CN106688546B - 一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法，该方法包括植物材料的培植获得方法和土壤中干扰性铅离子的掩蔽处理方法；所述植物材料的培植获得方法为：制备孢子悬液；制备培养基质；设置培养条件；土壤中干扰性铅离子进行掩蔽处理。本发明通过培植和利用对镉敏感性最强的植株材料，进一步强化和提高了这种苔藓植物对镉污染的检测效果。此外，本发明采用了可高效排除土壤和水体中铅离子影响的“络合‑沉淀掩蔽剂”，从而为利用东亚金发藓高精准、专一性地检测土壤镉污染提供了技术保障。

Description

一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法

技术领域

本发明属于利用苔藓植物检测土壤和水体镉污染技术领域，尤其涉及一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法。

背景技术

镉在土壤环境中是一种十分危险的重金属污染元素，其具有稳定性强、容易积累和不易消除的特点，且可通过食物链的生物富集作用使人畜发生慢性中毒。当前，土壤镉污染备受世界关注，其是否已达到安全标准，关系到农作物及食品安全风险等诸多方面的问题。苔藓植物检测法是目前业内较受推崇的环境检测方法，其基本原理是：相对于高等植物而言，苔藓植物由于进化程度较低，其抵抗外界环境毒性的能力也较低，在环境污染毒害下可迅速表现出一系列显著症状及生长指标变化，通过这些变化可综合评价出环境污染程度，利用苔藓植物的这一特点可将其应用到大气、土壤及水体的重金属污染检测。该方法用于土壤镉污染检测尤为适宜，但所面临的现实问题是：自然界中的苔藓植物由于其在长期生长过程中已对污染环境产生了一定适应性，相关实施例表明，将其直接用于土壤镉检测时效果不佳，需经特殊处理以消除其背景适应性，进一步提高其对土壤镉的敏感度，才能更好地用于检测；此外，土壤中另一常见污染性元素铅的存在，影响了苔藓植物对镉元素检测效果的专一性和特异性(检测时很难判定苔藓植物受到的污染毒害是来自于镉元素亦或是铅元素)，因此大大降低了对土壤镉的检测效果和可信度。本发明所涉及的技术方法很好地解决了上述两方面的问题，从而实现了利用东亚金发藓高精准、专一性地检测土壤镉污染。

发明内容

本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法，旨在解决目前技术所涉及的最佳检测材料的获取问题，以及干扰性元素铅存在下难以专一性、特异性地检测镉污染的问题。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法，该方法包括用于检测土壤镉污染的植物材料的培植获得方法，和土壤中干扰性铅离子的掩蔽处理方法；

所述植物材料的培植获得方法为：

制备孢子悬液：采集孢子生长期成熟的东亚金发藓植株的孢子体若干，放于石英研钵中，加入少许液氮后，轻轻研磨至孢子体的苞蒴完全破裂，使内藏的孢子散出，加入蒸馏水反复冲洗研钵，滤掉大部分的苞蒴残体，从而获得孢子悬液；

制备培养基质：以体积比为1︰1的洁净砂质土壤和植物残体发酵物为基质配方，充分混合后作为东亚金发藓培养基质；

将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，出苗后50～60d进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤镉污染的检测材料；

所述土壤中干扰性铅离子的掩蔽处理方法为：

取所培植获得的成熟期带有孢子体的东亚金发藓植株，移植于经由0.5mol/L的氨水+0.02mol/L的氢氧化钙合成的化学掩蔽剂处理后的待检测土壤中，以生长在无污染基质中的植株为对照，观测其外观性状变化，并在第3～5d取样，测定并比较植株的叶绿素含量、可溶性总蛋白含量，依据指标变化，综合评价土壤镉污染程度。

进一步，加入蒸馏水反复冲洗研钵之后进一步包括：

将洗液一并通过网孔内径为1mm的不锈钢滤网进行过滤，滤掉大部分的苞蒴残体，从而获得孢子悬液。

进一步，植物残体发酵物可用花卉等植物沤制肥料代替，与砂质土壤进行充分混合后作为东亚金发藓培养基质，之后进一步包括：

将制备好的培养基质平铺于直径35cm、高6cm的聚乙烯浅盘中，基质厚度为5cm。

进一步，将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内培养，之后进一步包括：

培养温度设置为20℃～25℃，光照强度设置为2000Lux/10h，每日喷洒1/6浓度的Hogland营养液300-400mL/盘，使基质湿度保持在70％～80％；30～40d后东亚金发藓幼苗开始长出，此时将培养温度设置为30℃～35℃，光照强度设置为4000Lux/14h；出苗后50～60d则进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤镉污染的检测材料。

本发明一方面可有效排除检测待检土壤中铅离子的干扰，提高了所采用的苔藓植物对镉检测效果的特异性，另一方面通过培植和利用对镉敏感性最强的植株材料，进一步强化和提高了这种苔藓植物对镉污染的检测效果。

本发明采用了一种对土壤中的镉具有极高敏感性的苔藓植物——东亚金发藓，该种植物是一种进化程度较低的孢子植物(即在成熟期时通过孢子进行繁殖)。它结构简单，对镉毒性的抵抗力低，容易受到土壤中镉元素的毒害并快速地表现出症状，而且该种植物在外观上不同于一般的细小苔藓，其植株个体相对较大，成熟的植株高度可达6～8cm，受到镉毒害后表现出来的症状非常明显，很容易进行观测，因此非常适合进行土壤和水体镉污染检测。但在实际应用时发现，自然界中的东亚金发藓，由于在长期生长过程中已对污染环境产生了一定适应性，导致其对镉的敏感度降低，若直接采集后用于土壤镉污染检测，则检测效果不佳，需对其进行特殊处理后，消除其背景适应性，以获得最佳的植物检测材料。此外，土壤中另一常见污染性元素铅的存在，降低了东亚金发藓对土壤镉元素的检测效果和专一性。本发明一方面可有效排除检测待检土壤中铅离子的干扰，提高了所采用的苔藓植物对镉检测效果的特异性，另一方面通过培植和利用对镉敏感性最强的植株材料，进一步强化和提高了这种苔藓植物对镉污染的检测效果。本发明采用了可高效排除土壤和水体中铅离子影响的“络合-沉淀掩蔽剂”，将其应用于经本发明培植获得的具有高敏感度的东亚金发藓植株，可较好地解决前述问题，从而为利用东亚金发藓高精准、专一性地检测土壤镉污染提供了技术保障。

附图说明

图1是本发明提供的提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法流程图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

本发明采用了一种对土壤中的镉具有极高敏感性的苔藓植物——东亚金发藓，该种植物对镉毒性的抵抗力低，极易受到土壤中镉的毒害并快速地表现出显著症状，很容易进行观测，因此非常适合进行土壤和水体镉污染检测。但在实际应用时发现，若直接采集自然界中的东亚金发藓用于土壤镉污染检测，则检测效果不佳，这是由于野生植株在长期生长过程中，已对污染环境产生了一定适应性，导致其对镉的敏感度降低，需通过一定手段消除其背景适应性，以获得最佳的植物检测材料。此外，土壤中另一常见污染性元素铅的存在，降低了东亚金发藓对土壤镉元素的检测效果和专一性。本发明采用了可高效排除土壤和水体中铅离子影响的“络合-沉淀掩蔽剂”，并将其应用于经本发明培植获得的具有高敏感度的东亚金发藓植株，可较好地解决前述问题，从而实现了利用东亚金发藓高精准、专一性地检测土壤镉污染。

本发明提供的提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法，具体包括以下步骤：

步骤1，植物材料的培植获得过程：①制备孢子悬液：采集孢子生长期成熟的东亚金发藓植株的孢子体若干，放于石英研钵中，加入少许液氮后，轻轻研磨至孢子体的苞蒴(聚藏孢子的器官)完全破裂，使内藏的孢子散出，加入蒸馏水反复冲洗研钵，将洗液一并通过网孔内径为1mm的不锈钢滤网进行过滤，滤掉大部分的苞蒴残体，从而获得孢子悬液。②制备培养基质：以体积比为1︰1的洁净砂质土壤和植物残体发酵物(以花卉沤制肥料代替)为基质配方，充分混合后作为东亚金发藓培养基质，该基质具有质地疏松、有机质含量丰富、保湿性强、透气性好等特点，适合东亚金发藓生长。将制备好的培养基质平铺于直径35cm、高6cm的聚乙烯浅盘中，基质厚度为5cm。③将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，初始培养温度设置为20℃～25℃，光照强度设置为2000Lux/10h(该时期模拟出苗前三四月份的野外环境)，每日喷洒1/6浓度的Hogland营养液300-400mL/盘，使基质湿度保持在70％～80％；30～40d后东亚金发藓幼苗开始长出，此时将培养温度设置为30℃～35℃，光照强度设置为4000Lux/14h(该时期模拟出苗后五六月份的野外环境)；出苗后50～60d进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤镉污染的检测材料。

步骤2，土壤中干扰性铅离子的掩蔽处理：本发明提供了一种可高效排除土壤铅离子干扰的掩蔽剂，其组成为：0.5mol/L的氨水+0.02mol/L的氢氧化钙。其研发依据及原理是：当环境中有镉、铅离子同时存在时，氨加入后首先与镉离子发生特异性络合反应，其化学式为Cd²⁺+NH₃·H₂O→Cd(NH₄)₂+H₂O，反应生成的氨-镉络合物仍具有与镉离子相同的毒性；待继续加入氢氧化钙溶液后，该溶液中大量的氢氧根离子不能与氨-镉络合物反应，但可与铅离子迅速发生沉淀反应，从而将其掩蔽，其化学反应过程式为Pb²⁺+2OH^-→Pb(OH)₂↓；之所以选择低浓度的氨水及氢氧化钙溶液，主要在于该两种物质对土壤环境无任何损害，相反可适当补充土壤中植物生长所需要的大量元素N、Ca的含量，增强土壤肥力，更有利于作物的生长。

步骤3，土壤镉污染检测实施过程：取上述经本发明培植获得的的东亚金发藓植株，移植于化学掩蔽剂处理后的待检测土壤中，以生长在无污染基质中的植株为对照，观测其外观性状变化，并在第3～5d取样，测定并比较植株的叶绿素含量、可溶性总蛋白含量，依据相关指标变化，综合评价土壤镉污染程度。

为进一步验证本发明所涉及植株材料培植过程产生的效果，分别将直接采集获得、经本发明培植的植株材料，同时移植于含有不同浓度镉污染的土壤中，比较两类植株对镉敏感度的大小。由表1数据可知，直接采集与经本发明培植获得的植株，对镉的敏感度表现出了显著的差异性。在任一镉浓度下，经本发明培植获得植株的叶绿素含量、可溶性蛋白含量与空白对照相比，其降低幅度均大于直接采集的植株，即说明经本发明培植获得的植株材料，其对镉的敏感度得到了显著提升，因此更适合于作为土壤镉污染的检测材料。

为进一步验证本发明所涉及掩蔽剂的效果，采用了无土栽培的方式，设置了多个试验重复样品，将东亚金发藓植株根部浸没于营养液中，分别向不同样品营养液中以硝酸盐的形式施加一定量的镉离子、铅离子及镉铅混合离子，再分别以单独施加0.5mol/L的氨水、0.02mol/L的氢氧化钙溶液，以及共同施加前述两种溶液的方式进行处理(按照氨水在前、氢氧化钙在后的顺序施加)，观测东亚金发藓植株在不同处理环境下的生长状况、叶绿素含量、可溶性总蛋白含量等指标参数(表2～表4)，并与不添加重金属及掩蔽剂的空白营养液中的植株作对比，结果发现，空白纯培养液中的东亚金发藓植株生长正常，无任何受胁迫毒害的症状，而添加了镉、铅及其混合液的植株均有明显受害症状，叶绿素及可溶性蛋白含量与空白样品相比显著降低；单独施加氨水不能消除单一的镉、铅离子及其混合液的毒性，单独施加氢氧化钙则可通过沉淀掩蔽作用消除单一的镉、铅离子及其混合液的毒性；先后施加氨水和氢氧化钙(即本发明所涉及的掩蔽剂)则能有效地去除镉铅离子混合液中铅离子的毒性而保留镉离子的毒性。综上可知，对于镉铅离子混合液来讲，所涉及的化学掩蔽剂可有效地沉淀掩蔽铅离子，从而排除其干扰。

在上述实验的基础上，将所涉及的化学掩蔽剂应用于含有一定浓度镉、铅复合污染的土壤，结果发现，东亚金发藓植株所表现出的生长反应及性状指标，均与上述水培实施例中的试验结果相符合。综合说明本发明适用于东亚金发藓专一性地检测土壤镉污染。

本实施例中对样品的具体处理方法及观测效果如下表1～4所示：

表1野外采集与本发明培植获得的植株材料对土壤镉的敏感性比较

通过上表1中对几种敏感性指标的检测对比，可清楚地看出，经过本发明技术所培植获得的东亚金发藓植株材料，在检测性能上明显优于不经培植过程而直接采集获得的植株。

表2施加掩蔽剂对水培液镉毒性的影响效果

表3施加掩蔽剂对水培液铅毒性的影响效果

表4施加掩蔽剂对水培液镉、铅毒性的影响效果

通过综合分析比较上表2～表4中的实施效果可见，在环境中有镉、铅同时存在的情况下，本发明所涉及掩蔽剂组合的施用，有效地排除了干扰性铅元素的毒性影响，从而单一性地保留了镉元素的毒性。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。

Claims (2)

1.一种提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法，其特征在于，该方法包括植物材料的培植获得方法和土壤中干扰性铅离子的掩蔽处理方法；

所述植物材料的培植获得方法为：

制备孢子悬液：采集孢子生长期成熟的东亚金发藓植株的孢子体若干，放于石英研钵中，加入液氮后，研磨至孢子体的苞蒴完全破裂，使内藏的孢子散出，加入蒸馏水反复冲洗研钵，过滤后获得孢子悬液；

制备培养基质：以体积比为1︰1的洁净砂质土壤和植物残体发酵物为基质配方，混合后作为东亚金发藓培养基质；将制备好的培养基质平铺于直径35cm、高6cm的聚乙烯浅盘中，基质厚度为5cm；

设置培养条件：将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，模拟出苗前三四月份的野外环境，待东亚金发藓幼苗开始长出；然后模拟出苗后五六月份的野外环境继续培养；出苗后50～60d则进入孢子生长阶段，将植株作为土壤镉污染的检测材料；

所述土壤中干扰性铅离子的掩蔽处理方法为：

取所培植获得的东亚金发藓植株，移植于经过化学掩蔽剂处理后的待检测土壤中，以生长在无污染基质中的植株为对照，观测其外观性状变化，并在第3～5d取样，测定并比较植株的叶绿素含量、可溶性蛋白含量，依据指标变化，综合评价土壤镉污染程度；

加入蒸馏水反复冲洗研钵之后进一步包括：

将洗液一并通过网孔内径为1mm的不锈钢滤网进行过滤，滤掉苞蒴残体，获得孢子悬液。

2.根据权利要求1所述的提高苔藓植物检测土壤镉污染灵敏度和特异性的方法，其特征在于，将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，之后进一步包括：

培养温度设置为20℃～25℃，光照强度设置为2000Lux/10h，每日喷洒1/6浓度的Hogland营养液300-400mL/盘，使基质湿度保持在70％～80％；30～40d后东亚金发藓幼苗开始长出，此时将培养温度设置为30℃～35℃，光照强度设置为4000Lux/14h；出苗后50～60d则进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤镉污染的检测材料。

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