CN106754817A - 一种重组自分泌运动因子的表达方法 - Google Patents

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Abstract

一种重组自分泌运动因子的表达方法，目的是保持较高活性，高水平表达均一性糖基化修饰；本发明通过构建pInsulator4x‑ATX β‑8His‑DHFR重组表达载体，利用CAG启动子和双顺反子IRES共表达ATX和DHFR基因，引入绝缘子insulator（4X）避免了基因之间的相互影响，通过MTX阶梯式梯度加压筛选大大增加了ATX在HEK293宿主细胞中的重组表达水平；通过控制重组细胞株的接种量、补料方式、培养温度和转速、谷氨酰胺和葡萄糖含量监测及pH值控制，使重组蛋白获得了较为均一性的糖基化修饰，最终ATX蛋白获得12 mg/L的高收率，且保持较高的lysoPLD和PDE活性。

Description

一种重组自分泌运动因子的表达方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高活性自分泌运动因子(autotaxin,ATX)的高水平表达方法。
背景技术
自分泌运动因子ATX是一种最初自黑素瘤细胞上清液中作为自分泌运动性刺激因子而分离获得的分泌型糖蛋白(Stracke ML, Krutzsch HC, Unsworth EJ, et al.Identification, purification, and partial sequence analysis of autotaxin, anovel motility-stimulating protein. J Biol Chem, 1992, 267(4): 2524-2529)。ATX属于外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员(ectonucleotidepyrophos
-phatases, ENPPs)，因此又称为ENPP2，具有磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)活性，同时又是ENPPs家族中唯一具有溶血磷脂酶D (lysophospholipase D, lysoPLD)活性的成员。ATX独特的lysoPLD活性是其发挥重要生物学功能的基础，它可以将溶血磷脂胆(lysophosphatidyl
-choline, LPC)水解成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)。而LPA作为细胞内外信号转导最重要的核心脂质信号分子，通过结合特异性G蛋白偶联受体影响细胞增殖、分化、迁移和凋亡，参与多种生理和病理过程，特别是与肿瘤的生存、转移和侵入关系密切。因此ATX作为LPA生成最主要的磷脂酶，成为介导靶向抑制LPA生物合成从而防治肿瘤疾病的重要靶点。
ATX基因位于人类8号染色体长臂，包含27个外显子，经选择性剪切产生α (915aa)、β (863 aa)、γ (888 aa)、δ (859 aa)、ε (911 aa)五种不同蛋白亚型(Giganti A,Rodriguez M, Fould B, et al. Murine and human autotaxin alpha, beta, andgamma isoforms: gene organization, tissue distribution, and biochemicalcharacterization. J Biol Chem, 2008, 283(12): 7776-7789；Hashimoto T, OkudairaS, Igarashi K, et al. Identification and biochemical characterization of anovel autotaxin isoform, ATXδ, with a four-amino acid deletion. J Biochem,2012, 151(1): 89-97；Tokuhara Y, Kurano M, Shimamoto S, et al. A New EnzymeImmunoassay for the Quantitative Determination of Classical Autotaxins (ATXα, ATX β, and ATX γ) and Novel Autotaxins (ATX δ and ATX ε), PLoS One，2015,10(6): e0130074)。其中ATX β最初是从畸形癌细胞系克隆获得，含有863个氨基酸，是最短也是最主要的ATX亚型。ATX分子量约为125 kDa，具有一个N-端疏水结构域、两个类生长素B结构域、一个催化结构区域和一个核酸酶样结构域。在翻译过程中，ATX首先以蛋白酶原前体形式合成，随后经N端信号肽切除以及弗林蛋白酶(furin)加工，最后通过经典的内质网-高尔基体途径完成糖基化修饰后，以活化糖蛋白形式分泌至细胞外间隙中。ATX在N53、N410、N524三个位点发生的N-糖基化修饰、特别是N524位点的糖基化是ATX活性所必须(Jansen S, Callewaert N, Dewerte I, et al. An essential oligomannosidicglycan chain in the catalytic domain of autotaxin, a secretedlysophospholipase-D. J Biol Chem, 2007, 282(15): 11084-11091)。
LPA受体繁多，信号途径复杂，通过抑制ATX酶活性达到抑制ATX-LPA功能轴信号通路是肿瘤等相关疾病治疗的有效策略。其中基于ATX空间结构解析是其抑制剂筛选最为直接的手段之一。大量制备具有天然蛋白活性和构象的重组ATX蛋白，是其晶体形成和解析的前提。目前大鼠的ATX蛋白晶体结构已于2011年被日本和荷兰、美国科学家所解析(Hausmann J, Kamtekar S, Christodoulou E, et al. Structural basis ofsubstrate discrimination and integrin binding by autotaxin. Nat Struct MolBiol, 2011, 18(2): 198-204; Day JE, Hall T, Pegg LE, et al. Crystallizationand preliminary X-ray diffraction analysis of rat autotaxin. Acta CrystallogrSect F Struct Biol Cryst Commun. 2010, 66(Pt 9): 1127-1129)。然而人ATX蛋白晶体解析工作因无法获得大量近似于天然状态的重组蛋白而至今无法完成。关于人ATX蛋白的重组表达研究工作已多有报道，包括大肠杆菌原核重组表达(Haga A, Hashimoto K,Tanaka N, et al. Scalable purification and characterization of theextracellular domain of human autotaxin from prokaryotic cells. Protein ExprPurif, 2008, 59(1):9-17)，杆状病毒表达(Giganti A1, Rodriguez M, Fould B, et al. Murine and human autotaxin alpha, beta, and gamma isoforms: geneorganization, tissue distribution, and biochemical characterization. J BiolChem, 2008, 283(12): 7776-7789.)以及BSC-1、COS-7、HEK293等哺乳动物表达(KawagoeH, Stracke ML, Nakamura H, et al. Expression and transcriptional regulationof the PD-I alpha/autotaxin gene in neuroblastoma. Cancer Res, 1997, 57(12):2516-21; Giganti A1, Rodriguez M, Fould B, et al. Murine and human autotaxinalpha, beta, and gamma isoforms: gene organization, tissue distribution, andbiochemical characterization. J Biol Chem, 2008, 283(12): 7776-7789; HausmannJ, Christodoulou E, Kasiem M, et al. Mammalian cell expression, purification,crystallization and microcrystal data collection of autotaxin/ENPP2, asecreted mammalian glycoprotein. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol CrystCommun, 2010, 66(Pt 9):1130-1135; Song Y, Dilger E, Bell J, et al. Largescale purification and characterization of recombinant human autotaxin/lysophospholipase D from mammalian cells. BMB Rep, 2010, 43(8): 541-546)。但作为分子量较大的分泌型糖蛋白，ATX蛋白的重组表达依然存在糖基化修饰不完全、不均一，部分氨基酸位点易断裂，表达水平低等问题(Giganti A1, Rodriguez M, Fould B, et al. Murine and human autotaxin alpha, beta, and gamma isoforms: geneorganization, tissue distribution, and biochemical characterization. J BiolChem, 2008, 283(12): 7776-7789)，大大限制了ATX蛋白抑制剂的研发。
发明内容
本发明的目的是克服上述已有技术的不足，提供一种可保持较高活性、高水平表达均一性糖基化修饰重组ATX蛋白的表达方法。
本发明方法包括以下步骤：
1、构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒
构建一种新的哺乳动物表达载体pInsulator4X-IRES-DHFR。该载体以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMV early enhancerichken beta actinpromoter, 由AG promoter 和hCMV-IE ehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN 104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸。绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQ ID NO:1；
2、构建pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR表达载体
从人的畸胎癌细胞中利用Trizol试剂盒提取总RNA，利用逆转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA；以cDNA为模版，特异性引物hATX-For：5’-GTCAGCGGCCGCCACCATGG
CAAGGAGGAGCTC-3’ （含Not I酶切位点）、hATX-Rev：5’-GGCCCAATTGTTAGTGGTG
ATGGTGATGGTGATGATGGGCGCTGCCAATCTCGCTCTCATATGTATG-3’ （含Mun I酶切位点，C端引入8His tag），扩增ATX β基因。PCR扩增产物和pInsulator4X-IRES-DHFR质粒经Not I 和Mun I双酶切，T4 DNA连接酶连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，提取重组质粒pinsulator4X-ATXβ-8His-DHFR，Not I和Mun I双酶切鉴定，DNA测序。ATX β重组核酸序列为SEQ ID NO:2；
3、重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株的构建和筛选
鉴定正确的重组表达质粒pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR经SwaI酶线性化处理后，利用Lippfectin2000TM阳离子转染试剂介导进入HEK293宿主细胞内。转染后无血清不完全DMED培养基更换为含10% 胎牛血清（FBS）DMEM完全培养基，获得重组表达细胞株。按照10%～20%接种量接种培养，分别用10 nM、50 nM、250 nM、500 nM、1000 nM氨甲喋呤(amethopterin, MTX)梯度加压筛选，采用有限稀释法亚克隆获得稳定高表达ATX单克隆细胞株。
4、重组ATX蛋白的表达
经MTX加压筛选获得的重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株，采用分批补料培养方式，利用FreeStyle 293 expression medium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5 L体积转瓶培养；初始培养体积为200 ml，第24 h补料200 ml，第48 h补料300 ml，第60 h补料500 ml，总体积至1.2 L体积；培养条件为转速140～160 rpm，35～37℃，5% CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5 mmol/L和1.2 mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间。
5、重组ATX蛋白纯化及lysoPLD、PDE活性检测
收集细胞培养上清，6800 rpm、4℃离心20 min后经0.22 µM滤膜过滤后经30000 DaMWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、1%Trionton、10 mM咪唑，pH7.8），Ni SepharoseTM excel亲和层析纯化。目的蛋白再经超滤浓缩至储存液（20mM Tris,150mM 氯化钠, 15% 甘油，pH 8.0）后，SDS-PAGE、Western blot鉴定。分别利用溶血磷脂酸胆碱LysoPC和对硝基苯基磷酸钠底物Bis-pNPP对重组人ATX蛋白的lysoPLD、PDE活性进行检测。
所述质粒pInsulator4X-IRES-DHFR是以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMV early enhancerichken beta actin promoter, 由AG promoter和hCMV-IE ehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸。绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQ ID NO:1；
所述pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR表达载体是通过基因工程手段将ATX β重组核酸序列亚克隆到pInsulator4X-IRES-DHFR质粒上。ATX β重组核酸序列为SEQ ID NO:2；
所述重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株是以HEK293哺乳动物细胞作为宿主细胞筛选获得。
所述的重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株是经过10 nM、50nM、250 nM、500 nM、1000 nM氨甲喋呤(amethopterin, MTX)梯度加压筛选获得；
所述的重组ATX蛋白的表达，采用分批补料培养方式，利用FreeStyle 293 expressionmedium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5 L体积转瓶培养；初始培养体积为200 ml，第24 h补料200 ml，第48 h补料300 ml，第60 h补料500 ml，总体积至1.2 L体积；培养条件为转速140～160 rpm，35～37℃，5% CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5 mmol/L和1.2 mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间。
所述的重组ATX蛋白的纯化是经30000 Da MWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20 mMTris、500 mM 氯化钠、1%Trionton、10 mM咪唑，pH 7.8）后上样，所用层析柱为NiSepharoseTM excel亲和层析柱。
与现有技术相比，本发明通过构建pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR重组表达载体，利用CAG启动子和双顺反子IRES共表达ATX和DHFR基因，引入绝缘子insulator（4X）避免了基因之间的相互影响，通过MTX阶梯式梯度加压筛选大大增加了ATX的重组表达水平；通过控制重组细胞株的接种量、补料方式、培养温度和转速、谷氨酰胺和葡萄糖含量监测及pH值控制，使重组蛋白获得了较为均一性的糖基化修饰，最终ATX蛋白获得12 mg/L的高收率，且保持较高的lysoPLD和PDE活性。
附图说明
图1为重组人ATX蛋白的真核表达质粒图谱；
图2为重组人ATX蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图中，M为标准蛋白质分子量，1为重组人ATX蛋白纯化样；
图3为重组人ATX蛋白的Wester Blot分析结果；
图中，M为标准蛋白质分子量，1、2为重组人ATX蛋白纯化样；
图4为重组人ATX蛋白lysoPLD活性分析结果；
图5为重组人ATX蛋白PDE活性分析结果。
具体实施方式
、构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒
pCAGGS-IRES-DHFR-Asc I载体（专利CN 104293737.A已构建）经SalⅠ和Asc I双酶切后，胶回收酶切产物3469 bp；MauB I和Bpi I双酶切pinsulator 4X（东北师范大学郑耀武教授提供），胶回收酶切产物8445 bp。酶切后胶回收上述两目的片段按1：3比例连接反应，构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒，4℃过夜连接，将连接反应液转入感受态DH5a细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，37℃，180 rpm过夜摇菌。收集菌体，提取重组质粒，酶切鉴定。
、构建pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR表达载体
（1）克隆ATX基因
从人的畸胎癌细胞中利用TRIzole试剂盒提取总RNA，1%的琼脂糖凝胶分析RNA的完整性。用逆转录试剂盒以RNA为模板合成cDNA，然后加入hATX-For，hATX-Rev引物，扩增ATXβ基因。PCR反应体系：10 µM引物分别各取1.5 µl，cDNA模板 1 µl，Prime STARMax Premix25 µl，H2O 21 µl，总反应体系为50 µl。PCR反应条件：94℃预变性2 min; 94℃变性30 s,60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延伸10 min；1%琼脂糖电泳胶回收2623bp目的片段。
引物设计：hATX-For：5’-GTCAGCGGCCGCCACCATGGCAAGGAGGAGCTC-3’ （含Not I酶切位点）；
hATX-Rev：5’-GGCCCAATTGTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGATGGGCGCTGCCA
ATCTCGCTCTCATATGTATG-3’ （含Mun I酶切位点，C端引入8His tag）；
PCR扩增产物和pInsulator4X-IRES-DHFR质粒经Not I 和Mun I双酶切，T4 DNA连接酶连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，提取重组质粒pinsulator4X-ATX-8His-DHFR，Not I和Mun I双酶切鉴定，DNA测序。
、重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株的构建和筛选
鉴定正确的重组表达质粒pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR经Swa I酶线性化处理：SwaI 酶切质粒，25℃酶切8 h，然后加入1/10体积的3 M的乙酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃孵育2 h，14000 rpm 低温离心10 min。弃上清，加入70 %乙醇500 µL，14000 rpm 低温离心1 min。重复以上步骤，弃上清，加入10 µL无菌水。
采用Lippfectin2000TM阳离子转染试剂转染HEK293细胞：常规培养HEK293细胞，至对数生长期时，按照2×105/L接种至6孔板，2 ml/L，培养至细胞长成50%～70％单层时弃去培养液，用无血清培养基洗涤细胞2 次，将lipofectin脂质体和pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR质粒按照1：1的比例混合，形成DNA-脂质体复合体，室温静止30 min后均匀滴入细胞孔中，轻柔摇匀细胞板，37℃培养，5～6 h 后换新鲜培养液。24 h后将细胞分至培养皿中，48 h后更换含10% 胎牛血清DMEM完全培养基。
采用MTX梯度加压和有限稀释法筛选高表达稳定细胞株：获得的细胞集落按照15%的接种量接种培养，先用20 nM MTX筛选，7天左右换液，待细胞生长状态好时，再提高MTX浓度进一步筛选。分别经10 nM、50 nM、250 nM、500 nM、1000 nM MTX梯度加压筛选，采用有限稀释法亚克隆获得稳定高表达ATX单克隆细胞株。
、重组ATX蛋白的表达及纯化
经MTX加压筛选获得的重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株，采用分批补料培养方式、利用FreeStyle 293 expression medium培养基扩大培养：按照15%的细胞接种量接种至2.5 L体积转瓶培养；初始培养体积为200 ml，第24 h补料200 ml，第4 8h补料300 ml，第60 h补料500 ml，总培养体积至1.2 L体积；培养条件为转速150 rpm，37℃，5% CO2培养；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5 mmol/L和1.2 mmol/L，pH保持在7.0～7.2之间。
细胞培养上清经6800 rpm，4℃离心20 min后，经0.22 µM滤膜过滤后30000 DaMWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、1%Trionton、10 mM咪唑，pH7.8）后利用Ni SepharoseTM excel亲和层析纯化。首先用平衡缓冲液洗至基线，然后用洗脱缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、50 mM 咪唑，pH 7.8）洗脱杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、250 mM 咪唑，pH 7.8）洗脱目的蛋白峰。
、重组ATX蛋白的鉴定及活性检测
重组ATX蛋白纯化样30000 Da MWCO超滤管超滤浓缩至储存液（20mM Tris, 150mMNaCl, 15% glycerol，pH 7.8），SDS-PAGE、Western blot鉴定。纯化样品经12 % SDS-PAGE电泳分析后，电转仪(Bio-Rad)将蛋白转至PVDF 膜上, 用封闭液(PBST + 5%脱脂奶粉)封闭过夜, PBST 洗膜4次，10 min/次，加入1:500稀释的抗8His tag鼠多抗作为一抗，4 ℃过夜，PBST 洗膜4次后，加入1:5000稀释的AP标记的羊抗鼠 IgG，室温反应2 h，用PBST 洗膜4次后，最后用BCIP/NBT 显色试剂盒避光显色并拍照，结果见图2和图3。
利用bradford法测蛋白浓度（以BSA作为标准蛋白），计算重组ATX蛋白的表达水平和产率，结果如表1。
表1 重组ATX蛋白的表达水平和产率
样品 蛋白含量（mg/ml） 体积（ml） 培养规模（L） 蛋白收率（mg/L）
重组ATX 1.4 10.3 1.2 12.0
利用溶血磷脂酸胆碱LysoPC为底物检测重组人ATX蛋白的lysoPLD活性：以LysoPC（18:1）为底物，利用释放胆碱的量测定ATX酶活性，50 µl的TRIS-HCL(pH8.0)缓冲体系含有150µM的LysoPC（18:1）和不同浓度的ATX蛋白，37℃孵育3 h，分别加入5 mM的OPD、10 µg/ml的HRP和4 U/ml的胆碱氧化酶各25 µl，加入25 µl的2 M的H2SO4至酶标板终止反应，酶标仪测定490 nm的吸光值。结果见图4。
利用化学发光法测定ATX的PDE活性：以对硝基苯基磷酸钠Bis-pNPP为底物，100 µl Tris-HCl缓冲液中加入1mM的Bis-pNPP和不同浓度的ATX，室温反应30 min，酶标仪410nM检测产物的吸光值。结果见图5
通过构建pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR表达载体，通过脂质体转染、MTX加压筛选，最后经亚克隆筛选最终获得一株高表达ATX的宿主细胞。采用重组细胞株的接种量、补料方式、培养温度和转速、谷氨酰胺和葡萄糖含量监测及pH值控制，获得12 mg/L的高产率，且重组ATX具有良好的纯度和活性。

Claims (7)

1.一种重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是：
（1）构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒
构建一种新的哺乳动物表达载体pInsulator4X-IRES-DHFR；该载体以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMV early enhancerichken beta actinpromoter, 由AG promoter 和hCMV-IE ehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN 104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸；绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQ ID NO:1；
（2）构建pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR表达载体
从人的畸胎癌细胞中利用Trizol试剂盒提取总RNA，利用逆转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA；以cDNA为模版，特异性引物hATX-For：5’-GTCAGCGGCCGCCACCATGG
CAAGGAGGAGCTC-3’ （含Not I酶切位点）、hATX-Rev：5’-GGCCCAATTGTTAGTGGTG
ATGGTGATGGTGATGATGGGCGCTGCCAATCTCGCTCTCATATGTATG-3’ （含Mun I酶切位点，C端引入8His tag），扩增ATX β基因；PCR扩增产物和pInsulator4X-IRES-DHFR质粒经Not I 和Mun I双酶切，T4 DNA连接酶连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，提取重组质粒pinsulator4X-ATXβ-8His-DHFR，Not I和Mun I双酶切鉴定，DNA测序；ATX β重组核酸序列为SEQ ID NO:2；
（3）重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株的构建和筛选
鉴定正确的重组表达质粒pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR经SwaI酶线性化处理后，利用Lippfectin2000TM阳离子转染试剂介导进入HEK293宿主细胞内；转染后无血清不完全DMED培养基更换为含10% 胎牛血清（FBS）DMEM完全培养基，获得重组表达细胞株；按照10%～20%接种量接种培养，分别用10 nM、50 nM、250 nM、500 nM、1000 nM氨甲喋呤(amethopterin, MTX)梯度加压筛选，采用有限稀释法亚克隆获得稳定高表达ATX单克隆细胞株；
（4）重组ATX蛋白的表达
经MTX加压筛选获得的重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株，采用分批补料培养方式，利用FreeStyle 293 expression medium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5 L体积转瓶培养；初始培养体积为200 ml，第24 h补料200 ml，第48 h补料300 ml，第60 h补料500 ml，总体积至1.2 L体积；培养条件为转速140～160 rpm，35～37℃，5% CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5 mmol/L和1.2 mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间；
（5）重组ATX蛋白纯化及lysoPLD、PDE活性检测
收集细胞培养上清，6800 rpm、4℃离心20 min后经0.22 µM滤膜过滤后经30000 DaMWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、1%Trionton、10 mM咪唑，pH7.8），Ni SepharoseTM excel亲和层析纯化；目的蛋白再经超滤浓缩至储存液（20mM Tris,150mM 氯化钠, 15% 甘油，pH 8.0）后，SDS-PAGE、Western blot鉴定；分别利用溶血磷脂酸胆碱LysoPC和对硝基苯基磷酸钠底物Bis-pNPP对重组人ATX蛋白的lysoPLD、PDE活性进行检测。
2.如权利要求1所述的重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是所述质粒pInsulator4X-IRES-DHFR是以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMV early enhancerichken beta actin promoter, 由AG promoter 和hCMV-IEehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN 104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸；绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1或2所述的重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是所述pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR表达载体是通过基因工程手段将ATX β重组核酸序列亚克隆到pInsulator4X-IRES-DHFR质粒上；ATX β重组核酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1或2所述的重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是所述重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株是以HEK293哺乳动物细胞作为宿主细胞筛选获得。
5.如权利要求1或2所述的重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是所述的重组HEK293-(pInsulator4x-ATX β-8His-DHFR)细胞株是经过10 nM、50 nM、250 nM、500 nM、1000 nM氨甲喋呤(amethopterin, MTX)梯度加压筛选获得。
6.如权利要求1或2所述的重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是所述的重组ATX蛋白的表达采用分批补料培养方式，利用FreeStyle 293 expression medium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5 L体积转瓶培养；初始培养体积为200 ml，第24h补料200 ml，第48 h补料300 ml，第60 h补料500 ml，总体积至1.2 L体积；培养条件为转速140～160 rpm，35～37℃，5% CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5mmol/L和1.2 mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间。
7.如权利要求1或2所述的重组自分泌运动因子的表达方法，其特征是所述的重组ATX蛋白的纯化是经30000 Da MWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20 mM Tris、500 mM 氯化钠、1%Trionton、10 mM咪唑，pH 7.8）后上样，所用层析柱为Ni SepharoseTM excel亲和层析柱。
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