恶啉二酮)等。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的亚型特异性NMDA受体拮抗剂的实例包括：蚶碱、蜘蛛毒素(argiotoxin 636)、Co 101244(PD174494、Ro 63-1908、1-[2-(4-羟基苯氧基)乙基]-4-[(4-甲基苯基)甲基-4-哌啶醇]、去郁敏(despiramine)、右美沙芬、去甲右美沙芬、依利罗地、氟哌丁苯、艾芬地尔、美金刚、蜂毒毒素(philanthotoxin343)、Ro-25-6981([(±)-(R*,S*)-α-(4-羟基苯基)-β-甲基-4-(苯基甲基)-1-哌啶丙醇])、曲索罗地(CP-101,606)、Ro 04-5595(1-[2-(4-氯苯基)乙基]-1,2,3,4-四氢-6-甲氧基-2-甲基-7-异喹啉醇)、CPP[4-(3-膦酰丙基)-2-哌嗪甲酸]、芋螺睡眠肽G、精胺、亚精胺、NVP-AAM077[[[[(1S)-1-(4-溴苯基)乙基]胺基](1,2,3,4-四氢-2,3-二氧代-5-喹恶啉基)甲基]-磷酸]；以及1-(菲-2-羰基)哌嗪-2,3-二酸等。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的抗痉挛药的实例包括：巴比妥类(如，甲基苯巴比妥和戊巴比妥钠)；苯二氮平类，如阿普唑仑
Figure GDA0001238979400000611
氯羟去甲安定、氯硝安定、氯拉卓酸二钾、及安定
Figure GDA0001238979400000612
GABA类似物，如噻加宾、加巴喷丁(α2δ拮抗剂，
Figure GDA0001238979400000613
)、及β-羟基丙酸；海因类，如5,5-二苯基-2,4-咪唑啉二酮(苯妥英，
Figure GDA0001238979400000614
)及磷苯妥英钠；苯基三嗪类，如拉莫三嗪；琥珀酰亚胺类，如甲琥胺和乙琥胺；5H-二苯并氮卓-5-甲酰胺(卡马西平(carbamazepine))；奥卡西平；双丙戊酸钠；非氨酯、左乙拉西坦、普里米酮；唑尼沙胺；托吡酯；及丙戊酸钠。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的精神病学药物的实例包括：阿立哌唑(Abilify)、盐酸多虑平(Adapin)、Adartrel、Adderall、Alepam、Alertec、Aloperidin、Alplax、Alprax、阿普唑仑(Alprazolam)、Alviz、Alzolam、金刚烷胺(Amantadine)、安必恩(Ambien)、氨磺必利(Amisulpride)、阿米替林(Amitriptyline)、阿莫沙平(Amoxapine)、Amfebutamone、Anafranil、Anatensol、Ansial、Ansiced、Antabus、安塔布司(Antabuse)、Antideprin、Anxiron、Apo-Alpraz、Apo-Primidone、Apo-Sertral、Aponal、Apozepam、阿立哌唑(Aripiprazole)、Aropax、安坦(Artane)、Asendin、Asendis、Asentra、Ativan、阿托西汀(Atomoxetine)、Aurorix、Aventyl、Axoren、Beneficat、Benperidol、Bimaran、Bioperidolo、Biston、Brotopon、Bespar、丁胺苯丙酮(Bupropion)、Buspar、Buspimen、Buspinol、丁螺环酮(Buspirone)、Buspisal、Cabaser、卡麦角林(Cabergoline)、Calepsin、碳酸钙、氰氨化钙、Calmax、卡马西平、Carbatrol、Carbolith、Celexa、Chloraldurat、Chloralhydrat、利眠宁(Chlordiazepoxide)、氯丙嗪(Chlorpromazine)、Cibalith-S、Cipralex、西酞普兰(Citalopram)、氯丙咪嗪(Clomipramine)、氯硝安定、氯氮平、Clozaril、Concerta、Constan、Convulex、Cylert、Dapotum、Daquiran、Daytrana、Defanyl、盐酸氟胺安定(Dalmane)、Damixane、Demolox、Depad、Depakene、Depakote、Depixol、Desyrel、Dostinex、右旋安非他命、Dexedrine、安定、Didrex、Divalproex、Dogmatyl、Dolophine、氟哌利多(Droperidol)、Edronax、Efectin、Effexor(Efexor)、Eglonyl、Einalon S、Elavil、Elontril、Endep、Epanutin、Epitol、Equetro、Escitalopram、Eskalith、Eskazinyl、Eskazine、Etrafon、Eukystol、Eunerpan、Faverin、Fazaclo、Fevarin、Finlepsin、Fludecate、Flunanthate、氟西汀、氟非那嗪(Fluphenazine)、Flurazepam、Fluspi、Fluspirilen、氟伏沙明、Focalin、加巴喷丁、Geodon、Gladem、Glianimon、Halcion、Halomonth、Haldol、氟哌啶醇、Halosten、Imap、丙咪嗪、忆梦返(Imovane)、JJanimine、Jatroneural、Kalma、Keselan、Klonopin、拉莫三嗪、Largactil、Lecital、Levomepromazine、Levoprome、Leponex、Lexapro、Libritabs、利眠宁、Linton、Liskantin、Lithane、Lithium、Lithizine、Lithobid、Lithonate、Lithotabs、氯羟去甲安定(Lorazepam)、Loxapac、洛沙平、Loxitane、Ludiomil、Lunesta、Lustral、Luvox、Lyrica、Lyogen、Manegan、Manerix、马普替林(Maprotiline)、Mellaril、Melleretten、Melleril、Melneurin、Melperone、Meresa、Mesoridazine、Metadate、甲基苯丙胺、Methotrimeprazine、Methylin、哌醋甲酯(Methylphenidate)、Minitran、Mirapex、Mirapexine、吗氯贝胺(Moclobemide)、莫达非尼(Modafinil)、Modalina、Modecate、Moditen、Molipaxin、Moxadil、Murelax、Myidone、Mylepsinum、Mysoline、Nardil、Narol、Navane、Nefazodone、Neoperidol、加巴喷丁、Nipolept、Norebox、Normison、Norpramine、去甲替林、Novodorm、奥氮平、Omca、Oprymea、Orap、去甲羟基安定(Oxazepam)、Pamelor、Parnate、帕罗西汀、Paxil、Peluces、匹莫林(Pemoline)、培高利特(Pergolide)、Permax、Permitil、奋乃静、Pertofrane、Phenelzine、苯妥英、哌迷清(Pimozide)、Piportil、Pipotiazine、Pragmarel、普拉克索、普瑞巴林、普里米酮、Prolift、氟奋乃静(Prolixin)、异丙嗪、Prothipendyl、普罗替林、Provigil、百忧解(Prozac)、Prysoline、Psymion、喹硫平、Ralozam、Reboxetine、Resimatil、Restoril、Restyl、Requip、Rhotrimine、维思通(Risperdal)、利培酮、Rispolept、利他林(Ritalin)、Rivotril、Ropark、Ropinerole、Rubifen、Rozerem、Sediten、Seduxen、Selecten、舒宁(Serax)、Serenace、Serepax、Serenase、Serentil、Seresta、Serlain、Serlift、Seroquel、赛乐特(Seroxat)、Sertan、舍曲林、Serzone、Sevinol、Sideril、Sifrol、Sigaperidol、多虑平(Sinequan)、Sinqualone、Sinquan、Sirtal、Solanax、Solian、Solvex、Songar、Stazepin、三氟拉嗪(Stelazine)、Stilnox、Stimuloton、Strattera、舒必利、Sulpiride Ratiopharm、SulpirideNeurazpharm、Surmontil、Symbyax、Symmetrel、Tafil、氯羟安定(Tavor)、Taxagon、酰胺咪嗪(Tegretol)、Telesmin、羟基安定(Temazepam)、Temesta、Temposil、Terfluzine、甲硫哒嗪、甲哌硫丙硫蒽(Thiothixene)、Thombran、氯丙嗪(Thorazine)、Timonil、盐酸丙咪嗪(Tofranil)、Tradon、Tramadol、Tramal、Trancin、Tranax、Trankimazin、Tranquinal、前内心百乐明(Tranylcypromine)、Trazalon、曲唑酮、Trazonil、Trialodine、Trevilor、三唑仑、甲哌氟丙嗪(Trifluoperazine)、Trihexane、苯海索(Trihexyphenidyl)、奋乃静(Trilafon)、三甲丙咪嗪(Trimipramine)、Triptil、Trittico、Troxal、Tryptanol、盐酸曲马多(Ultram)、Valium、Valproate、丙戊酸、Valrelease、Vasiprax、文拉法辛(Venlafaxine)、Vestra、Vigicer、Vivactil、Wellbutrin、赞安诺(Xanax)、Xanor、Xydep、Zamhexal、Zeldox、Zimovane、Zispin、齐拉西酮、Zolarem、Zoldac、左洛复、唑吡坦、Zonalon、佐匹克隆、佐替平、Zydis、再普乐(Zyprexa)等。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的其它类药物的实例包括：去甲替林、阿米替林(amytriptyline)、氟西汀
Figure GDA0001238979400000641
盐酸帕罗西汀
Figure GDA0001238979400000642
三甲丙咪嗪、奥卡西平
Figure GDA0001238979400000643
乙哌立松、米索前列醇(前列腺素E1类似物)、拉坦前列素(前列腺素F2
Figure GDA0001238979400000644
类似物)、褪黑素、及类固醇(如，孕烯醇酮、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、甲基强的松龙、及其它抗炎类固醇)等。
可与玫瑰形纳米管络合的本公开范畴内的抗病毒药物的实例包括：阿巴卡韦、阿昔洛韦(Aciclovir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦(Amprenavir)、安普利近、阿比朵尔(Arbidol)、阿扎那韦(Atazanavir)、立普妥(Atripla)(固定剂量药物)、博赛泼维(Boceprevir)、西多福韦、可比韦(固定剂量药物)、地瑞那韦(Darunavir)、地拉夫定、地达诺新、二十二醇、依度尿苷(Edoxudine)、依法韦仑(Efavirenz)、恩曲他滨、恩夫韦地(Enfuvirtide)、恩替卡韦、进入抑制剂、泛昔洛韦、固定剂量组合(抗逆转录病毒)、福米韦生(Fomivirsen)、福沙那韦(Fosamprenavir)、膦甲酸钠(Foscarnet)、膦乙酸钠(Fosfonet)、融合抑制剂、更昔洛韦、伊巴他滨(Ibacitabine)、Imunovir、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺(Loviride)、马拉维诺(Maraviroc)、吗啉胍(Moroxydine)、甲吲噻腙(Methisazone)、奈非那韦、奈韦拉平、Nexavir、核苷类似物、奥司他韦(Tamiflu)、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、Pleconaril、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂(药学)、雷特拉韦(Raltegravir)、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、嘧啶、沙奎那韦(Saquinavir)、司他夫定、协同增强剂(抗逆转录病毒)、茶树油、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir disoproxil)、替拉那韦(Tipranavir)、三氟尿苷、三协唯(Trizivir)、曲金刚烷(Tromantadine)、特鲁瓦达(Truvada)、伐昔洛韦(Valtrex)、缬更昔洛韦、Vicriviroc、阿糖腺苷(Vidarabine)、Viramidine、扎西他滨、扎那米韦(Relenza)、齐多夫定等。
间接体内和体内治疗及/或诊断也可用于关节疾病。指向这些关节疾病的这些治疗性和诊断性应用包括但不限于，1)以与该疾病状态相关联的蛋白质或酶为靶向；2)以与该疾病状态相关联的因子表达为靶向或降低该表达；以及3)以基因为靶向以维持或恢复关节健康和体内平衡。例如，可使用纳米件输送分子探针以检测炎症标记物(如，细胞因子、MMP、ADAMS)等的表达或输送治疗剂以处置疼痛、炎症、感染等。
另一实施例中，演示用以检测惟损害关节软骨的关节炎早期阶段的分子改变的体内成像技术。骨关节炎(OA)是一种最常见的致残原因。但是，OA早期诊断工具的缺失妨碍了对该疾病的用以减缓关节软骨流失并缓解患者痛苦的预防和处置。OA生物标记物倡议(Biomarker Initiative)已经鉴别了一系列生物标记物，包括基质金属蛋白酶(MMP)，该酶于OA发病过程中在关节软骨中的含量升高。但是，血清中MMP蛋白质水平或活性的检测可能不够敏感，而更敏感的对MMP转录本的检测需要侵入性过程一获得关节接合组织的活体组织样本。因此，迫切需要研发敏感的体内成像技术以检测未损害关节软骨的关节炎早期阶段的分子改变。
详而言之，分子信标(MB)技术提供了用以检测活体动物体内mRNA水平改变的有趣的可能性。事实上，分子信标(MB)技术(图51)检测了活体动物体内mRNA水平的改变。该分子信标包含寡核苷酸环圈、双链茎干、及荧光团和淬火剂，由于荧光团与淬火剂邻近，该分子信标保持为不发射荧光。一旦进入细胞并与其靶标mRNA杂交，MB在该荧光团与淬火剂分离后发射荧光(图52)。但是，在本发明之前，由于在体内将MB输送至关节组织的巨大挑战性，没有使用MB检测OA的报导。因为体内将MB输送至关节组织的缘故，使用MB检测OA极具挑战性。在使用MB检测破坏内侧半月板(DMM)鼠模型中OA以检测MMP-13转录本的感应性的早期检测中显示，一种主要的基质蛋白酶在关节炎过程中降解间隙胶原基质。使用源自玫瑰形纳米管的纳米件进行MMP13 MB的体内输送。由于软骨是荷大量负电荷的组织(含有巨量的蛋白聚糖)，荷负电的纳米件倾向于结合并蓄积在基质及/或组织上及/或内部，导致更长的滞留时间以实现更有效的输送。可创建不同尺寸的纳米件用于不同输送用途以进入基质。例如，软骨组织基质具有约60nm目径的胶原II纤维状网络和约20nm侧链间间隔的蛋白聚糖网络。小尺寸的纳米件(至少一个维度上小于60nm及/或20nm)在siRNA的软骨基质内输送中显现有益的效率和功能。调节RNT与舱试剂的比以获得整体荷正电的表面，令纳米件能与荷负电的基质及/或组织粘合，导致更长的滞留时间。
因此，使用这些经加工的纳米件实现关节内的输送。使用纳米件输送分子探针，连同以实时、原位及非侵入方式进行精确诊断的同时输送用于非特异性信号的阴性对照和内部阳性对照一起，检测了特异性基因表达(或蛋白质活性)。基质金属蛋白酶(MMP)是子啊关节炎进展过程中降解细胞外基质组分的主要的酶。MMP-13，通常由软骨及骨骼制造，在OA和RA两者中降解间隙胶原(I型、II型和III型)。在正常细胞中，MMP-13的表达低，然而在病理情况中，过量的MMP-13生产与验证相关。MMP-13的mRNA水平是关节炎发展的标志，且MMP-13在关节炎的早期诊断中是良好的靶标。但是，需要收集关节软骨组织以显示MMP-13 mRNA水平的上调。分子信标与纳米件组合的技术以不损害任何关节组织的特异性和敏感方式进行OA的体内检测。
另一实施例中，与纳米管络合的治疗剂可消除一种或多种疾病基因表达(如，经由siRNA输送)及/或上调一种或多种有益基因及/或蛋白质(如，经由DNA、mRNA或蛋白质输送)，并输送多种类型的舱，且可同时输送多种舱试剂。
据此，本公开的玫瑰形纳米管具有可用于封装药物的中空通道。玫瑰形纳米管能通过与芯的疏水作用将水溶性药物合并入其管状结构中，然而它们的亲水性外表面能将此类疏水性药物屏蔽在生理环境之外以用于后续的延期释放(甚至是释放入细胞内)。也可使用肽如Arg-Gly-Asp-Ser-Lys、Lys-Arg-Ser-Arg-Lys、及Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys对玫瑰形纳米管进行化学功能化，以在输送药物以杀死癌细胞后，输送用于健康组织如骨肉瘤患者体内健康骨骼再生的生长因子。
该玫瑰形纳米管也可用于组织工程学，其中，使用活体细胞作为工程材料。使用组织工程学应用来修复或替换整体组织如骨骼、软骨、血管、肌肉等的一部分。在实验室内，从工程学加工的细胞外基质(“支架”)、细胞、和生物活性分子的组合制造用于移植的组织。例如，鼻软骨细胞可在培养基内扩展以工程加工为软骨移植物。使用该领域技术人员已知的组织工程学技术，本公开的玫瑰形纳米管可在组织工程学方法中用作支架，如使用鼻软骨细胞，以及用作转运载具以将治疗剂输送至特异性组织如软骨。
用作剂/输送舱的基因和蛋白质
下述基因和蛋白质可用作剂以与纳米管和纳米件络合：
下述基因和蛋白质可作为与纳米管和纳米件络合的siRNA的靶标基因：
编码人ADAMTS-5的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_007038.3，通过引用而并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:1)。
Figure GDA0001238979400000671
Figure GDA0001238979400000681
Figure GDA0001238979400000691
Figure GDA0001238979400000701
Figure GDA0001238979400000711
人ADAMTS-5(前蛋白原)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_008969.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:2)。
Figure GDA0001238979400000712
以人ADAMTS-5 mRNA为靶标的包括下述序列(SEQ ID NO:3至6)：
SEQ NO:3：5’-GCUCAAAGCUGCAGUAUGA-3’
SEQ NO:4：5’-GAAGUCCACUCCAAAAGUA-3’
SEQ NO:5：5’-GCACUACGAUGCAGCUAUC-3’
SEQ NO:6：5’-CGAAGGAAAUUCUAAUAGU-3’
以人ADAMTS-5 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:7至9)：
SEQ NO 7：5’-CCGGTC TAACATTTCTTCAACAAGCA GACCGG-3’
SEQ NO 8：5’-CCGGTC TTATACACAAACATGAAGCAGACCGG-3’
SEQ NO 9：5’-CCGGTC TACATCTTATTAAAACAGCA GACCGG-3’
编码人ADAMTS-4的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_005099.4，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:10)。
Figure GDA0001238979400000721
Figure GDA0001238979400000731
人ADAMTS-4(前蛋白原)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_005090.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:11)。
Figure GDA0001238979400000732
Figure GDA0001238979400000741
以人ADAMTS-4 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:12至15)：
SEQ NO:12：5’-CCGCAAUCCUGUCAGCUUG-3’
SEQ NO:13：5’-GCGCUUUGCUUCACUGAGU-3’
SEQ NO:14：5’-GGACACACGCCUCCGAUAC-3’
SEQ NO:15：5’-GCACCGAAGAGCACAGAUU-3’
以人ADAMTS-4 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:16至18)：
SEQ NO:16：5’-CCGGTC TTTTCACACACACACACACG GACCGG-3’
SEQ NO:17：5’-CCGGTC TAAAAATACAAAAATTAGCC GACCGG-3’
SEQ NO:18：5’-CCGGTC TTGTCTCTGTCTCTTTCCTC GACCGG-3’
编码人MMP-13的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_002427.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:19)。
Figure GDA0001238979400000742
Figure GDA0001238979400000751
人MMP-13(胶原酶3前蛋白原)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_002418.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:20)。
Figure GDA0001238979400000752
Figure GDA0001238979400000761
以人MMP-13 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:21至24)：
SEQ NO:21：5’-UUUCACACACACACACACGC-3’
SEQ NO:22：5’-UUUUCACACACACACACACG-3’
SEQ NO:23：5’-UAAAAAUACAAAAAUUAGCC-3’
SEQ NO:24：5’-UUUGUCUCUGUCUCUUUCCU-3’
以人MMP-13 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:25至27)：
SEQ NO 25：5’-CCGGTC TACACACACCACTTATACCT GACCGG-3’
SEQ NO 26：5’-CCGGTC TATAATCTCAGCTACTCGGG GACCGG-3’
SEQ NO 27：5’-CCGGTC AAACAAAACAAAAATTAGCC GACCGG-3’
编码人MMP-1变种2的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_001145938.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:28)。
Figure GDA0001238979400000762
Figure GDA0001238979400000771
人MMP-1(间质胶原酶同工型2)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001139410.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:29)。
Figure GDA0001238979400000772
以人MMP-1变种1 mRNA为靶标的siRNA包括下列序列(SEQ ID NO:30至33)：
SEQ NO:30：5’-UUAGCUUACUGUCACACGC-3’
SEQ NO:31：5’-UUAUAUUCAUCAUACCUCC-3’
SEQ NO:32：5’-UUGUCUUCUUUCUCAGUGC-3’
SEQ NO:33：5’-UUCGUAAGCAGCUUCAAGC-3’
以人MMP-1变种1 mRNA为靶标的分子信标包括下列序列(SEQ ID NO:34至36)：
SEQ NO 34：5’-CCGGTC TTCGTAAGCAGCTTCAAGC GACCGG-3’
SEQ NO 35：5’-CCGGTC TAAAGAACATCACTTTCC GACCGG-3’
SEQ NO 36：5’-CCGGTC TAAAACAGTAGAAACAAGG GACCGG-3’
编码人MMP-9的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_004994.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:37)。
Figure GDA0001238979400000773
Figure GDA0001238979400000781
人MMP-9(前蛋白原)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_004985.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:38)。
Figure GDA0001238979400000782
Figure GDA0001238979400000791
以人MMP-9 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:39至42)：
SEQ NO:39：5’-UUGUCGCUGUCAAAGUUCGAG-3’
SEQ NO:40：5’-UUCUUGUCGCUGUCAAAGUUC-3’
SEQ NO:41：5’-UUCAACUCACUCCGGGAACUC-3’
SEQ NO:42：5’-UUCACGUCGUCCUUAUGCAAG-3’
以人MMP-9 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:43至45)：
SEQ NO:43：5’-CCGGTC TTGTCGCTGTCAAAGTTCGGACCGG-3’
SEQ NO:44：5’-CCGGTC TTATTAGAAACACTCCAAC GACCGG-3’
SEQ NO:45：5’-CCGGTC ATTCACGTCGTCCTTATGC GACCGG-3’
编码人MMP-3的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_002422.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:46)。
Figure GDA0001238979400000792
Figure GDA0001238979400000801
人MMP-3(前蛋白原)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_002413.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:47)。
Figure GDA0001238979400000802
以人MMP-3 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:48至51)：
SEQ NO:48：5’-UUCAUCAUCAUCAAAGUGGG-3’
SEQ NO:49：5’-UAAUAACAUAAAAAUGACCG-3’
SEQ NO:50：5’-UAGUCUACACAGAUACAGUC-3’
SEQ NO:51：5’-UAUAUCAUCUUGAGACAGGC-3’
以人MMP-3 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:52至54)：
SEQ NO 52：5’-CCGGTC TATATCATCTTGAGACAGGC GACCGG-3’
SEQ NO 53：5’-CCGGTC TTTCTCTTCTCATCAAATCT GACCGG-3’
SEQ NO 54：5’-CCGGTC TAACAAACTGTTTCACATCT GACCGG-3’
编码人IL-1α的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000575.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:55)。
Figure GDA0001238979400000803
Figure GDA0001238979400000811
Figure GDA0001238979400000821
人IL-1α(前蛋白)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000566.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:56)。
Figure GDA0001238979400000822
以人IL-1αmRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:57至60)：
SEQ NO:57：5’-UUUCUAUGUUCAUUCAACUC-3’
SEQ NO:58：5’-UCAUUCAACUCGAUACUGGC-3’
SEQ NO:59：5’-UUCAUUCAACUCGAUACUGG-3’
SEQ NO:60：5’-UAAUAGUUCUAAUAGUAGCU-3’
以人IL-1αmRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:61至63)：
SEQ NO 61：5’-CCGGTC TTTCTTAGTTTTCTTATGCC GACCGG-3’
SEQ NO 62：5’-CCGGTC TAATAGTTCTAATAGTAGC GACCGG-3’
SEQ NO 63：5’-CCGGTC TATGAACTGTCAACACTGC GACCGG-3’
编码人IL-1β的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000576.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:64)。
Figure GDA0001238979400000823
Figure GDA0001238979400000831
人IL-1β(前蛋白)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000567.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:65)。
Figure GDA0001238979400000832
以人IL-1βmRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:66至69)：
SEQ NO:66：5’-UUAUCAUCUUUCAACACGCAG-3’
SEQ NO:67：5’-UUUUACAGACACUGCUACUUC-3’
SEQ NO:68：5’-UUUGUCAUUACUUUCUUCUCC-3’
SEQ NO:69：5’-UACAGACACUGCUACUUCUUG-3’
以人IL-1βmRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:70至72)：
SEQ NO:70：5’-CCGGTC TTTTGTCATTACTTTCTTCTC GACCGG-3’
SEQ NO:71：5’-CCGGTC TTTCAGTCTTAATTAAAGGAC GACCGG-3’
SEQ NO:72：5’-CCGGTC TTACATAAATTAACTCAGCT GACCGG-3’
编码人IL-6的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000600.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:73)。
Figure GDA0001238979400000833
Figure GDA0001238979400000841
人IL-6(前体)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000591.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:74)。
Figure GDA0001238979400000842
以人IL-6 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:75至78)：
SEQ NO:75：5’-UAAAAUAGUGUCCUAACGCUC-3’
SEQ NO:76：5’-UCACUACUCUCAAAUCUGUUC-3’
SEQ NO:77：5’-UUACUCUUGUUACAUGUCUCC-3’
SEQ NO:78：5’-UAACGCUCAUACUUUUAGUUC-3’
以人IL-6 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:79至81)：
SEQ NO 79：5’-CCGGTC TTACTCTTGTTACATGTCYCC GACCTT-3’
SEQ NO 80：5’-CCGGTC TTACTCTTGTTACATGTCTCC GACCTT-3’
SEQ NO 81：5’-CCGGTC TACATAAAATGTTTCAAGTGG GACCTT-3’
编码人IL-8的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000584.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:82)。
Figure GDA0001238979400000843
Figure GDA0001238979400000851
人IL-8(前体)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000575.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:83)。
Figure GDA0001238979400000852
以人IL-8 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:84至87)：
SEQ NO:84：5’-UUUGUUUAAUCUAAAAACCC-3’
SEQ NO:85：5’-UUUACACACAGUGAGAUGGU-3’
SEQ NO:86：5’-UUCAAAUAUCACAUUCUAGC-3’
SEQ NO:87：5’-UUAUGCACUGACAUCUAAGU-3’
以人IL-8 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:88至90)：
SEQ NO 88：5’-CCGGTC TATCACATTCTAGCAAACCC GACCGG-3’
SEQ NO 89：5’-CCGGTC TACTAGAGAACTTATGCACC GACCGG-3’
SEQ NO 90：5’-CCGGTC TAGTTCTAACTCATTATTCC GACCGG-3’
编码1型人IL-1R变种1的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000877.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:91)。
Figure GDA0001238979400000861
Figure GDA0001238979400000871
Figure GDA0001238979400000881
1型人IL-1R同工型1前体的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000868.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:92)。
Figure GDA0001238979400000882
以1型人IL-1R变种1 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:93至96)：
SEQ NO:93：5’-UUUCUUCUCACAAACGUGCC-3’
SEQ NO:94：5’-UUAUACCAAGUUAUAGUGCC-3’
SEQ NO:95：5’-UUGUAAAACAUCUAAUAGGC-3’
SEQ NO:96：5’-UUUCCACACUGUAAUAGUCU-3’
以1型人IL-1R变种1 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:97至99)：
SEQ NO 97:5'-CCGGTC TTTCTTCTCACAAACGTGC GACCGG-3'
SEQ NO 98:5'-CCGGTC TTAAACACAAAAATATCAC GACCGG-3'
SEQ NO 99:5'-CCGGTC TTTCCACACTGTAATAGTC GACCGG-3'
编码人TNF-α的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000594.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:100)。
Figure GDA0001238979400000883
Figure GDA0001238979400000891
人TNF-α的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000585.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:101)。
Figure GDA0001238979400000892
以人TNF-αmRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:102至105)：
SEQ NO:102：5’-AAUAAAUAAUCACAAGUGC-3’
SEQ NO:103：5’-UAAAAAACAUAAUCAAAAG-3’
SEQ NO:104：5’-UAAUAAAUAAUCACAAGUG-3’
SEQ NO:105：5’-UUUUCUUUUCUAAGCAAAC-3’
以人TNF-αmRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:106至108)：
SEQ NO 106：5’-CCGGTC AAACATAATCAAAAGAAGG GACCGG-3’
SEQ NO 107：5’-CCGGTC TAAAAAACATAATCAAAAG GACCGG-3’
SEQ NO 108：5’-CCGGTC TATTTTAAAAAACATAATC GACCGG-3’
编码VEGF A变种1的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_001025366.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:109)。
Figure GDA0001238979400000901
Figure GDA0001238979400000911
人VEGF A同工型1的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001020537.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:110)。
Figure GDA0001238979400000912
以人VEGF A变种1 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:111至114)：
SEQ NO:111：5’-UAAAACUCUCUAAUCUUCCGG-3’
SEQ NO:112：5’-UUCCUUCUCUUCUUCCUCCUC-3’
SEQ NO:113：5’-UAUACACACAAAUACAAGUUG-3’
SEQ NO:114：5’-UUAAAACGAGAAACAAUACAG-3’
以人VEGF A变种1 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:115至117)：
SEQ NO 115：5’-CCGGTC TAAAACTCTCTAATCTTCC GACCGG-3’
SEQ NO 116：5’-CCGGTC TTTGATCCGCATAATCTGC GACCGG-3’
SEQ NO 117：5’-CCGGTC TTGAAATTAAATATTAACC GACCGG-3’
编码人TGF-β 1的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000660.5，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:118)。
Figure GDA0001238979400000921
Figure GDA0001238979400000931
人TGF-β 1(前体)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000651.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:119)。
Figure GDA0001238979400000932
以人TGF-β 1 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:120至123)：
SEQ NO:120：5’-UAUUGUCUUCUUCACUAUC-3’
SEQ NO:121：5’-UAGAUCUAACUACAGUAGU-3’
SEQ NO:122：5’-UAUAUGCUGUGUGUACUCU-3’
SEQ NO:123：5’-UAUAUAUGCUGUGUGUACU-3’
以人TGF-β 1 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:124至126)：
SEQ NO 124：5’-CCGGTC ATATATGCTGTGTGTACTC GACCGG-3’
SEQ NO 125：5’-CCGGTC TTTTATTGTCTTCTTCACT GACCGG-3’
SEQ NO 126：5’-CCGGTC TATATATGCTGTGTGTACT GACCGG-3’
编码人TGF-β 2变种1的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_001135599.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:127)。
Figure GDA0001238979400000933
Figure GDA0001238979400000941
Figure GDA0001238979400000951
Figure GDA0001238979400000961
人TGF-β 2同工型1前体的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001129071.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:128)。
Figure GDA0001238979400000962
以TGF-β 2变种1 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:129至132)：
SEQ NO:129：5’-UAUCUCUAUCUCAAUCUGUC-3’
SEQ NO:130：5’-UUCUAUCUCUAUCUCAAUCU-3’
SEQ NO:131：5’-UUCUCUUUCUAUCUCUAUCU-3’
SEQ NO:132：5’-UCUAUCUCUAUCUCAAUCUG-3’
以TGF-β 2变种1 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ IDNO:133至135)：
SEQ NO 133：5’-CCGGTC TTCTATCTCTATCTCAATC GACCGG-3’
SEQ NO 134：5’-CCGGTC TATCTCTATCTCAATCTGT GACCGG-3’
SEQ NO 135：5’-CCGGTC TTCTCTTTCTATCTCTATC GACCGG-3’
编码人IGF-1变种4的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000618.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:136)。
Figure GDA0001238979400000963
Figure GDA0001238979400000971
Figure GDA0001238979400000981
Figure GDA0001238979400000991
人IGF-1同工型4前蛋白原的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000609.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:137)。
Figure GDA0001238979400000992
以人IGF-1变种4 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:138至141)：
SEQ NO:138：5’-UAAACUGAAUAUAAGCUGC-3’
SEQ NO:139：5’-UAAAAAAAUAUGUCUAUGC-3’
SEQ NO:140：5’-UUUAACAGGUAACUCGUGC-3’
SEQ NO:141：5’-UAACAAACUACAAAAUAGC-3’
以人IGF-1变种4 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:142至144)：
SEQ NO 142:5'-CCGGTC TAAACTGAATATAAGCTGCG GACCGG-3'
SEQ NO 143:5'-CCGGTC TTTAAATTCTTCTATTTGCC GACCGG-3'
SEQ NO 144:5'-CCGGTCTAATCAACTGACTTCCAGGGGACCGG-3'
编码人BMP-2的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_001200.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:145)。
Figure GDA0001238979400001001
Figure GDA0001238979400001011
人BMP-2前蛋白原的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001191.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:146)。
Figure GDA0001238979400001012
以人BMP-2 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:147至150)：
SEQ NO:147：5’-UUGUGAACUCAACAGUAGC-3’
SEQ NO:148：5’-UUAAUUUUGCUGUACUAGC-3’
SEQ NO:149：5’-UAAAACACAAAUAAAUUUC-3’
SEQ NO:150：5’-UUCUUUCUGUAAAUUAAGG-3’
以人BMP-2 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:151至153)：
SEQ NO 151：5’-CCGGTC TAATACAAAATAAATCTG GACCGG-3’
SEQ NO 152：5’-CCGGTC AAAACACAAATAAATTTCC GACCGG-3’
SEQ NO 153：5’-CCGGTC TTCATTCTCGTCAAGGTAC GACCGG-3’
编码人BMP-4变种1的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_001202.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:154)。
Figure GDA0001238979400001021
Figure GDA0001238979400001031
人BMP-4前蛋白原的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001193.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:155)。
Figure GDA0001238979400001032
以人BMP-4变种1 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:156至159)：
SEQ NO:156：5’-UAAUAAAACGACCAUCAGCA-3’
SEQ NO:157：5’-UAUCUGUCUAUCCUCAAGGA-3’
SEQ NO:158：5’-UUCUUAUUCUUCUUCCUGGC-3’
SEQ NO:159：5’-UAAUAAAACGACCAUCAGC-3’
以人BMP-4变种1 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:160至162)：
SEQ NO 160：5’-CCGGTC TATCTGTCTATCCTCAAGG GACCGG-3’
SEQ NO 161：5’-CCGGTC TCTCAGGTATCAAACTAGC GACCGG-3’
SEQ NO 162：5’-CCGGTC TTTGTCAAAATATATGATC GACCGG-3’
编码人BMP-7的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_001719.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:163)。
Figure GDA0001238979400001033
Figure GDA0001238979400001041
Figure GDA0001238979400001051
人BMP-7前体的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001710.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:164)。
Figure GDA0001238979400001052
以人BMP-7 mRNA为靶标的siRNA包括下述序列(SEQ ID NO:165至168)：
SEQ NO:165：5’-UUCCUAAUACUCUCACACC-3’
SEQ NO:166：5’-UAACAAAAAAUACUCCUCC-3’
SEQ NO:167：5’-UAAAUAAGAAAACAAACAGG-3’
SEQ NO:168：5’-UUCCUAAUACUCUCACACCU-3’
以人BMP-7 mRNA为靶标的分子信标包括下述序列(SEQ ID NO:169至171)：
SEQ NO 169：5’-CCGGTC TAACAAAAAATACTCCTCCC GACCGG-3’
SEQ NO 170：5’-CCGGTC TTGTAACAACUATTTACAGG GACCGG-3’
SEQ NO 171：5’-CCGGTC TAAATAAGAAAACAAACAG GACCGG-3’
编码人IL-1受体拮抗剂变种3的mRNA转录本序列，基因银行登录号为NM_000577.4，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:172)。
Figure GDA0001238979400001053
Figure GDA0001238979400001061
人IL-1受体拮抗剂同工型小3的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000568.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:173)。
Figure GDA0001238979400001062
人microRNA140的前miRNA序列，基因银行登录号为NR_029681.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:174)。
5’-UGUGUCUCUCUCUGUGUCCUGCCAGUGGUUUUACCCUAUGGUAGGUUACGUCAUGCUGUUCUACCACAGGGUAGAACCACGGACAGGAUACCGGGGCACC-3’
及成熟microRNA140(SEQ ID NO:175)。
5’-cagugguuuuacccuaugguag-3’
人microRNA36的前miRNA序列，基因银行登录号为NR_029854.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:176)。
5’-ACCGCAGGGAAAAUGAGGGACUUUUGGGGGCAGAUGUGUUUCCAUUCCACUAUCAUAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAUUGCUCUUGCA-3’
及成熟microRNA365(SEQ ID NO:177)：
5’-AGGGACUUUUGGGGGCAGAUGUG-3’
人RNA125a的前miRNA序列，基因银行登录号为NR_029693.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:178)。
5'-UGCCAGUCUCUAGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACAUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGGCGUCUGGCC-3'
及两个成熟microRNA125a(SEQ ID NO:179至180)：
SEQ ID NO:179:hsa-mir-125a-5p:5’-ucccugagacccuuuaaccuguga–3’\
SEQ ID NO:180:hsa-mir-125a-3p:5’-acaggugagguucuugggagcc–3’
编码人IL-15的mRNA序列，基因银行登录号为BC018149.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:181)。
Figure GDA0001238979400001071
Figure GDA0001238979400001081
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人IL-15的氨基酸序列，基因银行登录号为AAH18149.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:182)。
Figure GDA0001238979400001082
编码人IL-20(白介素-20前体)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_018724.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:183)。
Figure GDA0001238979400001083
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人IL-20(白介素-20前体)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_061194.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ IDNO:184)。
Figure GDA0001238979400001091
编码人PADI4(4型蛋白质-精氨酸脱亚氨酶)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_012387.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:185)。
Figure GDA0001238979400001092
Figure GDA0001238979400001101
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人PADI4(4型蛋白质-精氨酸脱亚氨酶)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_036519.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:186)。
Figure GDA0001238979400001102
编码人HLA-DRB1的mRNA序列，基因银行登录号为HQ267233.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:187)。
Figure GDA0001238979400001103
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人HLA-DRB1的氨基酸序列，基因银行登录号为ADZ73424.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:188)。
Figure GDA0001238979400001111
编码人PTPN22的mRNA，基因银行登录号为BC071670.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:189)。
Figure GDA0001238979400001112
Figure GDA0001238979400001121
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人PTPN22的氨基酸序列，基因银行登录号为AAH716701.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:190)。
Figure GDA0001238979400001122
Figure GDA0001238979400001131
编码人TNFAIP3的mRNA序列，基因银行登录号为BC114480.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:191)。
Figure GDA0001238979400001132
Figure GDA0001238979400001141
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人TNFAIP3的氨基酸序列，基因银行登录号为AAI14481.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:192)。
Figure GDA0001238979400001142
Figure GDA0001238979400001151
编码人STAT4的mRNA序列，基因银行登录号为L78440.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:193)。
Figure GDA0001238979400001152
Figure GDA0001238979400001161
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人STAT4的氨基酸序列，基因银行登录号为AAB05605.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:194)。
Figure GDA0001238979400001162
编码人CCR6的mRNA序列，基因银行登录号为AY242126.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:195)。
Figure GDA0001238979400001163
Figure GDA0001238979400001171
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人CCR6的氨基酸序列，基因银行登录号为AAO92293.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:196)。
Figure GDA0001238979400001172
编码人TNFR-1(肿瘤坏死因子受体1)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_001065.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:197)。
Figure GDA0001238979400001173
Figure GDA0001238979400001181
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人TNFR-1(肿瘤坏死因子受体1)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001056.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQID NO:198)。
Figure GDA0001238979400001182
编码人TNFR-2的mRNA序列，基因银行登录号为M55994.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:199)。
Figure GDA0001238979400001183
Figure GDA0001238979400001191
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人TNFR-2的氨基酸序列，基因银行登录号为AAA36755.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:200)。
Figure GDA0001238979400001192
Figure GDA0001238979400001201
编码人细胞死亡蛋白(RIP)的mRNA序列，基因银行登录号为U25994.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:201)。
Figure GDA0001238979400001202
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人RIP的氨基酸序列，基因银行登录号为AAC50137.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:202)。
Figure GDA0001238979400001203
编码人TRADD的mRNA序列，基因银行登录号为NM_003789.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:203)。
Figure GDA0001238979400001211
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人TRADD的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_00370.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:204)。
Figure GDA0001238979400001212
编码人PADI2(2型蛋白质-精氨酸脱亚氨酶)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_007365.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:205)。
Figure GDA0001238979400001221
Figure GDA0001238979400001231
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人PADI2(2型蛋白质-精氨酸脱亚氨酶)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_031391.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:206)。
Figure GDA0001238979400001232
Figure GDA0001238979400001241
编码人PAD3(PADI3)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_016233.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:207)。
Figure GDA0001238979400001242
Figure GDA0001238979400001251
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人PADI3(PAD3)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_057317.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:208)。
Figure GDA0001238979400001252
编码人FOXP3的mRNA序列，基因银行登录号为EF534714.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:209)。
Figure GDA0001238979400001253
Figure GDA0001238979400001261
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人FOXP3的氨基酸序列，基因银行登录号为ABQ15210.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:210)。
Figure GDA0001238979400001262
编码人IL2RA(CD-25)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_000417.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:211)。
Figure GDA0001238979400001263
Figure GDA0001238979400001271
Figure GDA0001238979400001281
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人IL2RA(CD-25)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_000408，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:212)。
Figure GDA0001238979400001282
编码人FAP(成纤维细胞活化蛋白)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_001291807.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:213)。
Figure GDA0001238979400001283
Figure GDA0001238979400001291
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人FAP(成纤维细胞活化蛋白)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001278736.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQID NO:214)。
Figure GDA0001238979400001292
Figure GDA0001238979400001301
编码人DPP4(二肽基肽酶4)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_001935.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:215)。
Figure GDA0001238979400001302
Figure GDA0001238979400001311
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人DPP-4(二肽基肽酶4)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001926.2，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:216)。
Figure GDA0001238979400001312
Figure GDA0001238979400001321
编码人CD26的mRNA序列，基因银行登录号为M74777.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:217)。
Figure GDA0001238979400001322
Figure GDA0001238979400001331
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人CD26的氨基酸序列，基因银行登录号为AAA51943.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:218)。
Figure GDA0001238979400001332
编码人SIRT1的mRNA序列，基因银行登录号为JQ768366.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:219)。
Figure GDA0001238979400001333
Figure GDA0001238979400001341
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人SIRT1的氨基酸序列，基因银行登录号为JQ768366.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:220)。
Figure GDA0001238979400001342
编码人FoxO3a(叉头框O3)的mRNA序列，基因银行登录号为NM_001455.3，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:221)。
Figure GDA0001238979400001343
Figure GDA0001238979400001351
Figure GDA0001238979400001361
Figure GDA0001238979400001371
该atg起始密码子和终止密码子加粗并加下划线。人FoxO3a(叉头框O3)的氨基酸序列，基因银行登录号为NP_001446.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:222)。
Figure GDA0001238979400001372
Figure GDA0001238979400001381
编码人MiR-24的mRNA序列，基因银行登录号为AF480527.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:223)。
1 tggctcagtt cagcaggaac ag(SEQ ID NO:223)
编码人MiR-125a-5p(hsa-mir-125a)的mRNA序列，基因银行登录号为LM608509.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:224)。
Figure GDA0001238979400001384
编码人MiR-203a(MiR-203)的mRNA序列，基因银行登录号为NR_029620.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:225)。
Figure GDA0001238979400001382
编码人MiR-140的mRNA序列，基因银行登录号为NR_029681.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:226)。
Figure GDA0001238979400001383
编码人MiR-27a的mRNA序列，基因银行登录号为NR_029501.1，通过引用并入本文，该序列显示如下(SEQ ID NO:227)。
Figure GDA0001238979400001385
配方和配量
根据某些实施例，本发明的药物组合物配制为与其所期望的给药途径相容。这类药物组合物可通过注射或输液至局部组织位点内如连接性关节内而给药，或通过吸入、经皮、口服、经直肠、经粘膜、经肠道、肠胃外、经肌肉、关节内、皮下、经静脉或该领域技术人员考虑本公开益处而可轻易选择的其它适当方法给药。例如，用于肠胃外、真皮内、关节内、或皮下应用的溶液或悬浮液可包括下述组分：无菌稀释剂如注射用水、生理盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；以及用于调节紧张性的剂，如氯化钠或右旋糖。可使用酸或碱如盐酸或氢氧化钠来调节pH。肠胃外及/或关节内制剂可密封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器、或多剂量药瓶中。
生物学可接受的介质包括但不限于，适用于本公开的络合物的所希望给药途径的任何及全部溶剂、分散介质等。这些用于药学活性物质的介质的使用是该领域已知的。除了与该小分子、蛋白质、多肽及/或肽的活性不相容的任何传统介质或剂，均设想为可用于本发明的药学制剂中。适当的载具和配方揭示于例如《雷鸣登药学大全》(Remington’sPharmaceutical Sciences.Mack Publishing Company,Easton,PA,USA 1985)一书中。这些载具包括可注射的配方。
本发明的络合物可通过任何适当途径给药。例如，药物制剂可以片剂或胶囊剂形式给药，可通过注射、输液、吸入、外用(如，通过洗剂或油膏)、栓剂、控释贴剂等给药。
本文中揭示的络合物可通过任何适当的给药途径给药至个体(如，人或动物如非人灵长动物)用于治疗，给药途径包括口服给药、鼻腔给药、直肠给药、阴道给药、肠胃外给药、关节内给药、脑池内给药、外用给药、颊腔给药、舌下给药、硬膜外给药等。
无论选择何种给药途径，本发明的药物组合物均配制为药学可接受的如下文揭示的剂型或通过该领域技术人员已知的其它传统方法配制。本文中揭示的药物组合物的实际剂量水平可以变动，以获得一定量的化合物，该化合物可有效实现组合物及给药模式对特定患者的所希望的治疗反应而对该患者无毒性。
使用本文中揭示的络合物或组合物处置关节疾病。例如，提供用于处置关节疾病患者的方法，该方法为对该管着给药治疗有效量的本发明络合物或组合物。对于基于局部注射(如，肿瘤内注射、关节内注射、肌肉内注射、注射至腹腔内、及雾化处置)的体内治疗，该RNT/小RNA络合物较佳是水溶性的且因此可作为水性注射液而给药。
所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性；给药途径；给药时间；所采用的具体化合物的排泄速率；该处置的持续时间；与所采用的具体化合物合用的其它药物、化合物及/或材料；被处置患者的年龄、性别、体重、症状、总体健康状况和先前病史；以及医疗领域已知的类似因素。具有该领域一般技能的医师、兽医或科研人员可轻易确定并开出所需的有效量的药物组合物。例如，为了实现所希望的疗效，医师、兽医或科研人员会在该药物组合物中采用低于所需水平的初始剂量的本发明化合物，并逐步增加剂量，直至实现所希望的效果。此外，使用不同的输送材料来给药不同的剂量和剂量范围。例如，纳米件证明了良好的生物相容性和低毒性。先前研究已经证明，体内给药25μg的输送纳米管(RNT)没有显着毒性(Journeay WS,et al.Int J Nanomedicine.2008；3(3)：373-83)。甚至在50μg剂量下，RNT所导致的炎症在7天后消失。与之相比，一些传统输送材料如碳纳米管可在低得多的剂量下造成炎症，且该炎症可持续两个月。在本系统中，5μg剂量的RNT纳米件在舱的输送中有效。因此，RNT纳米件的有效剂量显着低于其中毒剂量，提供良好的治疗指数。此外，RNT或TBLs显示了低于基于脂质的输送介质的毒性。图66中，在下述条件下分别培养ATDC5细胞：无添加(阴性对照)、0.1nmol非靶向siRNA与10μg RNT的纳米件、0.1nmol非靶向siRNA与2.5μg TBL的纳米件、或0.1nmol非靶向siRNA于6μgLipofectamine 2000。24小时后，使用Lipofectamine 2000培养的ATDC5细胞显示不正常的细胞形貌和大量细胞碎片，但是，使用RNT纳米件或TBL纳米件培养的细胞呈现与阴性对照相同的正常形貌。
通常，本发明化合物的适宜日剂量将为有效产生疗效的最低剂量。该有效剂量通常取决于上文揭示的因素。通常，本发明化合物用于患者的剂量范围将是从约0.0001至约100mg每千克体重每天，或从约0.001至30mg/kg体重，从约0.01至25mg/kg体重，从约0.1至20mg/kg体重，从约1至10mg/kg体重，从约2至9mg/kg体重，从约3至8mg/kg体重，从约4至7mg/kg体重，或从约5至6mg/kg体重。
熟练技工应了解，某些因素可影响有效处置对象所需的剂量，该因素包括但不限于，疾病或病变的严重性、先前处置、总体健康状况及/或患者的年龄和存在的其它疾病。此外，使用治疗有效量的生物活性剂处置对象可包括单一处置，或优选可包括一系列处置。也应了解，用于处置的有效剂量可在特定处置进程过程中增加或降低。剂量的改变可从诊断试验的结果获得。
若需要，该活性化合物的有效日剂量可作为一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多次剂量而视需要以单位剂量形式以适宜间隔在一天中独立给药。某些具体实施例中，每两天给药一次、每周给药两次、每周给药一次、或每月给药一次有效剂量。
本发明的络合物可不经任何处理而给药，或与药学可接受的载剂混合给药，也可与其它抗微生物剂如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类、糖肽类等联合给药。联合疗法包括依序、同时及单独给药活性化合物，给药方式为，当实施后续给药时，首先给药的化合物的疗效仍然存在。
本公开的另一方面提供药学可接受的组合物，该组合物包含治疗有效量的一种或多种本文所揭示的络合物，且该络合物与一种或多种药学可接受的载剂(添加剂)及/或稀释剂配伍。如下文所述，本公开的药物组合物可具体配制为用于以固体或液体形式给药，包括适用于下述的那些：(1)口服给药，例如，口服液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、丸药、粉剂、颗粒剂、用于舌上的贴剂；(2)肠胃外给药，例如，作为如溶液或悬浮液而通过皮下、肌肉、或静脉注射或关节内给药；(3)外用，例如，作为应用于皮肤的乳液、油膏、或喷雾；或(4)阴道给药或直肠给药，例如，作为阴道药栓、乳液或泡沫。但是，某些具体实施例中，对象络合物可简单溶解或分散于无菌水中。
润湿剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、覆盖剂、甜味剂、芳香剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于本发明的组合物中。
药学可接受的抗氧化剂的实例包括但不限于：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱胺酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、五倍子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬树、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的配方传统上可以单位剂量形式存在，且可通过药学领域中众所周知的任何方法制备。可与载剂材料合并以生产单剂型的活性成分的量将依据待处置个体和具体给药模式而改变。通常，可与载剂材料合并以生产单剂型的活性成分的量是该化合物产生疗效的量。通常，以百分比计，这一量的范围是从约1％至约99％的活性成分，从约5％至约70％，从约10％至约30％，从约15％至约25％，或从约18％至约22％。在供选择的具体实施例中，本发明的化合物可自身给药，如在不存在载剂材料下给药。
制备本发明配方或组合物的方法包括将本文中揭示的络合物与载剂以及视需要的一种或多种助剂联合的步骤。通常，通过下述步骤制备该配方：将本发明的络合物与液体载剂、细微分割的固体载剂、或两种载剂均匀地联合，以及，视需要，成形产物。
适用于口服给药的配方可以是胶囊、锭剂、丸剂、片剂、糖锭剂(使用香味基质如蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂、作为处于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、作为水包油或油包水乳液、作为酏剂或糖浆剂、作为糖果锭剂(使用惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶)、及/或作为漱口水等形式，各自含有预设量的本发明络合物作为活性成分。本发明的络合物也可作为兽用大药丸、舐剂或贴剂而给药。
油膏、贴剂、乳液和凝胶剂除了含有本公开的络合物外，也可含有赋形剂如动植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、云母和氧化锌、或其混合物。
粉剂和喷雾剂除了含有本公开的络合物外，也可含有赋形剂如乳糖、云母、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或这些物质的混合物。喷雾剂可额外含有惯用的推进剂如氯氟烃和挥发性未取代烃，如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有提供本发明络合物至身体的控制输送的额外优势。这些剂型可同将该络合物溶解或分散于适宜介质中而作成。也可使用吸收增强剂来增加该络合物跨越皮肤的通量。可通过提供控制膜的速率或将该络合物分散于聚合物基质或凝胶中而控制此通量速率。
本发明的适用于肠胃外给药的药物组合物包含一种或多种本发明的络合物，该络合物与一种或多种药物可接受的无菌等张水性或非水性溶液、分散于、悬浮液或乳液合并，或与可在使用前复原为可注射的无菌溶液或分散液的粉末合并，上述无菌液体或粉末可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使该配方与预定接收者的血液等张的溶质、或悬浮剂和增稠剂。
可用于本发明药物组合物中的适当水性和非水性载剂的实例包括：水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其适当的混合物；植物油，如橄榄油；以及可注射的有机酯类，如油酸乙酯。例如，可使用涂覆材料如卵磷脂、通过在分散液的例子中维持所需要的颗粒尺寸、以及通过使用表面活性剂来维持适宜的流动性。
这些组合物也可含有佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过内含多种抗细菌剂和抗真菌剂如尼泊金、氯丁醇、苯酚抗坏血酸等确保对微生物活化的阻止。也可能希望将等张剂如糖类、氯化钠等包括于该组合物中。此外，可通过内含吸收迟滞剂如单硬脂酸铝和明胶延长对该可注射药物形式的吸收。
通过形成该络合物在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中的微胶囊基质作成可注射的药性持久形式。依据药物与聚合物的比以及所用特定聚合物的特性，可控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚酐。还通过将药物陷入与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备药性持久的可注射配方。
根据某些实施例，本发明的络合物可并入适用于给药的药物组合物中。此类组合物典型包含本文中揭露的络合物以及药学可接受的载剂。本文中，术语“药学可接受的载剂”倾向于包括与给药方式相容的任何及全部溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收迟滞剂等。此类用于药学活性物质的介质和剂的使用是该领域中众所周知的。除了与该活性化合物不相容的，任何传统介质或剂在该组合物中的使用均被预期。补充的活性化合物也可并入该组合物中。
根据某些实施例，本发明的药物组合物配制为与其预期给药途径相容。此类药物组合物可通过吸入、关节内、透皮、口服、直肠、经粘膜、肠道、肠胃外、肌肉内、皮下、静脉给药或该领域技术人员在虑及本公开益处下可轻易选择的其它适当方法给药。例如，用于肠道外、关节内、皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可包括下述组分：无菌稀释剂如注射用水、生理盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节等张性的剂如氯化钠或右旋糖。可使用酸或件如盐酸或氢氧化钠来调节pH。肠胃外制剂可密封于玻璃或塑料作成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本公开指向形成输送络合物的方法，例如，通过将一种或多种剂与完全成形的玫瑰形纳米管或自组装为玫瑰形纳米管的模块如式I化合物或式II化合物混合。根据一方面，将粉末形式的完全成形的玫瑰形纳米管溶解于水中，并加热至沸腾。随后将该溶液冷却至室温。随后在适当温度将一种或多种剂加入该纳米管的溶液中，持续适当的时间，直至形成纳米管与一种或多种剂的络合物。该核酸与纳米管的适当的比为约0.01:1(wt/wt)至约1:0.1(wt/wt)。
定义
本文中，“烷基”指代饱和或不饱和脂肪族基团的原子团，包括直链烷基、烯基、或炔基，支链烷基、烯基、或炔基，环烷基、环烯基、或环炔基(脂环族)基团，烷基取代的环烷基、环烯基、或环炔基，以及环烷基取代的烷基、烯基、或炔基。除非明确排除，直链或支链烷基在其骨架中具有30个或更少碳原子(如，对于直链，C1-C30；对于支链，C3-C30)，更优选20个或更少碳原子，优选12个或更少碳原子，且最优选8个或更少碳原子。同样，优选环烷基在其环结构中具有3至10个碳原子，更优选在其环结构中具有5个、6个或7个碳。上文提供的范围包括最小值与最大值之间的全部值。
术语“烷基”包括“未取代烷基”和“取代烷基”两者，后者指代具有替代该烃骨架上一个或多个碳上氢的一个或多个取代基。此类取代基包括但不限于，卤素、羟基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲酰基、或乙酰基)、硫代羰基(如硫代酸酯、硫代乙酸酯、或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸盐、膦酸盐、亚膦酸盐、胺基、酰胺、亚氨、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸盐、磺酸盐、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或芳香族或杂芳香族部分。
除非碳的数目被具体排除，本文中，“低级烷基”意为如上文揭示的烷基，但在其骨架结构中具有1至10个碳，更优选1至6个碳。同样，“低级烯基”和“低级炔基”具有类似的链长度。优选烷基为低级烷基。
烷基也可在碳骨架中含有一个或多个杂原子。优选该并入碳骨架的杂原子为氧、氮、硫、及其组合。某些具体实施例中，该烷基含有1至4个之间的杂原子。
本文中，“烯基”和“炔基”指代含有一个或多个双键或三键的不饱和脂肪族基团，其长度与上文揭示的烷基类似(如，C2-C30)且具有可能的取代。
本文中，“卤素”指代氟、氯、溴或碘。
本文中，“视需要经取代”指本文中揭示的化合物的全部可允许的取代基。在最广泛意义上，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。例示性取代基包括但不限于，卤素、羟基、或含有任何数目的碳原子优选1至14个碳原子的任何其它有机基团，且视需要在线性、支链、或环状结构格式中包括一个或多个杂原子如氧、硫或氮。代表性取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、苯基、经取代的苯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、经取代的烷氧基、苯氧基、经取代的苯氧基、芳氧基、经取代的芳氧基、烷硫基、经取代的烷硫基、苯硫基、经取代的苯硫基、芳硫基、经取代的芳硫基、氰基、异氰基、经取代的异氰基、羰基、经取代的羰基、羧基、经取代的羧基、胺基、经取代的胺基、酰胺基、经取代的酰胺基、磺酰基、经取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、经取代的磷酰基、膦酰基、经取代的磷酰基、聚芳基、经取代的聚芳基、C3-C20环基、经取代的C3-C20环基、杂环基、经取代的杂环基、氨基酸、肽、及多肽基团。
杂原子如氮可具有氢取代基及/或满足该杂原子价态的本文中揭示的有机化合物的任何可允许的取代基。应理解，“取代”或“经取代的”包括隐藏的限制性条件，该条件为此取代是根据被取代的原子和取代基可允许的价态，且该取代导致稳定的化合物，即，不会自发通过例如重排、环化、消除等进行转化的化合物。
术语“氨基酸”包括20中常见氨基酸以及“非标准氨基酸”，例如，D-氨基酸和“常见”氨基酸的化学(或生物学)上制造的衍生物，包括，例如，β-氨基酸。据此，根据本公开的氨基酸包括一般已知的氨基酸如甘氨酸(Gly,G)、丙氨酸(Ala,A)、缬氨酸(Val,V)、亮氨酸(Leu,L)、异亮氨酸(Ile,I)、脯氨酸(Pro,P)、羟脯氨酸、苯丙氨酸(Phe,F)、酪氨酸(Tyr,Y)、色氨酸(Trp,W)、半胱氨酸(Cys,C)、蛋氨酸(Met,M)、丝氨酸(Ser,S)、邻磷酸丝氨酸、苏氨酸(Thr,T)、赖氨酸(Lys,K)、精氨酸(Arg,R)、组氨酸(His,H)、天冬氨酸盐(Asp,D)、谷氨酸盐(Glu,E)、γ-羧基谷氨酸盐、天冬酰胺(Asn,N)、谷氨酰胺(Gln,Q)等。氨基酸也包括其立体异构体和结构上与胺基酸或其修饰物和衍生物相似的化合物。本公开范畴内的例示性氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸盐等。本公开的氨基酸仅在其末端氨基处修饰。
氨基酸由氨(-NH2)和羧酸(-COOH)官能团与各氨基酸的具体侧链一起构成。氨基酸的关键元素是碳、氢、氧和氮，但在某些胺基酸的侧链中发现了其它元素。
下文所示结构中，Z表示各氨基酸的具体侧链。紧邻该羧基的碳原子(因此在侧链中从该官能团开始的编号为2)称为α-碳。含有直接键结至该α-碳的胺基的氨基酸指代为α-氨基酸。
Figure GDA0001238979400001461
氨基酸可分为含有亲水性侧链的氨基酸、含有疏水性侧链的氨基酸、及含有荷电侧链的氨基酸。参见下图，其中，侧链加阴影：
Figure GDA0001238979400001471
术语“肽”包括直链氨基酸链和支链氨基酸链两者以及环状氨基酸链，其包含至少两个氨基酸残基。本文中，术语“肽”和“多肽”互换使用。据此，根据本公开的多肽包括两个或更多个共价链接在一起的氨基酸。根据一方面，该两个或更多个氨基酸至少部分地通过一个或多个肽键共价链接在一起。本公开的多肽仅在其末端氨基处修饰。例如，全长度蛋白质的肽或片段在其长度中包含2、5、10、50、100、200、500 600、700、750、800、900、1000或更多氨基酸或多达参考蛋白的全长度。
如本文中可使用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸寡聚物”、“寡核苷酸”、“核酸序列”、“核酸片段”和“多核苷酸”互换使用，且倾向于包括但不限于共价链接在一起的可具有各种长度的聚合物形式的核苷酸，该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物、衍生物或修饰物。不同的多核苷酸可具有不同的三维结构，且可实施各种已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、基因间DNA(包括而不限于，异染色质DNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、序列的提取DNA、序列的提取RNA、核酸探针、以及引物。可用于本发明方法中的多核苷酸可包含天然核酸序列及其变种、人工核酸序列、或此类序列的组合。本文中，该领域技术人员用理解，术语“核酸探针”包括已知作为分子信标的探针，其包括可报导具体核酸在均相溶液或细胞中的存在的合成寡核苷酸杂交探针。分子信标的种类包括具有可检测标记物如内部淬火荧光团的发夹形分子，当该分子结合至靶标核酸序列时，该荧光团恢复荧光。技术上，分子信标可设计为以任何基因为靶标，且可与不同荧光波长的荧光分子链接。
多核苷酸典型由四种核苷酸碱基的具体序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T))。因此，术语“多核苷酸系列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，该术语可应用至多核苷酸分子本身。这一字母表示可输入具有中央处理器的计算机中的数据库中，且可用于生物信息学应用如功能基因组学和同源检索。多核苷酸可视需要包括一种或多种非标准核苷酸、核苷酸类似物及/或经修饰的核苷酸。
经修饰的核苷酸的实例包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基去氮鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基去氮鸟苷、5’-甲氧羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、假尿苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、去氮鸟苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。核酸分子也可在其碱基部分、糖部分或磷酸盐骨架上修饰。
术语“小RNA”用作其在该领域中所使用者，且包括以mRNA为靶标的RNA双链(每单链中30个碱基或更少)。小RNA可化学合成或酶促合成。根据本发明的小RNA可被合并，并随后在RISC(RNA-诱导型静默化络合物)中被活化。
“治疗有效量”是预防、迟滞、或减轻疾病发作严重性所必需的量，或是捕获或减轻进行中的疾病严重性所必需的量，且还包括增强正常生理功能所必需的量。
本文中广泛使用的词“转染”指代将外源化合物如多核苷酸序列引入原核细胞或真核细胞中；该输送包括而非限于，将外源核酸引入细胞中，可导致永生或非永生细胞株的永久性或临时性改变。据此，本公开的具体实施例包括引入多核苷酸序列以令该引入的多核苷酸被表达或抑制靶标基因的表达。
本文中，术语“药物”、“生物活性剂”和“治疗剂”互换使用，且倾向于包括，但不限于，那些被该领域技术人员认定为生物活性剂、或药物或治疗剂的化合物，且包括当被引入身体中时造成所希望的生物学响应如改变身体功能的任何合成或天然元素或化合物。
本文中，术语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”倾向于包括，但不限于，除肠内给药和外用给药外的给药模式，一般为注射，且包括而非限于静脉注射、肌肉注射、动脉注射、鞘内注射、囊内注射、眼眶内注射、心内注射、皮内注射、腹膜注射、经气管注射、皮下注射、表皮下注射、关节突点内注射、囊下注射、蛛网膜下注射、脊柱内注射、胸骨内注射、输液等。
本文中，术语“全身性给药”、“全身地给药”、“外周给药”和“外周地给药”倾向于包括，但不限于，化合物、药物或其它材料的除了直接给药至中枢神经系统之外的给药方式，由是，该化合物、药物或其它材料进入个体全身并因此进行新陈代谢及其它类似进程，该给药方式为，例如，皮下给药。
本文中，术语“处置”倾向于包括，但不限于，预防、治疗和治愈。接受处置的患者或个体为任何有需要的动物，如人、非人灵长动物、其其它哺乳动物如马、骆驼、牛、猪、绵羊、家禽、山羊、兔、鼠、豚鼠、狗、猫等。
本文中，术语“治疗有效量”倾向于包括，但不限于，包含本发明络合物的化合物、材料或组合物的量，该量至少在动物细胞亚群中有效产生所希望的疗效并因此以合理的效益风险比改变(如，减轻或增加)经处置细胞中一种或多种途径的生物学后果。
本文中，术语“药学可接受的”倾向于包括，但不限于，可靠医学判断范畴内适用于与人类及动物的组织接触的那些化合物、材料、组合物、及/或剂型，该化合物、材料、组合物、及/或剂型不具过度毒性、刺激、过敏响应、或其它问题或并发症且具有合理效益风险比。
本文中，“药学可接受的剂”(如盐、载剂、赋形剂或稀释剂)是具备下述特点的组分：(1)与该RNT/小RNA复合物相容，该药学可接受的剂可包括于输送组合物中而不削减该RNT/小RNA复合物转染细胞和输送小RNA的能力；以及(2)其中，该输送组合物倾向于治疗用途，适用于动物(如人)而不造成过分的不利副作用，如毒性、刺激和过敏响应。当副作用的风险比重大于该药剂所提供的效益时，则为“过分”的副作用。
本文中，术语“药学可接受的载剂”倾向于包括，但不限于，药学可接受的材料、组合物或载具，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂、或胶囊化材料，牵涉于将本公开的络合物从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一器官或身体的另一部分的过程中。从与该配方的其它成分相容且不对患者产生过分损害的意义上来说，每一载剂必须是“可接受的”。可用作药学可接受载剂的材料的实例包括但不限于：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末化黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)云母；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；以及(21)其它用于药学配方的非毒性相容物质，其可由该领域技术人员轻易确定。
本发明的化学化合物、多核苷酸、多肽和寡核苷酸经纯化及/或分离。纯化定义了对于给药至人类对象为安全的无菌程度，如，缺乏传染或毒性剂。具体来说，本文中，“经分离的”或“经纯化的”化合物、核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质或寡核苷酸，当通过重组技术生产时，基本上不含其它细胞材料或培养基；或当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学品。例如，经纯度组合物中感兴趣中化合物为至少60重量％(干重)。优选地，以感兴趣的化合物的干重计，该制剂中该化合物为至少75％，更优选至少90％，且最优选至少99％。通过任何适宜的标准方法测量纯度，例如，柱色谱、薄层色谱、或高效液相色谱(HPLC)分析。例如，经纯化的化合物指代已经从与其天然相关联的其它蛋白质、脂质、及和核酸分开的化合物。优选地，该化合物构成经纯化制剂的干重的至少10、20、50、70、80、90、95、99至100％。
“经分离的核酸”意指不含基因的核酸，在作为本发明DNA来源的有机体的天然出现的基因组中，为基因侧翼。该术语覆盖，例如：(a)DNA，是天然出现的基因组DNA分子的一部分，但其侧翼并没有下述核酸序列，该核酸序列在体内天然存在该基因组的有机体的基因组中位于该分子的一部分的侧翼；(b)核酸，并入载体中或原核细胞或真核细胞内的基因组DNA中，并入方式为造成所得分子与任何天然出现的载体或基因组DNA均不一致；(c)分开的分子，如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)生产的片段、或限制性片段；以及(d)重组核苷酸序列，是杂交基因的一部分，即编码融合蛋白的基因。根据本发明的经分离的核酸分子进一步包括合成产生的分子、以及经化学改变及/或经修饰骨架的任何核酸。
本文中，术语“患者”倾向于包括患有疾病的哺乳动物。此哺乳动物可以是人或另一动物如宠物(如，狗或猫)或工作性动物或牲畜(如，马、牛、猪)。
实施例
本文中揭示的实施例仅用于示例性说明而非限制。
实施例1
制造包括RNT和例示性舱或负载化合物的纳米件。舱剂与RNT组装为纳米件。随后，以siRNA纳米件为例，其证明可将纳米件故意加工为不同尺寸且荷不同电荷以用于基质渗透，如优先将该舱输送至具体组织类型。例如，将荷有净正电荷的纳米件作成输送负载化合物至荷负电的组织如软骨。
评估RNT/siRNA比与表面电荷之间的关系。选择该比以令纳米件上荷有净正电荷，纳米件具有与荷负电的组织基质(如，人关节软骨)的更佳结合能力以及在后者上的更长滞留时间。
对于体外和体内输送研究，使用软骨作为实例，盖因软骨是具有高基质组分的无血管组织，且软骨对于药物输送是颇具挑战性的组织。可使用其它靶标基质及/或组织，且将该纳米件的净电荷调整为优先以所选择的组织为靶向。显示所加工的纳米件被有效地输送至来自多个物种的软骨基质内以及软骨细胞内部。所输送的纳米件是全功能性的。使用聚乙二醇(PEG)的复合物来增加纳米件在富含蛋白环境(如血清)中的输送效率。大鼠和小鼠模型显示，经加工的纳米件成功实现了体内的跨基质及/或组织输送。
对于诊断，将用于疾病基因检测的MMP-13分子信标与作为非特异性信号阴性对照的非靶向杂乱分子信标和作为内部看家基因对照的GAPDH分子信标一起输送。荧光信号被精确地转译为非侵入性途径的基因表达水准示例，以在活体内进行实时、原位基因表达的检测。
对于治疗，使用细胞因子(IL-1β)来刺激软骨退化模拟关节，尤其是类风湿性关节炎。使用纳米件输送IL-1受体siRNA，体内鼠软骨中软骨细胞内的IL-1受体表达被消除，因此，如软骨退化基因(如MMP-13、MMP-9)被下调且软骨合成代谢基因(如Col II)被上调。
使用纳米件将ADAMTS-5 siRNA输送入使用细胞因子(IL-1α和视黄酸)刺激的鼠膝关节内。软骨退化被显着抑制。为了模拟骨关节炎进展，在鼠膝关节上进行内侧半月板的去稳定作用(DMM)。使用纳米件输送ADAMTS-5 siRNA，骨关节炎进展得以防止。这些数据表明，该纳米件可用以防止及/或抑制软骨退化和关节炎进展。
实施例2：
显示RNT成功组装入纳米件内(见ARROWS)，且使用它们来输送各种类型的舱试剂，该舱试剂包括小核酸(siRNA，图1)、长核酸(质粒DNA，图2)、肽和蛋白质(软骨基质蛋白抗体(Matrilin)-3，图3)以及小分子。
实施例2.1
如下述制造含有SiRNA作为舱的纳米件。将2μL的50μM siRNA溶液与10μL的1mg/mLRNT混合物混合。所得混合物超声波处理60秒(s)。稀释因子可为1至50μL的范围，用于制备siRNA-RNT络合物混合物，且所得混合物的超声波处理时间可从1至600s变动。结果显示于图1。
实施例2.2
如下述制造含有DNA的纳米件。将0.5μg DNA与10μL的1mg/mL RNT溶液混合。所得混合物超声波处理60s。稀释因子可为1至50μL的范围，用于制备DNA-RNT络合物混合物，且所得混合物的超声波处理时间可从1至600s变动。结果显示于图2。
实施例2.3
如下述制造含有Matrilin作为舱的纳米件。将10μL的100μg/mL Matrilin(MATN)蛋白质溶液与10μL的1mg/mL RNT混合。所得混合物随后超声波处理60s。稀释因子可为1至50μL的范围，用于制备MATN-RNT络合物混合物，且所得混合物的超声波处理时间可从1至600s变动。结果显示于图3。
实施例3：
纳米件的设计和加工
图4显示一种例示性的组装机制。加工方法被设计在组装之前、过程中及之后，以操纵纳米件的尺寸。取淬火和超声波处理作为组装之前加工方法的实例，图6和图7表明形成了比在标准条件下生成的那些(图5)更小的纳米件。图8和图9表示组装过程中及组装之后加工方法的实例中的尺寸分布。如图10所示，将小纳米件输送入细胞内。
实施例3.1
图5A至9B表明在透射电子显微镜下成像的不同尺寸和宽度的纳米件，且使用Image J软件分析该纳米件的长度和宽度。
使用下述例示性过程制备具有不同长度和宽度的纳米件。
实施例3.1A
将5μg的RNT在5μL水中的溶液与50pmol siRNA在10μL水中的溶液混合，随后将该混合物超声波处理2分钟(min)以生产纳米件(图5A和图5B)。
实施例3.1B:
将5μg的RNT在5μL水中的溶液加热至95℃，加热10min，随后立即将该溶液置于冰上。完全冷却至0℃后，将RNT溶液与50pmol siRNA在10μL水中的溶液混合，随后将该混合物超声波处理2min以生产纳米件(图6A和图6B)。
实施例3.1C:
将5μg的RNT在5μL水中的溶液加热至95℃，加热10min，随后立即将该溶液超声波处理5min。将所得RNT溶液与50pmol siRNA在10μL水中的溶液混合，随后将该混合物超声波处理2min以生产纳米件(图7A和图7B)。
实施例3.1D:
将5μg的RNT在5μL水中的溶液与50pmol siRNA在10μL0.9％盐水中的溶液混合，随后将该混合物超声波处理2min以生产纳米件(图8A和图8B)。
实施例3.1E:
将5μg的RNT在5μL水中的溶液与50pmol siRNA在10μL水中的溶液混合，随后将该混合物超声波处理4min以生产纳米件(图9A和图9B)。
实施例3.2
图10显示，使用未加工纳米件和经加工的纳米件将荧光标记的RNA输送至细胞内。将该纳米件加至软骨细胞，并将该细胞在标准细胞培养条件下维持24小时(h)。图10的左图显示被输送至细胞内的未加工的纳米件，而图10的右图显示被输送至细胞内的经加工的纳米件。
实施例3.3
揭示各种类型的纳米件及其加工方法。将纳米管转化为纳米棒。如图4所示，使用物理方法(超声波处理、掺混、微波处理、及/或淬火)或化学方法(改变pH、加入有机溶剂、及/或加入芳香族化学品)将纳米棒转化为均质的更短/更长纳米棒，以获得比标准条件(图5至7)更短/更长的纳米件。经超声波处理RNT、或加热RNT至90℃并随后在冰上淬火，生产纳米棒。使用RNT或纳米棒来形成纳米件。使用透射电子显微镜表征纳米件，并使用Image J软件分析纳米件的长度和宽度。
实施例3.4
使用各种类型的纳米件及其加工方法来定制物理特征如长度和宽度，及/或化学特征如该输送载具的表面电荷。可以改变两个主要条件：i)组装条件(离子强度、pH和浓度)，用以实现具有各种尺寸的纳米件；以及ii)纳米管/纳米棒与输送舱之间的比，用以实现将舱输送至不同组织内的不同表面电荷。例如，离子强度的增加可用于组装溶液中，以生成比使用标准条件时更长且更宽的纳米件(图4和图7)。RNT与siRNA之比的增加导致纳米件表面正电荷的增加(图11)。图8显示，如前文揭示的将RNT和siRNA溶解于生理盐水中以形成纳米件。将纳米件在透射电子显微镜下成像，并使用Image J软件分析其长度和宽度。图11显示用以形成纳米件的RNT与siRNA的不同比值。经纳米粒度仪测定纳米件的表面电荷(如按照电动电势测量者；mV)。
实施例3.5
组装后的加工包括物理方法，如使用不同功率的超声波处理、加热、掺混及/或微波处理；或化学方法，如改变pH及加入芳香族化学品。例如，使用低、中及高功率的超声波处理导致具有不同尺寸(长度)和形貌(纵横比，其等同于长度/宽度)的纳米件(图4、图56和图57)。图56至图57显示，在标准条件下形成的纳米件和使用不同功率(700W超声波处理器，低功率为最大功率的10％，中功率为最大功率的50％，高功率为最大功率的100％)超声波处理的纳米件。纳米件在透射电子显微镜下成像，并使用Image J软件分析其长度和宽度。
实施例3.6
视需要包覆纳米件。使用PEG包覆纳米件促进了纳米件至组织基质内的输送，尤其是在富含蛋白质的环境如血清的存在下(图20)。尽管纳米件将输送舱(如分子信标，MB)的半衰期翻倍，经共价链接的PEG涂层具有比仅使用MB者长6倍的半衰期(图58)。此外，以在血清中的稳定性方面来看，非共价链接的PEG仅在纳米件上具有边缘差异(图59)。图58至59显示，使用/不使用纳米件输送的分子信标均浸没于血清中。对于PEG涂层，将PEG(MW 400)共价链接至纳米件或非共价包覆于纳米件上。荧光板读数测定MB的半衰期。
实施例3.6
使用下述过程制备具有不同尺寸和长度的纳米件：
步骤A：组装之前淬火：将5μg RNT于水中于50至99℃加热10s至10min，随后立即置于冰上，并与50pmol siRNA混合，随后超声波处理30s至2min以生产纳米件。
步骤B：组装之前超声波处理：将5μg RNT于水中于50至99℃加热10s至10min，与50pmol siRNA混合，随后超声波处理30s至2min以生产纳米件。
步骤C：增加离子强度：将5μg RNT与50pmol siRNA于生理盐水中混合，随后超声波处理30s至2min以生产纳米件。
步骤D：增加组装后的超声波处理时间：将5μg RNT与50pmol siRNA混合，随后超声波处理2min至10min以生产纳米件。
参数的修饰：
Figure GDA0001238979400001561
Figure GDA0001238979400001571
Figure GDA0001238979400001572
Figure GDA0001238979400001581
Figure GDA0001238979400001582
实施例4：
表面电荷及基质/组织结合
经由控制RNT/输送舱的比值调整或定制纳米件的表面电荷(如，RNT/siRNA作为实例，图11)。调节为4.4μg至30μg RNT每0.1nmol RNA获得荷正电的纳米件。这些纳米件展现了与荷负电的组织及/或基质的优异结合性，如图12所示；亮灰色区域和点是来自单独的siRNA或siRNA的荧光。具有大于30μg RNT每0.1nmol RNA的纳米件也荷正电。通常，该比值将不超过30μg每0.1nmol RNA。
实施例4.1
将具有和不具有纳米件的荧光标记的RNA加至猪关节软骨上并停留1h。随后，将该软骨浸没于37℃的HBSS缓冲液中。使用荧光显微镜分析剩余的RNA。
实施例5：
跨基质/组织输送
结果显示，经加工的荧光标记的siRNA/RNT纳米件成功渗入软骨中(图13)。此外，进一步表明，GAPDH分子信标/RNT纳米件不仅渗入组织内还渗入细胞内部(图14至16)。使用多个物种表明有效的跨基质及/或组织输送。图14至16中围绕细胞核的亮灰色区域是来自分子信标的荧光信号。
实施例5.1
使用和不使用纳米件输送荧光标记的RNA，且使用猪软骨浸没该荧光标记的RNA。24小时之后，将该软骨切片，且在荧光显微镜下观察每一切片(图13)。
实施例5.2
使用和不使用纳米件输送荧光GAPDH分子信标，且使用鼠软骨浸没该荧光GAPDH分子信标。24小时之后，将该软骨切片，且在荧光显微镜下观察每一切片(图14)。
实施例5.3
使用和不使用纳米件输送荧光GAPDH分子信标，且使用人软骨浸没该荧光GAPDH分子信标。24小时之后，将该软骨切片，且在荧光显微镜下观察每一切片(图15)。
实施例5.4
使用和不使用纳米件输送荧光GAPDH分子信标，且使用鸡软骨浸没该荧光GAPDH分子信标。24小时之后，将该软骨切片，且在荧光显微镜下观察每一切片(图16)。
实施例5.5
各种类型的纳米件的应用：如需要，可将各种类型的纳米件用于输送至不同的组织或器官中。例如，将用以输送具有荧光的GAPDH MB的小纳米件(平均长度约110nm，平均宽度约20nm)(“小”意指平均长度10nm至149nm；平均宽度直径10至29nm)和用以输送也具有荧光的GAPDH MB的非常大纳米件(平均长度约250nm，平均宽度约33nm)(“大”意指平均长度150nm至999微米；平均宽度直径30至100nm)同时注射入鼠膝关节内。小纳米件可被输送至软骨和滑膜两者内，而大纳米件仅可被输送至滑膜内(图60至61)。(图60至61中环绕细胞核的明亮区域/点是来自经不同尺寸纳米件输送的分子信标的荧光信号)。因此，将经加工的大纳米件选择性输送至滑膜内得以实现。
另一实施例为小纳米件的使用。进行小纳米件进入鼠体内的全身性注射。与传统的脂质输送载具相比，发现小纳米件能增加对具有致密基质的组织和器官的渗入，而该组合和器官难以浸润(如脑、肋骨、脊柱和四肢)，且小纳米件异能降低肝脏捕获(图62至63)。图60至61显示，使用小纳米件输送的荧光标记的GAPDH分子信标和使用大纳米件输送的荧光标记的GAPDH分子信标被共同注射入鼠膝关节内，并于荧光显微镜下观察荧光信号。图62至64显示，经由球后静脉注射将使用纳米件或脂质颗粒输送的远荧光标记的GAPDH分子信标注射入鼠体内。24小时之后，牺牲并解剖该鼠。经由荧光分子断层成像术记录每一器官或组织的荧光信号。
实施例6：
功能
结果显示将Matrilin-3(MATN3)siRNA/RNT纳米件输送至鼠软骨组织基质和细胞内具有优异的生物学功能(图17和图18)。此外，当输送入人软骨组织基质和细胞中时，miRNA-365/RNT纳米件是功能性的(图19)。较小的经加工的纳米件导致较高的纳米件输送功效。
实施例6.1
使用和不使用纳米件或Lipofectamine 2000输送MATN-3 siRNA，并将MATN-3siRNA浸没于鼠软骨中。经由实时RT-PCR测定MATN-3基因表达(图17)。
实施例6.2
使用未经加工的或经加工的纳米件输送MATN-3 siRNA，并将MATN-3 siRNA浸没于鼠软骨中。经由实时RT-PCR测定MATN-3基因表达(图18)。
实施例6.3
使用纳米件输送各种剂量的miR-365(0.1、0.5及.0nmol)，并将miR-365浸没于人软骨中。经由实时RT-PCR测定miR-365表达(图19)。
实施例7：
组合物s
图20显示，PEG的复合物增加了纳米件在富含蛋白的环境(如血清)中的输送效率。
实施例8：
体内输送
图21和图27显示，将纳米件注射入接合关节内。与仅使用信标者(不存在RNT纳米件)相比，将GAPDH分子信标/RNT纳米件注射入鼠膝关节内(图21)导致显着的荧光信号。膝盖中的该信号持续了超过2周(图22至24)。在大鼠中，也通过将GAPDH分子信标/RNT纳米件注射入膝关节内而获得显着的荧光信号。该荧光信号在洗脱之后仍强劲，且荧光分子粘附于关节表面(图25至26)。将Matrilin-3 siRNA纳米件注射入一周龄幼鼠的膝内，发现该纳米件具有功能性。软骨切片的组织学滑片证实了该纳米件的成功输送(图28；环绕细胞核的亮灰色区域例示性说明来自分子信标的荧光信号)。在这些实验中表明了经加工纳米件的有效的体内跨基质/组织输送。
实施例8.1
使用和不使用纳米件输送荧光标记的GAPDH分子信标，并将后者注射入鼠膝关节内。经由荧光分子断层成像术记录荧光信号(图22至24)。
实施例8.2
使用和不使用纳米件输送荧光标记的GAPDH分子信标，并将后者注射入大鼠膝关节。经由荧光分子断层成像术记录荧光信号(图25至26)。
实施例8.3
使用和不使用纳米件输送荧光标记的GAPDH分子信标，并将后者注射入幼鼠膝关节。牺牲该鼠，将膝关节切片，并在荧光显微镜下观察(图27至28；图28中环绕细胞核的亮灰色区域例示性说明来自分子信标的荧光信号)。
实施例9：
诊断
为了检测OA进展，选择MMP-13作为靶标基因。设计MMP-13分子信标并验证其体内功能。如图29所示，通过本文中揭示的方法输送MMP-13分子信标，发现该分子信标在受到刺激后于软骨细胞中发射荧光。图29中的明亮区域例示性说明来自分子信标的荧光信号。根据下述步骤制备该MMP-13分子信标：
步骤一：预热RNT纳米管溶液，随后通过将管置于冰上而淬火。
步骤二：超声波处理RNT纳米管溶液。
步骤三：将MMP-13分子信标或IL-1β受体siRNA稀释于水中，随后与RNT纳米管以一定比例(相对于5μg RNT，50pmol siRNA或100pmol分子信标)混合，随后混合均匀。
步骤四：超声波处理步骤三中揭示的混合物，随后旋转去除全部液体。
在步骤四之后，MMP-13分子信标或IL-1β受体纳米件自组装。
*标准制备仅包括步骤三和步骤四。联合制备包括全部步骤。
对于体内诊断，将内侧半月板去稳定(DMM)以诱发该鼠一个膝盖的OA，而在另一膝盖实施虚假手术(sham)。手术之后，立刻一起输送用于靶标基因检测的MMP-13分子信标和作为阴性对照的非特异性信号的非靶向杂乱分子信标。此外，也给药用于内部看家基因对照的GAPDH分子信标。4天后，诱发OA的膝盖显示显着强于sham膝盖的信号(图30)。此外，使用此实时、原位、非侵入性诊断途径，于时间依赖曲线中定量比较DMM与sham之间的信号(图31)。提供方法以连续监控活体动物OA进展过程中的具体的基因表达。此外，在第4天和第11天牺牲动物，经由实时RT-PCR测定其MMP-13表达水平。结果显示，与PCR相比，本文中揭示的非侵入性诊断技术精确地检测了基因表达水平(图32)。
荧光和组织学分析显示，受损的关节软骨表面为发射来自MMP-13分子信标的荧光信号的区域(图37至38)。图37中，箭头指示作为来自MMP-13分子信标的结果的荧光信号。图38中，关节软骨中的暗灰色区域为聚集蛋白聚糖染色。DMM手术造成聚集蛋白聚糖染色的流失并损害关节软骨。
除了MMP-13之外，也显示了用于OA诊断的ADAMTS-5分子信标。再一次，这一分子信标检测体外ADAMTS-5基因表达的能力得以证实(图39至41)；图39至41中环绕细胞核的亮灰色区域系来自分子信标的荧光信号。红色通道显示来自GAPDH信标的信号；而绿色通道显示来自ADAMTS-5或杂乱信标的信号。还显示了OA发展过程中ADAMTS-5的上调情况(图42至43)。
这些资料表明，该方法可用于精确和具体的基因表达检测，从而准许以实时、原位及非侵入性方式进行活体动物的可靠诊断。
实施例9.1
将使用纳米件输送的荧光标记的GAPDH分子信标和荧光标记的MMP-13分子信标或荧光标记的杂乱分子信标在标准细胞培养条件下或使用10ng/mL IL-1β刺激下加入软骨细胞中(图29)。
使用所构建的方法(Tyagi et al Nat.Biotech,1998,16:49-53)，MB被设计为以鼠MMP-13或具有荧光团/淬火对的GAPDH mRNA为靶标。查实，杂乱序列MB(Scramble)并未经由BLAST与任何鼠mRNA结合。体外输送和确认：通过纳米件将MB输送入软骨细胞内。具体而言，使用IL-1β刺激24小时，经由纳米件共转染软骨细胞GAPDH和杂乱MB或GAPDH和MMP-13MB。使用实时RT-PCR及荧光显微镜来查证对MMP-13表达的刺激以及从MMP-13 MB获得的成功荧光信号。
为了测试通过纳米件输送的MB检测软骨细胞中mRNA的效能，在使用或不使用IL-1β处置下以MB转染初代鼠软骨细胞。在IL-1β处置之前，检测看家GAPDH MB基因而不检测MMP-13 MB(图29，左图)。反正，在IL-1β处置之后，检测GAPDH MB和MMP-13 MB两者，表明通过IL-1β诱发的MMP-13水平(图29，右图)。实时rtPCR显示，MMP-13mRNA水平比IL-1β刺激上调约10倍。相反，杂乱MB转染并未显示任何荧光，表明MMP-13 MB的荧光并非因为非特异性退化。
实施例9.2
在内侧半月板去稳定(DMM)手术和Sham手术后，将使用纳米件输送的荧光标记的GAPDH、MMP-13和杂乱分子信标注射入鼠膝关节内，随后经由荧光分子断层成像术记录并分析荧光信号(图30至31)。对10周龄的129SVE雄性鼠实施DMM手术或虚假手术以诱发骨关节炎。手术一周后，将通过纳米件输送的具有不同荧光团的MMP-13和杂乱MB注射入鼠膝关节内。3周时间内，使用小动物荧光分子断层成像术(FMT)持续测定来自活体动物体内MMP-13表达的荧光信号。该杂乱MB在DMM手术和虚假手术膝盖关节内均显示低荧光。减去杂乱MB基础水平信号后，DMM腿中的MMP-13 MB实时信号比sham腿强约40倍(图50和图54至55)。在注射MB后，此MMP-13 MB信号甚至持续3周。
实施例9.3
在DMM或Sham术后第4天或第10天，分离鼠膝关节软骨，并经由实时RT-PCR测定MMP-13表达(图32)。
实施例9.4
将使用纳米件输送的荧光标记的MMP-13分子信标和杂乱分子信标输送至DMM或Sham术后的鼠膝关节内。30天后，牺牲动物，将其膝关节切片进行组织学和荧光扫描(图37至38)。
实施例9.5
在标准细胞培养条件下或使用10ng/mL IL-1α及10μM视黄酸刺激下，将使用纳米件输送的荧光标记的GAPDH分子信标、荧光标记的ADAMTS-5分子信标或荧光标记的杂乱分子信标加入软骨细胞内(图39至41)。
实施例9.6
将使用纳米件输送的荧光标记的GAPDH、ADAMTS-5和杂乱分子信标注射入DMM或Sham术后的鼠膝关节内，随后经由荧光分子断层成像术记录并分析荧光信号(图42至43)。图42显示，来自行DMM手术腿的ADAMTS-5分子信标的荧光信号比来自行Sham手术腿的强。图43显示术后的ADAMTS-5表达情况。
实施例10:
治疗学
将IL-1受体(IL-1R)siRNA/纳米件注射入鼠的一个膝盖内，并将非靶向杂乱siRNA/纳米件注射入另一膝盖内。以分解代谢细胞因子(如IL-1β)刺激两个膝盖内的软骨退化，模拟关节炎过程中的炎症环境。在使用纳米件输送IL-1R siRNA的活体内，观察到鼠软骨的软骨细胞中IL-1R的消除(图33)。此外，软骨退化基因(如MMP-13和MMP-9，图33)被下调，而软骨合成代谢基因(如Col II，图33)被上调。
使用纳米件将ADAMTS-5 siRNA输送至已经使用细胞因子(IL-1α和视黄酸)处理的鼠膝关节内。结果显示，使用ADAMTS-5 siRNA处置之后，软骨退化和聚集蛋白聚糖裂解得以限制抑制(图34)。在上方两图中，关节软骨中的暗灰色为聚集蛋白聚糖染色。未进行ADAMTS-5 siRNA处置时，聚集蛋白聚糖染色比处置组弱，表明聚集蛋白聚糖的流失。下方两图中，环绕细胞核的暗染色为来自聚集蛋白聚糖裂解的表位染色。未进行ADAMTS-5 siRNA处置时，该染色强于处置组，表明聚集蛋白聚糖的裂解。
为了模拟骨关节炎进展，对鼠膝关节行DMM手术。使用纳米件输送ADAMTS-5 siRNA进行处置后，显示骨关节炎的进展被防止或减缓(图35和图36)。图35中，关节软骨中的暗灰色是聚集蛋白聚糖染色。箭头指出不进行ADAMTS-5 siRNA处置组的聚集蛋白聚糖染色的流失或对关节软骨的损害；而进行处置时，聚集蛋白聚糖的流失或对关节软骨的损害非常小。又，免疫组织学结果显示，输送ADAMTS-5 siRNA组的聚集蛋白聚糖裂解被抑制(图46)。图46中，环绕细胞核的暗染色为来自聚集蛋白聚糖裂解的表位染色。未进行ADAMTS-5 siRNA处置时，该染色强于处置组，表明聚集蛋白聚糖的裂解。
此外，以间接体外方式经由纳米件将ADAMTS-5 siRNA输送至人软骨。保护人软骨不发生细胞因子诱发的软骨退化得以证实(图44至45)。图44中，环绕细胞核的暗染色为来自聚集蛋白聚糖裂解的表位染色。未进行ADAMTS-4或5 siRNA处置时，该染色强于处置组，表明聚集蛋白聚糖的裂解。图45中，关节软骨内的暗色为聚集蛋白聚糖染色。未进行ADAMTS-4或5 siRNA处置时，聚集蛋白聚糖染色弱于处置组，表明聚集蛋白聚糖的流失。
这些数据表明，该方法可用于防止及/或抑制软骨退化和关节炎进展。
实施例11：
合成
实施例11.1
通过首先合成模块(如分别为式I化合物或式II化合物)而作成用以形成纳米件的RNT和TBL。随后加工(制程-1、制程-2)纳米管(RNT或TBL)以分别作成纳米棒和纳米件(见，如图53)。根据US 6,696,565中揭示的方法合成用于作成纳米件的模块，并在将该模块用于制备功能性纳米件之前纯化该模块。使用液相色谱纯化方法来纯化源自式I及/或式II化合物的合成产物，以确保成功形成功能性和低毒性的纳米件。在液相色谱中，一般使用三氟乙酸(TFA)来保持酸性洗脱剂环境。由于残留TFA或氟化物的已知毒性，使得所分离的材料不适用于临床前和临床研究，因此发展包括盐酸(HCl)或磷酸以替代TFA的经修饰的纯化制程。
使用安捷伦1260Infinity Quaternary HPLC系统在C18反相柱上实施液相色谱。在分离中使用的梯度的实施例显示如下：
时间 0min 10min 15min
溶剂A的百分比 90 65 0
溶剂B的百分比 0 25 90
溶剂C的百分比 10 10 10
*溶剂A为H2O，溶剂B为100％乙腈，而溶剂C为0.05N盐酸。
使用标准细胞活力测试来评估细胞毒性。以RNT处理ATDC5细胞，48小时后，将细胞活力归一化至阴性对照(作为100)。结果显示于图47中。这些结果证明，使用经修饰的HPLC纯化方法成功进行了模块的分离以获得RNT。在此纯化制程中使用HCl代替TFA，避免了模块中含氟污染物的存在，而该含氟污染物造成了所得纳米管的毒性。因此，HPLC的使用降低了RNT的毒性，而使用HCl替代TFA进一步降低了细胞毒性。因此，通过在液相色谱纯化中应用HCl分析分子模块如TBL。这一纯化方案可应用于模块I化合物(用于RNT组装物)以及模块II化合物(用于TBL组装物)以获得具有低毒性的功能性纳米件。
实施例11.2
根据称之为“制程-1”的制程实施纳米管(如RNT及TBL)至纳米棒的转化(图53)。在制程-1中，将纳米管转化为短且均质的纳米棒。这对于制造小至足以渗透一些类型的组织基质而将治疗剂引入该组织的纳米件来说非常重要。纳米管至纳米件的转化可通过改变pH、温度、及/或使用物理方法(如超声波处理、加热及掺混(如高速搅拌机))、及/或加入芳香族化学品而实施。可生产不同尺寸的纳米件(图5、6及48)。基于纳米件组装机制，加工途径可包括下述至少一种：1)组装之前，经由改变物理及/或化学条件如温度、分子移动及/或振动(如超声波处理)及pH而控制RNT的长度和捆束；2)组装过程中，经由改变物理及/或化学条件包括浓度、pH及离子强度而调节组装条件，从而增强及/或减少纳米件的形成和堆栈；3)组装之后，经由改变物理及/或化学条件包括提升分子移动/振动(如超声波处理)而打断长的或堆栈的纳米件。
实施例11.3
通过称之为“制程-2”的制程实施纳米件的制备(图55)。制程-2出现于纳米管或纳米棒与舱合并且形成捆束、带状或其它聚集体之后。这些聚集体可随后被变形为纳米件(图49)。可通过改变pH、离子强度、温度和浓度来改变纳米件的尺寸(图4、7至9)。
图15至23和图26至32表明，将实施例11.1至11.3中的上述方法合用之后，成功进行了组织输送。
实施例11.4
使用下述过程进行小脂质纳米颗粒和大脂质纳米颗粒的制备。
使用IL-1R siRNA制备大脂质纳米颗粒(球形，直径为110nm至180nm)：
1)将siRNA溶解于20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0，不含核酸酶)以实现50μM的浓度。
2)将DSPC、胆固醇、DODMA、及DSG-PEG(20:48:2:30摩尔比)溶解于绝对无水乙醇中，随后加入不含核酸酶的水以实现90％乙醇浓度。
3)随后将脂质于溶液中的总浓度调节为20mM。
4)将1μL的siRNA和1μL的脂质溶液加热至37℃，随后在相同温度混合，并以8uL不含核酸酶的水稀释。使用前静置至少30分钟。
使用IL-1R siRNA制备小脂质纳米颗粒(球形，直径70nm至120nm)：
1)将siRNA溶解于10mM柠檬酸盐、30mM NaCl(pH 6.0，不含核酸酶)中以实现50μM的浓度。
2)将DSPC、DSG-PEG、胆固醇、SPDiOC18、及DOTMA(10:10:39.8:0.2:40摩尔比)溶解于绝对无水乙醇中，随后加入水性缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4.0，不含核酸酶)以实现40％乙醇最终浓度。
3)随后将脂质于溶液中的总浓度调节为20mM。
4)通过两个核微孔过滤器(100nm，10通路)挤出该脂质溶液。
5)将1μL的挤出脂质溶液与1μL的siRNA在恒速涡流下混合，随后在PBS中透析过夜以增加pH至约7.4。
图67显示，使用载有核酸的纳米颗粒成功将舱锁定于/输送至软骨组织。该小siRNA脂质纳米颗粒被锁定于、渗入软骨组织，并抑制靶标基因的表达。
实施例11.5
使用下述过程进行小聚合物纳米颗粒和大聚合物纳米颗粒的制备。
使用IL-1R siRNA制备大聚合物纳米颗粒和小聚合物纳米颗粒：
1)将聚赖氨酸(PLL)(分子量15kDa至30kDa)溶解于不含核酸酶的水中，浓度为0.2mg/mL。
2)透析以移除盐(HBr)。
3)冻干。
为了制备大PLL/siRNA纳米颗粒(直径100至250nm)：
1)将siRNA和PLL溶解于0.15M NaCl溶液中，浓度分别为10μM和25μM。
2)将1μL 50μM siRNA溶液快速加入15μL 100μg/mL PLL中，并于室温混匀。
3)移液，在使用前静置至少30分钟。
为了制备小PLL/siRNA纳米颗粒(直径50至75nm)：
1)将siRNA和PLL溶解于不含核酸酶的水中，浓度分别为50μM和100μg/mL。
2)将1μL 50μM siRNA溶液快速加入15μL 100μg/mL PLL中，并于室温混匀。
3)反应30分钟内使用。
图68显示，使用载有核酸的聚合物纳米颗粒冲个将舱锁定于/输送至软骨组织。该小siRNA聚合物纳米颗粒锁定于、渗入软骨组织，并抑制靶标基因的表达。
图67和图68表明，使用上述制备的脂质或聚合物纳米颗粒成功进行了组织输送。对动物注射所制备的大/小脂质或聚合物纳米颗粒，将IL-1R siRNA输送至鼠右膝(动物左膝用作阴性对照)。24小时之后，对动物实施安乐死，收集其膝软骨进行实时RT-PCR。这些数据表明，载有舱的纳米结构如包含式I化合物的RNT、包含式II化合物的TBL、以及脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒成功地将舱输送至靶标组织。
实施例12
通过分子信标(MB)和纳米件输送技术对MMP-13 mRNA水平进行体内成像的非侵入性、早期、敏感的骨关节炎检测
使用模型将MB设计为以MMP-13或具有荧光团/淬火对的GAPDH mRNA为靶标。查实杂乱序列MB(Scramble)并未经由BLAST与任何鼠mRNA结合。通过纳米件将MB输送至软骨细胞以证明体外输送和生效。使用IL-1β刺激24小时后，经由纳米件以GAPDH(红色)和杂乱(绿色)MB或以GAPDH(红色)和MMP-13(绿色)MB共同转染软骨细胞。使用实时RT-PCR和荧光显微镜来证实对MMP-13表达的刺激以及从使用MMP-13 MB获得的成功荧光信号。
内侧半月板去稳定(DMM)手术和体内输送：对10周龄129SVE雄性鼠实施DMM手术或虚假手术以诱发骨关节炎。手术一周后，将通过纳米件输送的具有不同荧光团的MMP-13和杂乱MB注射入鼠膝关节。3周时间内，使用小动物荧光分子断层成像术(FMT)持续测定来自活体动物体内MMP-13表达的荧光信号。
为了测试使用通过纳米件输送的MB检测软骨细胞中mRNA的体外效能，以经或未经IL-1β处理的MB转染初代鼠软骨细胞。在IL-1β处置之前，检测看家GAPDH MB(红色)而不检测MMP-13 MB(绿色)。反之，在IL-1β处置之后，检测GAPDH MB(红色)和MMP-13 MB(绿色)，表明通过IL-1β诱发的MMP-13 mRNA水平。实时rtPCR显示，IL-1β刺激下的MMP-13 mRNA水平上调约10倍。与之相反，杂乱MB转染并未显示绿色荧光，暗示MMP-13 MB的荧光并非缘于非特异性退化。
进行下述研究以评估体内效能。行DMM手术后，以关节内输送方式将MMP-13 MB和杂乱MB输送至成年鼠的膝关节内，该杂乱MB与MMP-13 MB发射荧光的波长不同。手术后仅一周，DMM手术腿显示比对侧Sham手术腿强的MMP-13信号(图2，左图)。与之相反，杂乱MB在行DMM和Sham两种手术的膝关节中均显示非常低的荧光。减去杂乱MB的基础水平信号后，DMM腿的MMP-13 MB真实信号比Sham腿强约40倍。此MMP-13 MB信号在注射MB三周后甚至仍然持续存在。
通过纳米件技术输送的MMP-13 MB表示用以检测促炎性退化条件的敏感工具，如使用体外软骨细胞和体内OA动物模型所证实的。这一技术检测轻微OA模型(DMM)中早期(一周内)OA的发病机制。由于在mRNA水平上的检测和通过纳米件进行MB细胞内输送的高效率，实现了高敏感度。分子信标与纳米件技术的合并提供了以特异性且敏感性方式进行体内OA早期检测且不损害任何关节组织的强有力工具。
基质金属蛋白酶(MMP)是在关节炎进展过程中降解细胞外间质组分的主要的酶。MMP-13，通常由软骨和骨骼制造，在OA和RA两者中降解间隙胶原(I型、II型和III型)。MMP-13的表达在正常细胞中低，而在病理情况下MMP-13的过度生产与炎症有关。因此，MMP-13的mRNA水平可作为诊断和预防工具用于关节炎发展的评定。因此，MMP-13被认为是关节炎早期诊断中的可靠靶标。这些数据表明，纳米件+负载的关节内注射成功将其引入关节组织，且负载在输送后是功能上活性的。
本文揭示的系统和组合物克服了将分子信标信号精确转译为MMP-13 mRNA表达水平的困难。在OA进展过程中使用经纳米件输送的信标演示MMP-13上调情况。与早期和最新研究和临床方法相比，纳米件-分子信标技术实现了更早且更敏感的检测。
虑及上述公开和例示性具体实施例的说明书的权益，该领域技术人员应明晰，大量供选择的不同的具体实施例可能符合本文中揭露的本发明的一般原则。该领域技术人员将认识到，此类各种修饰和供选择的具体实施例处于本发明的真实范畴和精神范围内。尽管已经在图式和前述说明书中例示性说明并详细揭示本发明，应认为这些例示性说明和说明书是作为示例而非限制特征，应理解为，仅已经显示并揭示优选的具体实施例，而处于本发明精神范围内的全部改变和修饰应认为是被保护的。所附权利要求书倾向于覆盖全部此类修饰和供选择的具体实施例。应理解，除非在该术语刻意强调意指具体一个且仅一个的特定例子的语境中，本公开及权利要求书中使用的单数不定冠词和定冠词(如，“一”、“该”等)遵循专利的传统，其意为“至少一个”。同样，术语“包含”是开放性的，并不排除额外的项目、特征、组分等。除非特别排除的，本文中指出的参考文献明确通过引用而以其整体并入本文。
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Claims (16)

1.一种将药物选择性输送到身体组织的纳米件，该纳米件包含：式I或式II的化合物或其组合，以及核酸，
Figure FDF0000011025550000011
式中，
X是CH或N；
R2是氢或连接基；
当R2是氢时，Y不存在；或Y是氨基酸或多肽；以及
R1是氢或脂肪族基，其中该纳米件具有至少一个维度为0.1nm与150nm之间的尺寸，
其中该化合物与该核酸的比为4.4至30μg的该化合物对每0.1nmol的该核酸；
其中该纳米件在pH 7至7.5带正电荷；以及
R2包含氨基酸侧链或选自：
Figure FDF0000011025550000021
2.如权利要求1所述的纳米件，其特征在于，该核酸是诊断剂或治疗剂。
3.如权利要求1所述的纳米件，其特征在于，该纳米件具有>+8mV的电动电势的净正电荷。
4.如权利要求1所述的纳米件，其特征在于，该化合物选自下列的化合物：
Figure FDF0000011025550000031
5.如权利要求1所述的纳米件，其特征在于，该化合物选自下列的化合物：
Figure FDF0000011025550000032
6.如权利要求1所述的纳米件，其特征在于，R1是C1至C10的烷基。
7.如权利要求2所述的纳米件，其特征在于，该治疗剂包含核酸、肽或小分子。
8.如权利要求2所述的纳米件，其特征在于，该诊断剂包含分子探针或分子信标。
9.如权利要求2所述的纳米件，其特征在于，该治疗剂包含IL-1受体拮抗剂。
10.如权利要求8所述的纳米件，其特征在于，该分子信标包含MMP-13或ADAMTS-5。
11.如权利要求2所述的纳米件，其特征在于，该治疗剂包含一种或多种止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗真菌剂、抗生素、润滑剂、抗癌剂、NMDA受体拮抗剂、或抗病毒剂。
12.一种将如权利要求1所述的纳米件用于制造处置关节疾病的药剂的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，该关节疾病包含自体免疫性关节病、退化性关节病、炎性关节病、感染性关节病、癌性关节病、病毒性关节病、真菌性关节病、损伤性关节病、创伤性关节病、基因性关节病、外伤性关节病、机械性关节病、营养性关节病、或源自排列不整的关节病。
14.如权利要求12所述的用途，其特征在于，该关节疾病包含类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎的青少年发病(JRA)、反应性关节炎(RA)、化脓性关节炎、肌腱炎、或疝形成。
15.一种制作如权利要求1所述的纳米件的方法，包含：
将该式I或式II的化合物与该核酸合并，其中该化合物形成纳米管，而且该纳米管和该核酸形成络合物；及
处理包含该纳米管和该核酸的该络合物以产生带正电荷的纳米件，该纳米件包括至少一个维度为0.1nm和150nm之间的尺寸，
其中该化合物与该核酸的比为4.4至30μg的该化合物对每0.1nmol的该核酸。
16.一种包含如权利要求1所述的纳米件的组合物，该组合物用于选择性输送治疗药物或诊断剂至靶标身体组织。
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