CN106701782A - 拟南芥基因spoc1在调控植株开花期中的应用 - Google Patents

拟南芥基因spoc1在调控植株开花期中的应用 Download PDF

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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]

Abstract

本发明公开了拟南芥基因SPOC1在调控植株开花期中的应用,本发明筛选获得拟南芥基因SPOC1的T‑DNA插入突变体纯合体植株,并将其与相同条件下生长的野生型植株开花时间及莲座叶数目进行比较,发现敲除SPOC1基因引起拟南芥植株中开花相关基因CORGL2FUL、LFYAP1的表达变化,比野生型植株的开花期延迟。本发明的技术方案对于植物花期调控具有重要意义。

Description

拟南芥基因SPOC1在调控植株开花期中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及拟南芥基因SPOC1在调控植株开花期中的应用。
背景技术
微丝解聚因子(ADF/cofilin)广泛存在于真核细胞中,对维持细胞的形态结构、细胞运输、能量转换、信息传递、细胞分裂及分化等起着非常重要的作用。我们的前期研究表明,拟南芥ADF1在转基因植物中过量表达会引起不同细胞类型中微丝束的消失,而降低ADF1的表达量(基因沉默)则会促进微丝束的形成;ADF1表达量的变化还会影响植物的花期以及植物生长,ADF1表达量的降低导致开花延迟(野生型在35±1天开花,生长17片莲座叶;而ADF1基因沉默植株开花较野生型延迟2周,莲座叶数目为26片)。其后,人们通过基因敲除深入解析ADF在植物生长发育中的分子功能。拟南芥中adf4突变体具有更长的下胚轴和表皮细胞。AtADF7介导的微丝动态结构对于花粉管生长是必需的。通过研究拟南芥AtADF9的突变体(adf9-1,adf9-2),发现突变体植株的顶端优势增强,其花序的二级分支数目少于野生型,但分枝的长度比野生型长;长日照生长条件下突变体开花时间早于野生型,同时莲座叶数目比野生型少,而短日照生长条件下跟野生型相比没有明显差异。除此之外,AtDF9还能调控开花转换时期相关基因的表达量。虽然ADF基因表达水平直接影响植物生长发育特别是花期调控,但其调控的目标基因、参与的关键调控因子以及分子调控机制等都不清楚。
发明内容
本发明提供了拟南芥基因SPOC1在调控植株开花期中的应用。本发明以拟南芥ADF1为诱饵通过酵母双杂交系统从cDNA文库中筛选得到了十几个ADF1互作蛋白分子,获得本发明所述的基因SPOC1(基因编号为AT5G25520),其含有一个SPOC(Spen paralogue andorthologue,C-terminal)结构域及一个转录延长因子结构域。
为实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明提供了拟南芥基因SPOC1在调控拟南芥开花期中的功能。
进一步的:拟南芥中敲除SPOC1基因的植株与野生型植株相比延迟开花。
进一步的:所述SPOC1基因敲除后引起表达变化的开花基因是CO、RGL2、FUL、LFY和AP1。
进一步的:敲除SPOC1基因的拟南芥植株莲座叶数目多于野生型。
进一步的:敲除SPOC1基因的植株中涉及光周期途径CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FUL、LFY、AP1的表达量均低于野生型植株,赤霉素途径RGL2的表达量相对于野生型WT显著升高。
本发明的优点和有益效果:利用现有的植物生物技术,本发明筛选获得拟南芥基因SPOC1(AT5G25520)的T-DNA插入突变体纯合体植株,并将其与相同条件下生长的野生型植株开花时间及莲座叶数目进行比较,发现敲除SPOC1(AT5G25520)基因引起拟南芥植株中开花相关基因(CO、RGL2、FUL、LFY和AP1)的表达变化,比野生型植株的开花期延迟。本发明的技术方案对于植物花期调控具有重要意义。
附图说明
图1为拟南芥SPOC1(AT5G25520)基因T-DNA插入突变体的纯合体鉴定,其中(a)为LP与RP引物PCR扩增;(b)为LBa1与RP引物PCR扩增。
图2为野生型与突变体中SPOC1(AT5G25520)基因的表达量分析(**:P<0.01)。
图3为野生型与spoc1突变体的开花时间及莲座叶比较,其中(a)野生型与spoc1突变体的开花时间比较;(b)野生型与spoc1突变体的开花时间统计分析;(c)野生型与spoc1突变体莲座叶数目统计分析(**:P<0.01)。
图4为突变体花期调控基因表达量分析结果,其中(a).突变体开花抑制基因表达量分析;(b).突变体开花促进基因表达量分析;(c).突变体花器官特征基因表达量分析(*:P<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
上述实验中用到的试剂等购自TAKARA、Promega、Sigma等公司。
实验中用到的培养基和各种试剂配方:见《分子克隆》第三版。
实施例1、T-NDA插入突变体纯合体筛选
1、无菌苗获得
野生型拟南芥和SPOC1基因T-DNA插入突变体(SALK_099124C)的种子购买自ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)。SPOC1基因的全长基因编码(CDS)序列如SEQ ID No:1所示。
拟南芥种子使用1%的NaClO溶液(V/V)消毒8分钟,无菌吐温水振荡1分钟后再清洗6次,晾干后点播于1/2MS培养基上。4℃放置3d后,光照培养置于光照培养箱中(16h光照/8h黑暗,22℃),光照培养10d后将幼苗移入土中继续培养。
2、拟南芥植物组DNA提取
(1)取2片叶片置于1.5ml EP管中,加入DNA提取液800μl;
(2)60℃水浴1h,期间每隔10分钟颠倒混匀;
(3)12000rpm,离心10min;
(4)取700μl上清液至新的1.5ml EP管中,加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V),剧烈震荡后静置5min;
(5)12000rpm,离心10min;
(6)取600μl上清液新的1.5ml EP管中,加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V),剧烈震荡后静置5min;
(7)12000rpm,离心10min;
(8)取500μl上清液新的1.5ml EP管中,加入420μl 70%体积异丙醇,混匀;
(9)12000rpm,离心15min;
(10)弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm,离心1min,弃上清(重复2-3次);
(11)风干后加入50μl ddH2O溶解DNA。
DNA提取液配方
3、spoc1纯合突变体的三引物法鉴定
(1)根据spoc1突变体的SALK编号在网站(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)设计T-DNA插入突变体的鉴定引物LBa1、RP和LP。
引物名称 序列
LBa1 5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’(SEQ ID No:2)
LP 5’-AACAATGGTGGAGGTAAAGGG-3’(SEQ ID No:3)
RP 5’-GCCTGTAGAAGAATGCTGACG-3’(SEQ ID No:4)
(2)PCR反应体系
组分 用量
10×PCR Buffer 2.5μl
dNTP 1μl
LBa1 1μl
LP 1μl
RP 1μl
植物DNA 1μl
ddH2O 17.5μl
Taq酶 0.15μl
Total 25μl
(3)PCR反应程序
94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃1min,30个循环;72℃延伸7min。
(4)电泳检测
1%琼脂糖凝胶电泳检测,2000bp Marker。电泳结果如图1所示。由图1可知该spoc1突变体为纯合体。
实施例2.spoc1突变体中的SPOC1(AT5G25520)的表达量分析
1、拟南芥总RNA的提取
(1)取拟南芥莲座叶2片放入预冷的研钵中,加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。研磨过程中要保证材料浸在液氮中;
(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的1.5ml无RNA酶离心管中,每50-100mg组织材料加入1ml TRIZOL溶液,混匀后,于室温放置5min,然后12000rpm,4℃离心10min;
(3)取上清800μl至新的1.5ml无RNA酶离心管中,并加入0.2ml氯仿,振荡15sec充分混匀,于室温放置5min,12000rpm,4℃离心15min;
(4)取上清450μl,加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃放置30min;
(5)4℃,12000rpm,离心10min,弃上清;
(6)加1ml 75%乙醇洗涤沉淀2次,4℃,12000rpm离心5min,弃上清;
(7)室温放置晾干后,加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。
2、反转录(Takara反转录试剂盒)
(1)0.2ml无RNA酶EP管中,加入下列成分:
组分 用量
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA 1μg
RNase Free dH2O To 10μl
(2)42℃水浴3min,立即4℃冰浴。
(3)在反应后的无RNA酶EP管中,加入下列成分:
组分 用量
(1)步中反应体系 10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl
RT Primer Mix 1μl
5×PrimeScript Buffer 2 4μl
RNase Free dH2O To 20μl
(4)42℃水浴15min,85℃水浴1min,获得的cDNA于-20℃保存。
3、基因表达量分析
用获得的野生型及spoc1突变体cDNA进行荧光定量PCR检测,分析突变体中基因SPOC1(AT5G25520)的表达变化。
(1)引物设计
(2)PCR反应体系
组分 用量
SYBR Green Buffer 5μl
Primer-F 0.4μl
Primer-R 0.4μl
植物cDNA 1μl
ddH2O 3.2μl
Total 10μl
(3)qPCR反应程序
95℃5min;95℃30sec,55℃30sec,72℃20sec,40个循环;95℃1min,55℃30sec,95℃30sec。
荧光定量PCR结果如图2所示。由图2所示,突变体中SPOC1(AT5G25520)基因几乎检测不到转录产物。
实施例3.spoc1突变体与野生型开花时间比较
1、无菌苗获得
拟南芥种子使用1%的NaClO溶液(V/V)消毒8分钟,无菌吐温水振荡1分钟后再清洗6次,晾干后点播于1/2MS培养基上。4℃放置3d后,光照培养置于光照培养箱中(16h光照/8h黑暗,22℃),光照培养10d后将幼苗移入土中继续培养。
2、开花时间及莲座叶数目统计分析
选取生长正常的拟南芥野生型植株与spoc1突变体植株各40株,统计植株第一朵花开放时的植株生长天数及莲座叶数目。
统计结果如图3所示,spoc1突变体开花时间晚于野生型,莲座叶数目多于野生型,说明拟南芥中敲除SPOC1基因的突变体延迟开花。
实施例4.spoc1突变体与野生型开花相关基因的表达分析
1、拟南芥总RNA的提取
方法同实施例2所示。
2、反转录
方法同实施例2所示。
3、spoc1突变体与野生型开花基因表达分析
方法同实施例2所示。
在长日照生长10d的拟南芥幼苗,经过荧光定量PCR分析,拟南芥spoc1突变体植株中涉及光周期途径CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FUL、LFY、AP1的表达量均低于野生型植株,赤霉素途径RGL2的表达量相对于野生型WT显著升高,这与spoc1突变体植株的晚花表型相一致。
以上证据表明,通过敲除SPOC1(AT5G25520)基因,可影响部分开花相关基因的表达,从而改变植株的开花期。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 拟南芥基因SPOC1在调控植株开花期中的应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3003
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtccagta atatgggaac agagcttatt gatctggaga ctgtgaaagc ggattcagat 60
gcttttggag aaacgaattt gatggagtta gttggatcaa atgatcctcc ttctcttcag 120
catatctcag tttcagagat tgagcaagag cctatggaaa tatctgtctc tggtcctttg 180
tcattccaat ttgagccaga ggctgtctct tttcaatcat ctatgttggt tgatactcag 240
tctttgatgc ctcagttgca acttccatat tctgtagaga ggtcagtagc tgcatgtagt 300
aactcagtga cagggaagcg gaaatcgcca ccagagtcta ctctcagtgg ttctgctact 360
tccgagaagt tagatgcatc taacaagcga gtagagccag tgcaccacag accatggcta 420
gaacaatttt attcagaatg tattcagcgg ggtcatatgc caccacctgc tactctttct 480
accaagacag aacatctacc aacgcctgct aagaaagtaa ggcaaatgga acctgcttcc 540
caaaaatctg ggaagcaagt gatgaacaag aaacaagcag gcttgtcaca agggtcggtg 600
aaaacactga atgatggtaa cgagtctttg aggtctaaaa tgaaggaatc attagcagct 660
gccttggctt tggttcacga gcatgaggag tctccgaaag agaaaaagaa ttcagaaact 720
gaagaagcaa gtgttccagt agctgatagt aatgagcctg cgtcagcctg tggtaccagt 780
gttacagtag gtgaagacat cacgccagca atgtccacaa gggatgaaag ttttgagcag 840
aagaacggca atggaagaac tttgtcgcaa gagagttcca aggacaccaa gatgaattat 900
gttaatcaat ctgatgtaca gaaaactcaa tttgacgagg ttttcccctg tgatgatgtt 960
cgttttagtg atagtatttt tactggcgat gaacttttac agggtaatgg cctctcatgg 1020
gttttggaac ctgtttcaga ttttggggag aatgaaactc aaaagtcgtt tgaggatcca 1080
gagctcttgg catctaaaat tgagttggaa ctttttaagc tatttggagg tgtgaacaag 1140
aagtacaaag agaagggaag gtctctctta ttcaatttga aggataagaa caatcctgag 1200
ctaagagaaa gtgtcatgtc cggaaagata tctccagaga gattatgtaa tatgacagct 1260
gaggaacttg cttctaagga gctttctcag tggcgacaag caaaagcaga agagatggcg 1320
gagatggttg tcctacggga cacagacatt gatgtcagaa atctggtgag gaaaacgcat 1380
aaaggtgagt tccaggtaga aattgatccc gttgacagtg ggacagtgga tgtctctgct 1440
gagattacat caaatagtaa acctcgagcc aaagcaaaat cctcgaaatc atctaccaaa 1500
gccactttaa agaaaaatga ctctaatgat aagaacataa aatccaacca gggaacatca 1560
tctgctgtga ctctgccccc aacagaggag attgatccga tgcaaggtct gtcaatggat 1620
gatgagatga aggatgtggg atttcttcct ccaattgtat cccttgatga gttcatggaa 1680
tccctgaact cagaacctcc atttggcagt ccacatgaac atcctcctgg aaaggaagat 1740
cctgcatctg agaagagtga ctctaaagat gggtcacatt caaaatcacc ttcaagatct 1800
cctaagcagt ctccaaagga accgagtgag agcgtctctt ctaaaacaga actcgaaaag 1860
actaatgtaa tttccccaaa acctgatgct ggtgaccaac tcgacggtga tgtctccaaa 1920
cctgaaaata catctttggt tgatagcatt aaagaggatc gaatatggga tggtatattg 1980
cagcttagtt ccgcttcagt tgtctcagtc actggaattt tcaagagtgg tgagaaagca 2040
aagacaagcg agtggccaac aatggtggag gtaaagggta gagtgagact cagtgcgttt 2100
gggaagtttg taaaagagct tccgttgtct cgaagccgtg tcttaatggt aatgaacgtg 2160
gtttgcaaga atggtatctc tcagagccaa cgtgatagcc taattgaggt tgctaagtca 2220
tacgtagctg accaaagagt tggttacgca gaaccaacct cgggcgttga gctttacctc 2280
tgtccaacac tgggtgaaac cttggatttg ttgagcaaaa tcatctccaa ggattatctt 2340
gatgaggtca agtgttcaga agatatcggg ttgattggtg ttgttgtgtg gaggcgtgca 2400
gttgtcgcgt ctcctggctc acgccataag ccgggattca aacgtcagca ttcttctaca 2460
ggcactaaga ggtctgtatt ggctccagaa aaccaaaagt ctagaagtgt gagtgttacg 2520
aatccttctg ttgtaaatgt tgaatccatg aggaatcatg gtttggttgg ttgtgatgat 2580
gatgatgaag acatgcctcc tggatttggt cctgtagctg cgaaagatga cgatgattta 2640
ccggaattta actttaattc ctccagtgga ccggttactt cttctcctcg accaccgttg 2700
cagtcccggt ctttggatca agtaagggag ctcatactca agtatggaaa ttcaacaggt 2760
agtggtagta aacgaccatg ggatggtcat gatgatgatg atgacgacga cattcctgaa 2820
tggcaaccgc aactgccacc accacctcct gacttgagtc ctcaatttca tagcggaacc 2880
atggccagac caccagcaca acgacctgtt gcgggaccac cgagtggatg gaaggccaat 2940
caaaacgcac ctaggcaaca acagtacagt gcacgtagga acagaggatt ttgaactcaa 3000
cac 3003
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggttcacgt agtgggccat cg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacaatggtg gaggtaaagg g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcctgtagaa gaatgctgac g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcaagaggt tctcagcagt a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcaccttctt catccgcagt t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aactcagtga cagggaagcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtgaaccaaa gccaaggcag 20

Claims (5)

1.拟南芥基因SPOC1在调控拟南芥开花期中的功能。
2.根据权利要求1所述的拟南芥基因SPOC1在调控拟南芥开花期中的功能,其特征在于:拟南芥中敲除SPOC1基因的植株与野生型植株相比延迟开花。
3.根据权利要求1所述的拟南芥基因SPOC1在调控拟南芥开花期中的功能,其特征在于:所述SPOC1基因敲除后引起表达变化的开花基因是CORGL2FUL、LFYAP1
4.根据权利要求1所述的拟南芥基因SPOC1在调控拟南芥开花期中的功能,其特征在于:敲除SPOC1基因的拟南芥植株莲座叶数目多于野生型。
5.根据权利要求1所述的拟南芥基因SPOC1在调控拟南芥开花期中的功能,其特征在于:敲除SPOC1基因的植株中涉及光周期途径CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FUL、LFYAP1的表达量均低于野生型植株,赤霉素途径RGL2的表达量相对于野生型WT显著升高。
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