CN106686981A - 角膜血管生成和角膜扩张疾病的动物模型，其制备方法，以及其使用方法 - Google Patents

Abstract

描述了通过向非人动物的眼睛施用芳香族化合物来制备角膜血管生成和角膜扩张疾病(诸如，圆锥形角膜)的非人动物模型的方法。还描述了角膜血管生成和角膜扩张疾病的动物模型，以及使用所述的非人动物模型来筛选调节角膜血管生成和角膜扩张疾病的化合物的方法。

Description

角膜血管生成和角膜扩张疾病的动物模型，其制备方法，以及 其使用方法

发明领域

本发明涉及角膜疾病的非人动物模型，尤其是角膜血管生成和角膜扩张疾病(诸如圆锥形角膜)的动物模型。

发明背景

血管生成是由先前存在的血管形成新血管的生理过程。抑制血管生成作为一种治疗策略，特别是用于治疗肿瘤和癌症的概念已经讨论了几十年，并且现在被广泛认为是治疗一系列病理和疾病状态(其中血管增殖是一个部分)的有前途的方法。抗血管生成的策略已经不仅用于抗癌治疗，还用于治疗关节炎、视网膜病，心脏病和血液循环问题。因此，血管生成的实验动物模型对于研究血管的血管生成和生长、评估不同化合物对血管生成的效果、以及筛选化合物以鉴定具有抗血管生成或促血管生成活性的化合物非常重要。

角膜被认为是体内血管生成的理想模型，因为它无血管，因此任何血管发生(即新血管的发生)通常都可直接归因于施用于眼睛的角膜区域的物质或化合物。因此，开发出来以用于研究体内血管生成的许多动物模型都是角膜血管生成动物模型。通常，通过将角膜囊或虹膜移植物移入动物眼睛中来制备这些动物模型。

在角膜囊模型中，将血管生成的诱发剂，诸如肿瘤组织、细胞悬液或生长因子置入在角膜中形成的囊内，其诱发新血管的形成。然而，角膜囊的形成常常是一个很困难的操作，通常通过用手术刀进行层状剥离以在角膜中产生空间或“囊”，向其中引入血管生成的诱发剂。由于所述操作的外科性质，该操作常常产生并发症，包括与以下相关的问题：使用的麻醉剂，在剥离期间眼睛的前房穿孔，血管生成诱发剂准备的不充分，以及外科伤口自身或用于缝合外科伤口所用的缝合线导致的血管生成。此外，可因组织操作和缝合、以及对插入到角膜囊的血管生成诱发剂(其通常是外来物质)的响应而产生炎症反应。外来物质插入到眼睛中所引起的反应还可导致纤维化，即器官或组织中过量纤维结缔组织的形成。纤维化通常是修复或反应过程的结果。

此外，就本发明人所知，目前尚无角膜扩张疾病(诸如圆锥形角膜)的动物模型。角膜扩张是由于角膜变薄或弱化而引起的角膜的进行性凸起，同时伴随着视力恶化、视力损伤、或二者皆有。圆锥形角膜是更常见的角膜扩张疾病的一种，具有如下特征：角膜从典型的圆形结构性形变为圆锥形，所述圆锥形的角膜从眼睛的角膜区向外突出或凸起。角膜扩张疾病动物模型将为体内研究这些疾病提供工具。

发明概述

因此，存在开发可克服与现有血管生成模型相关的某些缺点的新的体内血管生成动物模型的需求。还需要开发可用于研究这些疾病的角膜扩张疾病的动物模型。本发明通过提供可克服与现有体内血管生成模型相关的某些缺点的角膜血管生成动物模型来满足这种需求。本发明还提供了角膜扩张疾病(诸如圆锥形角膜)的动物模型。

在一个总的方面，本发明涉及一种制备角膜血管生成非人动物模型的方法，所述方法包括向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

其中，R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

在本发明所述的一种制备角膜血管生成非人动物模型方法的一个具体实施方式中，所述施用的式(I)芳香族化合物的有效量为约1μmol到约70μmol。

在另一个总的方面，本发明涉及一种制备角膜扩张疾病非人动物模型的方法，所述方法包括：向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

其中，R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

在本发明所述的一种制备角膜扩张疾病非人动物模型方法的一个具体实施方式中，所述式(I)芳香族化合物的有效量为约30μmol到约85μmol。

在另一总的方面，本发明涉及一种筛选调节角膜血管生成或角膜扩张疾病的化合物的方法，所述方法包括：

(i)用下述方法制备角膜血管生成或角膜扩张疾病的非人动物模型，所述方法包括：向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

(ii)向非人动物模型的所述至少一只眼睛施用测试化合物；和

(iii)确定所述测试化合物对以下至少之一的影响：所述至少一只眼睛的角膜内的血管生长和角膜的结构性形变，其中R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

本发明的其他方面涉及用本发明的方法制备的角膜血管生成和圆锥形角膜的非人动物模型。

在本发明特别优选的实施方式中，所述式(I)芳香族化合物为苯或苯酚。

在另一个总的方面，本发明涉及一种鉴定对人类健康有害的物质的方法，所述方法包括：

(i)向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用测试物质；和

(ii)确定所述测试物质对以下至少之一的影响：角膜内的血管生长和角膜的结构性形变。

本发明的一个或多个实施方式的细节列于以下说明中。其它特征和优点将从以下的详述、附图和所附权利要求书中明显得出。

附图的简要说明

结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的以下详述。为了阐述本发明，在附图中示出了目前优选的实施例。然而，应理解，本发明不限于附图所示和在本发明的以下详述中所描述的确切的排列和手段。在附图中：

图1A、1B和1C显示了用3.0M苯酚溶液处理威斯塔大鼠(Wistar rat)右眼前后的摄影图像；图1A：施用苯酚前的右眼的摄影图像；以及图1B：单次表面局部施用3.0M苯酚溶液(10μl)后3周的右眼摄影图像，并且插图示意性显示了角膜中观察到的血管生长；图1C：单次表面局部施用3.0M苯酚溶液(10μl)后8周，用苏木精和曙红染色剂染色的角膜上皮膜的切片图；

图2A、2B和2C显示了施用苯溶液15天后，单次施用不同浓度的苯溶液处理威斯塔大鼠右眼的摄影图像；图2A：用4.0M苯溶液(10μl)处理的眼；图2B：用6.0M苯溶液(10μl)处理的眼；和图2C：用7.0M苯溶液(10μl)处理的眼；和

图3显示了施用7.0M苯的水溶液后15天的威斯塔大鼠的眼睛摄影图像。

发明详述

本文提及的所有专利和出版物都通过引用的方式并入本文。除非另有定义，否则本文所用的所有技术性和科学性术语是本发明相关领域技术人员普遍理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中所阐述的含义。

需注意，如本文和附属的权利要求所用，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”、以及“该”包括复数引用，除非上下文另有明确的说明。

如本文所用，术语“非人动物”是指任何动物，最优选哺乳动物，其不是人。哺乳动物的实例包括牛、狗、猫、马、猪、猴、绵羊和啮齿动物。啮齿动物的实例包括大鼠、小鼠、兔和豚鼠。优选地，非人动物是选自大鼠、小鼠、兔和豚鼠的啮齿动物，更优选大鼠。

如本文所用，术语“角膜”指覆盖虹膜、瞳孔和前房的眼睛前部的透明组织。所述角膜是无血管的，意味着它通常没有血管。所述角膜还通常为圆形。

如本文所用，术语“血管生成”和“新血管形成”指由先前存在的血管形成新血管的生理过程。如本文所用，术语“角膜血管生成”和“角膜新血管形成”指角膜内一个或多个血管的生长。由于所述角膜无血管，即不含有任何血管，因而角膜内的任何新血管通常起因于来自眼睛的角膜缘血管丛区的血管生长至角膜中。

如本文所用，术语“纤维化”指器官或组织中的纤维结缔组织的形成，通常为修复或再生过程的结果。所述纤维结缔组织可为疤痕组织。

如本文所用，术语“角膜扩张”和“角膜扩张疾病”指角膜的非炎性疾病，其特征为，角膜的不规则性导致了由散光引起的视力障碍。角膜扩张指包括圆锥形角膜，透明边缘退化，球形角膜，和后圆锥角膜的一组病症，最普遍的，特别是在人类中，是圆锥形角膜。

根据本发明的一个优选实施方式，角膜扩张疾病为圆锥形角膜。术语“圆锥形角膜”指影响角膜结构的一种疾病。在圆锥形角膜中，角膜的形状慢慢地由常规的圆形变为圆锥形，向外凸出，形成突出物。也可将圆锥形角膜描述为角膜的“形状丧失”。

如本文所用，当参照角膜使用时，“结构性形变”指角膜形状的变化，其特征在于角膜的凸起或突出。在一个具体的实施方式中，“结构性形变”指角膜的形状由圆形变为突出于眼外的圆锥形。

如本文所用，“有效量”指诱发预期的生理结果所需的式(I)化合物的量。在一实施方式中，有效量为诱发角膜中一个或多个新血管生长的量。在另一实施方式中，有效量为引起角膜结构性形变的量。

如本文所用，术语“烷基”指饱和的、无支链或有分支的烃链，其含有至少一个碳原子，较佳地，1-20个碳原子，更佳地，1-3个碳原子。无支链烷基的例子包括，但不限于：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、和己基。分支的烷基的例子包括，但不限于：异丙基和叔丁基。

如本文所用，术语“烷氧基”指具有通式–OR的单元，其中R代表烷基。烷氧基的例子包括，但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基、和丁氧基。

如本文所用，术语“卤素”具有本领域普通技术人员已知的普通含义。卤素的非限制性例子包括氟、溴、氯、和碘。

烷基可以是未取代的，或者被一个或多个合适的取代基取代。当烷基被取代时，它可具有一个或多个取代基，较佳地，1-3个取代基，更佳地，1-2个取代基。可以取代烷基的适当的取代基的代表性的例子包括，但不限于：卤素，诸如氟、氯、溴、和碘；羟基、烷氧基，诸如甲氧基、乙氧基、和丙氧基；和氨基。

本发明涉及角膜血管生成和角膜扩张疾病(诸如圆锥形角膜)的非人动物模型。通过向非人动物的眼睛中施用芳香族化合物，诸如苯或苯酚，从而制得所述的非人动物模型。发明人惊奇的发现，根据施用于眼睛的芳香族化合物的量，可诱发出角膜血管生成和/或角膜扩张疾病。例如，较低量的芳香族化合物诱发角膜血管生成，而通常需要增加芳香族化合物的量来诱发角膜扩张疾病。

在一个总的方面，本发明涉及一种制备角膜血管生成非人动物模型的方法。根据本发明的实施方式，所述方法包括：向非人动物的至少一只眼睛中施用有效量的式(I)芳香族化合物：

其中，R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

根据本发明优选的实施方式，所述式(I)芳香族化合物为苯或苯酚。苯为式(I)芳香族化合物，其中，n为0。苯酚为式(I)芳香族化合物，其中，R为羟基，并且n为1。在一个具体的实施方式中，所述芳香族化合物为苯酚。

可用本领域已知的任何方法将有效量的式(I)芳香族化合物施用于非人动物的眼睛中，所述方法包括，但不限于：表面局部(topical)施用和注射。较佳地，表面局部施用有效量的式(I)芳香族化合物。可用于本发明的表面局部组合物的例子包括，但不限于：膏剂、凝胶剂、软膏剂、和液体组合物，诸如溶液、悬浮液、和滴眼剂。优选的表面局部组合物包括液体组合物，尤其是滴眼剂。

根据本发明的实施方式，可根据本发明公开的内容，用本领域已知的任何方法将式(I)化合物表面局部施用于角膜。表面局部施用式(I)化合物的方法的非限制性的例子包括滴剂和擦拭的方式。较佳地，以滴剂的方式将式(I)化合物施用于角膜。

在本发明的一个优选实施方式中，以液体组合物的形式将式(I)芳香族化合物表面局部施用于眼睛中，更佳地，以水性媒介物的形式施用。如本文所用，术语“水性媒介物”为液体组合物，其含有水和式(I)芳香族化合物。水性媒介物的非限制性的例子包括溶液、悬浮液、滴眼剂等。在本发明的一个具体的实施方式中，水性媒介物含有水和苯或苯酚。

根据本发明的实施方式，将所述式(I)芳香族化合物施用于眼睛的角膜，较佳地，直接施用于角膜的中心。可将所述式(I)芳香族化合物施用于动物的一只眼，或两只眼。在本发明的某些实施方式中，优选将式(I)芳香族化合物施用于动物的一只眼，因为需要将另一只未处理的眼睛用作对照。

根据本发明的实施方式，制备角膜血管生成非人动物模型所需的式(I)化合物的有效量为约1μmol到70μmol，较佳地，30μmol到70μmol，诸如约1μmol、5μmol、10μmol、30μmol、40μmol、50μmo、60μmol、或70μmol。可一次或多次施用有效量的式(I)化合物。较佳地，可单次施用有效量的式(I)芳香族化合物。

由于不同动物物种间，有时在相同物种的动物之间，存在血管生成反应的差异，施用于动物眼睛中以诱发角膜血管生成的式(I)芳香族化合物的有效量可取决于多种因素，包括，但不限于：动物的具体物种、动物的年龄等。根据本发明公开的内容，本领域技术人员为了获得预期的生理反应会容易确定施用于非人动物眼睛中的式(I)芳香族化合物的有效量。本领域技术人员也会理解，在对式(I)的芳族化合物的血管生成反应中，相同物种的动物之间可能存在变异性。

本领域已知的任何方法均可用于评价任何特定量的式(I)芳香族化合物的血管生成活性，以确定这样的量是否对诱发所需量的角膜血管生成是有效的。例如，血管生成活性的效力可以通过测定新形成的毛细血管和血管的数量或增长率，或通过计算血管生成分数来评价。血管生成分数可根据下述公式进行计算：(血管密度)×(距角膜缘的距离)。角膜缘是角膜和巩膜(眼睛的白色部分)的边界。血管密度值为1对应于每个角膜约0-25个血管；值为2对应于每个角膜约25-50个血管，值为3对应于每个角膜约50-75个血管；值为4对应于每个角膜约75-100个血管；值为5对应于每个角膜超过100个血管。可借助目镜网格来测量距角膜缘的距离(以mm计)。

作为另一个说明性的例子，可以通过组织学研究来评价血管生成的活性。例如，苏木精和曙红(H&E)染色剂可用于染色解剖的角膜组织，并且检测新血管的形成。如图1C所示，它是单次表面局部施用3.0M苯酚溶液8周后，用H&E染色剂染色的角膜上皮膜的切片的图像，可检测到不同的生物结构，以评估血管生成活性和角膜血管生成的进程。具体地，箭头1指向正常的角膜上皮，箭头2指向通过施用通常不存在于角膜中的苯酚所诱发的新血管的生长，箭头3指向角膜的正常基质组织。

作为说明性和非限制性的例子，当式(I)芳香族化合物为苯或苯酚，有效量可在约1μmol-70μmol的范围内变化(即，约75μg－5.5mg)，较佳地，30μmol-70μmol，诸如1μmol、5μmol、10μmol、30μmol、40μmol、50μmol、60μmol或70μmol。

在一个具体的实施方式中，本发明方法中所用的非人动物为白化动物。如本文所用，“白化动物”指至少在眼睛中缺少色素尤其是黑色素的动物。与眼睛里有黑色素的色素动物相比，白化动物产生更纯的角膜血管生成动物模型，因为在向角膜施用式(I)芳香族化合物尤其是苯从而诱发血管生成时，色素动物趋向于具有更大程度的角膜纤维化。

本发明还涉及一种用本发明的方法制备的角膜血管生成非人动物模型。根据本发明的实施方式，角膜血管生成的非人动物模型在眼睛的角膜中基本没有纤维化。此外，所述角膜血管生成的非人动物模型在动物的至少一只眼睛的角膜中包括一个或多个新血管。由于纤维化是一种在组织修复中发生的天然的生理过程，因此在本发明的非人动物模型的角膜中可以观察到一些纤维化。然而，所观察到的纤维化的量(如果有的话)显著低于在角膜血管生成的其它动物模型中观察到的纤维化的量。

因而，与现有技术的角膜血管生成动物模型相比，角膜血管生成的非人动物模型有几点优势。具体地，由于角膜中基本没有纤维化，可用来制备更纯的角膜血管生成动物模型。更具体地，现有技术的角膜血管生成动物模型具有复杂的血管生成反应，并且除了新血管的生长，通常也可以在角膜中观察到纤维化或疤痕组织的形成。纤维化和疤痕组织的存在使理解血管生成过程困难并且更复杂。相比之下，用本发明的角膜血管生成的非人动物模型所观察到的纤维化的量被基本消除或至少显著降低，这使得对血管生成过程的研究变的更加容易。

此外，与使用苯时所观察到的量相比，当使用苯酚时，可观察到较少的纤维化和疤痕组织形成。因此，苯酚是用于本发明的优选的式(I)芳香族化合物。

与现有技术的动物模型相比，除了可大量降低角膜中的纤维化的量，本发明所述的角膜血管的非人动物模型还具有其他的优点。例如，通过简单地向非人动物的眼睛中施用式(I)芳香族化合物(诸如苯或苯酚)的滴眼溶液，即可制备获得所述的动物模型。因此，不需外科手术。这消除了通常与外科手术相关或由其引发的许多并发症，诸如由于组织操作引起的炎症反应，切口部位的感染和眼睛前房的穿孔。此外，不需缝合，进一步减少了并发症。因此，与之前的产生角膜血管生成动物模型(诸如角膜囊模型)的方法相比，本发明的制备非人动物模型的方法操作更简单、更便宜、并且需要的时间更少。

在另一总的方面，本发明涉及一种制备角膜扩张疾病非人动物模型的方法。根据本发明所述的实施方式，所述方法包括：向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

其中，R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

本文所述的任何式(I)芳香族化合物均可在制备角膜扩张疾病非人动物模型的方法中使用。在优选的实施方式中，所述式(I)芳香族化合物为苯或苯酚。

任何用于将式(I)芳香族化合物施用至本文提及的根据本发明制备角膜血管生成的非人动物模型时所描述的非人动物眼睛的角膜的方法，都可用于本发明所述的制备角膜扩张疾病非人动物模型的方法中。优选的施用方法包括表面局部施用，优选的表面局部化合物包括液体组合物，诸如水溶液或其他水性媒介物。在一优选的实施方式中，通过滴眼剂的形式将水溶液或水性媒介物施用于所述角膜。

根据本发明的实施方式，制备角膜扩张疾病非人动物模型所需的式(I)芳香族化合物的有效量为约30μmol－85μmol，诸如30μmol、40μmol、50μmol、60μmol、65μmol、70μmol、75μmol、80μmol、或85μmol。一般而言，用于制备角膜扩张疾病非人动物模型的式(I)芳香族化合物的有效量大于用于制备角膜血管生成非人动物模型的式(I)芳香族化合物的有效量。所述有效量可单次施用或多次施用，较佳地，单次施用。

在本发明的一个具体的实施方式中，可向非人动物的眼睛中施用约70μmol－85μmol的苯(即，约5.5mg－约7.0mg的苯)，以制备圆锥形角膜的模型。例如，施用在水性媒介物中诸如滴眼剂形式的7.0M－8.5M的苯可诱发角膜的结构性形变，从而获得圆锥形角膜的模型。见图3。在另一具体的实施方式中，可向非人动物们的眼睛中施用30μmol－85μmol的苯酚，以制备圆锥形角膜的模型。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述角膜扩张疾病为圆锥形角膜。圆锥形角膜是在人类中发展的更常见的角膜扩张疾病的一种。根据本发明的实施方式，在圆锥形角膜的非人动物模型中，所述角膜的结构性形变可表征为从圆形角膜变为圆锥形的形状变化。参见，例如，图3。随着式(I)芳香族化合物施用后圆锥形角膜的发展，角膜开始变薄并从眼睛向外突出，产生凸起。

根据具体的实施方式，白化动物可以用在本发明的方法中，用于制备角膜扩张疾病的非人动物模型。

本发明还涉及用本发明的方法制备的角膜扩张疾病的非人动物模型。根据本发明的实施方式，角膜扩张疾病的非人动物模型具有含有结构性形变的角膜，所述结构性形变的特征在于形状从圆形到圆锥形的变化。

据本发明人所知，目前为止，尚无已知的角膜扩张疾病的动物模型，诸如圆锥形角膜动物模型。本发明因而通过提供简单且制造成本低廉并且也不需要复杂的设备的角膜扩张疾病的动物模型满足了这种需求。

根据本发明的实施方式，如本文所述，在制备非人动物模型的方法中，与诱发角膜扩张疾病所需的式(I)芳香族化合物的量相比，诱发角膜血管生成所需的量更少。例如，当施用于非人动物的眼睛时，约1μmol－70μmol的苯或苯酚足以诱发角膜血管生成，而需约70μmol－85μmol的苯或30μmol－70μmol的苯酚来诱发血管扩张疾病，诸如圆锥形角膜。参见，例如，图2和图3。

因此，作为一个说明性的例子，在制备角膜血管生成的非人动物模型的方法中，可向非人动物的眼睛施用10μL的0.1M－7.0M的苯溶液，而在制备角膜扩张疾病动物非人动物模型的方法中，可向非人动物的眼睛施用10μL的7.0M－8.5M的苯溶液。也可改变苯的浓度以调整角膜血管生成的诱发率，以及调整新血管生长的量。见图2，其表明大鼠角膜中观察到的血管生长的量随着所施用的苯的浓度的增加而增加。当然，本领域的普通技术人员将容易理解，在血管生成反应和圆锥形角膜或所观察到的其他角膜扩张疾病的发展中，同一动物的种类之间(species of the same animal)可存在生物变异性。

由于诱发角膜血管生成所需的式(I)芳香族化合物的量比诱发角膜扩张疾病所需的量更少，角膜扩张疾病的动物模型还可包括眼睛角膜中的一个或多个新血管，以及在施用高浓度的式(I)芳香族化合物时所观察到的角膜的结构性形变。这是因为当使用较高浓度的式(I)芳香族化合物时，除了导致角膜的结构性形变，新血管通常会生长。

根据本发明的实施方式，在制备角膜血管生成或角膜扩张疾病动物模型的方法中，除了式(I)芳香族化合物，还可向非人动物的眼睛中施用麻醉剂。麻醉剂是一种具有镇痛效果即诱发无痛和/或无感觉的药物。用于外科眼手术的任何麻醉剂都可使用，包括表面局部(topical)、局部(local)和全身麻醉剂。较佳地，使用局部麻醉剂。本发明可使用的麻醉剂的例子包括，但不限于：赛罗卡因、盐酸普鲁卡因、丁卡因、布比卡因和利多卡因。可以用任何本领域已知的将麻醉剂施用于外科眼手术的方法施用所述的麻醉剂，诸如表面局部施用。所述麻醉剂还可以与式(I)芳香族化合物在同一组合物(例如，水溶液)中施用于眼睛中。

施用麻醉剂的目的在于减轻与施用式(I)芳香族化合物相关的任何疼痛或不舒服感。可在施用式(I)芳香族化合物之前将所述麻醉剂施用于眼睛中，与式(I)芳香族化合物一起施用，或在式(I)芳香族化合物之后施用，较佳地，在施用式(I)芳香族化合物之前或与式(I)芳香族化合物一起施用。

在另一些总的方面，本发明涉及用本发明的非人动物模型研究角膜血管生成和角膜扩张疾病(例如，圆锥形角膜)的方法。例如，本发明所述的非人动物模型可用于筛选调节角膜血管生成的化合物，以鉴定可用于治疗或预防与增加或减少的体内血管生成相关的疾病的角膜血管生成调节剂。本发明的所述非人动物模型还可用于筛选有效治疗或预防角膜扩张疾病诸如圆锥形角膜的化合物。

根据本发明的实施方式，一种筛选调节角膜血管生成或角膜扩张疾病的化合物的方法包括：

(i)制备角膜血管生成或角膜扩张疾病的非人动物模型，包括：向非人动物的至少一只眼睛施用有效量的式(I)芳香族化合物；

(ii)向所述非人动物模型的所述至少一只眼睛施用测试化合物；和

(iii)确定所述测试化合物对以下至少之一的影响：角膜中的血管生长和角膜的结构性形变。

本文所述的任何方法均可用于制备本发明所述的筛选化合物的方法中使用的非人动物模型。

根据本发明的实施方式，测试化合物可在施用式(I)芳香族化合物之前、同时、或之后施用。可用本领域已知的任何方法施用测试化合物，包括，但不限于：表面局部施用和注射。较佳地，表面局部施用测试化合物，诸如在液体组合物、溶液、或水性媒介物中。在某些实施方式中，以单一组合物的形式同时施用测试化合物和有效量的式(I)芳香族化合物。可将测试化合物和有效量的式(I)芳香族化合物施用于所述非人动物的一只眼睛，可将有效量的式(I)芳香族化合物施用于另一只眼睛。通过比较用测试化合物处理过的眼睛和未用测试化合物处理的眼睛，可以确定所述测试化合物对角膜血管生成和/或角膜扩张疾病的影响。

如本文所用，术语“调节”指对角膜血管生成或角膜扩张疾病的发作、发生或进展有影响。在一实施方式中，调节指抑制角膜血管生成或角膜扩张疾病的发作，减缓其进展，或改善一种或多种体征或症状。在一具体的实施方式中，调节指增加或减少角膜血管生成，例如，新血管的生长。在另一具体的实施方式中，调节指减少或抑制结构性形变的发展，或角膜的“形状丧失”。

根据本发明的实施方式，角膜血管生成的调节剂可通过例如减少或消除一个或多个新血管的生长而用于治疗或预防角膜血管生成，并且还可用于治疗或预防与体内血管生成相关的其他疾病。角膜扩张疾病的调节剂可用于治疗或预防角膜扩张疾病，诸如圆锥形角膜。

根据本发明的实施方式，当在式(I)芳香族化合物之前或式(I)芳香族化合物之后向所述眼睛施用测试化合物时，两次施用时间可间隔几分钟，几小时或几天，这取决于具体的测试化合物、其作用模式、其效果等。例如，可将测试化合物施用于一只眼睛，然后，24小时后可将式(I)芳香族化合物施用于两只眼睛。作为另一个实例，可将式(I)芳香族化合物施用于两只眼睛，然后可以在三周后当已经观察到角膜血管生成发生之后施用测试化合物。本领域的普通技术人员将能够根据预期的目的适当的设计筛选实验。

根据本发明的实施方式，鉴于本发明公开，可用本领域已知的方法确定测试化合物对调节角膜血管生成和/或圆锥形角膜的效果。例如，可通过视觉观察或组织学研究来确定效果。可通过用染色血管的染料处理角膜切片并且在显微镜下观察来进行组织学研究。可用于组织学研究的示例性染料为苏木精和曙红染料。

本发明还涉及一种鉴定对人类健康有害的物质的方法。根据本发明的实施方式，所述方法包括：

(i)将测试物质施用于非人动物的至少一只眼睛的角膜；和

(ii)确定所述测试物质对以下至少之一的影响：角膜中的血管生长和角膜的结构性形变。

诱发角膜血管生成或角膜扩张疾病(诸如圆锥形角膜)的化合物或材料可对人类健康有害。对“人类健康有害”的物质是有毒的，增加致死性疾病(如癌症)的发生率，或产生一些其他的不良生物学反应，诸如刺激、皮疹等。因此，通过根据本发明的方法筛选对角膜血管生成或角膜扩张疾病有影响的物质，可鉴定出对健康有害或对哺乳动物(诸如人类)造成显著健康风险的物质。

根据本发明的实施方式，鉴定有害于人类健康的物质的方法可用于筛选用于任何工业中的物质，包括，但不限于：食品工业、制药工业和电子工业。可筛选任何物质，诸如化合物、材料、溶剂等。根据本发明的实施方式，鉴于本公开，可使用本领域已知的任何方法将所述测试物质施用于非人动物眼睛的角膜，包括注射或表面局部施用，诸如通过滴剂或擦拭的方式。

不希望受任何理论的束缚，对于所观察的式(I)芳族化合物(诸如，苯和苯酚)对血管生长的效果的一种可能的解释总结如下。黑色素及其衍生物、类似物和变体在吸收电磁能(诸如光能)后将水分子裂解成氢和氧的固有能力先前已在美国专利8,455,145中有过报道。高水平的氧具有抗血管生成的效果也是已知的。据信，苯和苯酚可损害黑色素细胞(其是产生黑色素的细胞)的功能。除了其他地方，黑色素细胞还位于眼睛的中间层。通过削弱黑色素细胞的功能，显著降低了所产生的黑色素的量，从而也降低了黑色素所产生的氧的量，降低了氧的水平，促进了血管生成。在另一方面，据信，当黑色素更丰富时，更快和/或更容易地发生水分子的解离，导致更高的氧分压，从而降低血管生成的量。因此，据信，黑色素水平的降低刺激血管生成，并且黑色素水平的增加抑制或至少显著降低血管生成。

再次不希望受任何理论的束缚，提出假说认为，诱发角膜血管生成所需的式(I)芳香族化合物的量比诱发角膜扩张疾病所需的量更少，因为诱发角膜扩张疾病的发作需要更大程度的抑制黑色素的产生。相反，据信，较少抑制黑色素的产生足以造成角膜血管生成。该假说基于下述观察结果：与诱发圆锥角膜所需的式(I)芳族化合物的浓度相比，可以用较低浓度的式(I)芳族化合物诱发角膜血管生成，更多细节在下述实施例中讨论。

通过参考下述非限制性的实施例，来更好的理解本发明，然而，本领域技术人员应很容易理解，实施例只是用来描述本发明，而并不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1用苯酚制备的角膜血管生成和角膜扩张疾病的大鼠模型

角膜血管生成和圆锥形角膜的大鼠模型制备如下。通过混合苯酚和水从而制备浓度为0.1M、0.5M、1.0M、3.0M、5.6M或8.5M的苯酚水溶液，然后加热到100℃15分钟使溶液灭菌。之后，将10μL的无菌苯酚溶液表面局部施用于两月龄的威斯塔大鼠(Wistar rat)的右眼角膜中心。用每种测试的苯酚浓度处理5只大鼠。使得苯酚溶液吸收到眼睛中，并仅施用一次。由于眼睛具有其固有的保护机制，因此没有必要在施用结束时清洗眼睛。

在施用苯酚溶液之前，角膜中无可见的血管(图1A)。相反，看到的血管在眼睛的虹膜中。然而，用测试的所有浓度的苯酚溶液处理后，在施用苯酚水溶液一周后在每组的至少一只大鼠中，角膜中开始形成新的血管。施用3周后，在角膜中所观察到的新血管的量甚至更多(图1B，施用3M溶液)。所观察到的血管生长持续到第四个月。如图1B所示，巩膜角膜缘开始大量出现血管形成，并朝着角膜表面的中心扩展。除了新的角膜血管，没有观察到其他解剖或炎症变化。虹膜血管比长在角膜的血管更深，并且由瞳孔边界界定。在较高的所测试的苯酚浓度(3.0M、5.6M和8.5M)，在某些大鼠中还观察到与角膜扩张(尤其是圆锥形角膜)相关的变化。结果总结在如下表1中。

表1在大鼠中用苯酚制备角膜血管生成和圆锥形角膜的大鼠模型

施用苯酚8周后进行组织学研究。切除角膜，用苏木精和曙红染料对一片角膜上皮进行染色。如图1C所示，在角膜上皮的基膜下可见分化良好的血管(箭头2所指)。

上述表1所示的实验结果表明，直接施用于大鼠眼睛的苯酚诱发角膜血管生成，并且可通过向动物眼睛施用苯酚来制备角膜血管生成的动物模型。结果还表明，当施用较高浓度的苯酚时，也可诱发角膜扩张疾病。

实施例2用苯制备角膜血管生成的大鼠模型

角膜血管生成的大鼠模型制备如下。通过混合苯和水从而制备具有所需浓度(在3.0M和7.0M之间)的含水的苯组合物。然后加热到100℃对含水组合物灭菌15分钟。具体地，制得3.0M、4.0M、5.0M、6.0M或7.0M的含水的苯组合物。之后，将10μL的每个组合物表面局部施用于2到3月龄的威斯塔大鼠的右眼角膜中心。使得苯的含水组合物吸收到眼睛中，并仅施用一次。由于眼睛具有其固有的保护机制，因此没有必要在施用结束时清洗眼睛。

在施用苯之前，角膜中无可见的血管，并且大鼠角膜看起来与图1A所示的角膜类似。然而如图2所示，用所有浓度的苯处理后，早在施用15天后，角膜中开始形成新的血管。角膜中所观察到的新血管的量在施用3周后甚至更多。并且从最初施用苯开始，所观察到的新血管的生长持续了至少四个月，此时将取眼睛用于组织学研究。

实验结果表明，直接施用于大鼠眼睛的苯诱发角膜血管生成，并且可通过向动物眼睛施用苯来制备角膜血管生成的动物模型。结果还表明，最初施用较高浓度的苯时，施用15天内所观察到的新血管的量也增加了。因此，大鼠中新血管生长的量可取决于芳香族化合物的浓度，与较低浓度相比，较高浓度能够更快速地诱发角膜血管生成。结果进一步表明，在最初施用芳香族化合物后，所观察到的角膜血管生成的量随着时间而增加。

实施例3圆锥形角膜的大鼠模型

圆锥形角膜的大鼠模型制备如下。通过混合水和苯从而制备具有7.0M-8.5M浓度的含水的苯组合物。然后加热所述溶液到100℃，对所述组合物灭菌15分钟。通过微量移液，将含水的苯组合物(10μL)直接表面局部施用于威斯塔大鼠的一只眼睛的角膜中心。所述大鼠3个月大，并仅施用一次苯。

除了血管生成(即，新血管生长)，角膜组织的特征在于明显变薄，并向外突出(图3)。在施用苯的第一周内就开始出现所观察到的角膜的变化，从角膜透明度的变化开始，随后角膜周围新血管的生长(即，血管生成)，最后在施用第二周内角膜突出。该变化与非炎性的角膜扩张特别是圆锥形角膜相一致。

还需注意，当根据相同的步骤将10μL的9.0M的含水的苯组合物施用到威斯塔大鼠的眼睛时，圆锥形角膜如此严重以至于大鼠发生眼内炎(眼内感染)。

实验结果表明，将苯施用于大鼠的眼睛诱发圆锥形角膜，并且可通过将式(I)芳香族化合物施用于动物的眼睛来制备圆锥形角膜的动物模型。

实施例4筛选调节角膜血管生成和/或角膜扩张疾病的化合物

测试潜在的治疗剂(即测试化合物)对角膜血管生成和角膜扩张疾病的调节作用。制备式(I)芳香族化合物的水溶液，以滴眼剂的形式表面局部施用于啮齿动物两只眼睛的角膜。之后，将候选治疗剂的溶液表面局部施用于所述啮齿动物一只眼睛的角膜。观察所述啮齿动物的眼睛，将用候选治疗剂处理的眼睛与未处理的眼睛进行比较，从而确定所述测试化合物在调节角膜血管生成或角膜扩张疾病中的效果(如果有的话)。进行视觉观察和组织学研究来确定所述测试化合物的效果。

实施例5鉴定对人类健康有害的物质

测试潜在的有害物质和材料(即，测试物质)对诱发角膜血管生成和角膜扩张疾病的作用。将所述测试物质表面局部施用于所述啮齿动物一只眼睛的角膜。观察所述啮齿动物的眼睛，将用所述测试物质处理的眼睛与未处理的眼睛进行比较，从而确定所述测试物质在引发角膜血管生成或角膜扩张疾病中的作用(如果有的话)。进行视觉观察和组织学研究来确定所述测试物质的作用。将诱发角膜血管生成或角膜扩张疾病的测试物质鉴定为潜在对人类健康有害的物质。

本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的广义概念的基础上，可以对上述实施方式进行更改，因此，应理解，本发明不局限于公开的具体实施方式，而是旨在涵盖在本发明的精神和范围内的，由所附权利要求所限定的所有修改。

Claims (20)

1.一种制备角膜血管生成非人动物模型的方法，所述方法包括向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

其中，R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述施用的式(I)芳香族化合物的有效量为约1μmol－约70μmol。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(I)芳香族化合物为苯(n为0)或苯酚(R为羟基，且n为1)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人动物为啮齿动物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以水性媒介物的形式施用所述式(I)芳香族化合物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括向所述至少一只眼睛施用麻醉剂。

7.一种用权利要求1所述的方法制备的角膜血管生成非人动物模型，其特征在于，所述非人动物模型在角膜中基本没有纤维化。

8.一种制备角膜扩张疾病非人动物模型的方法，所述方法包括向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

其中，R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述施用的式(I)芳香族化合物的有效量为约30μmol－约85μmol。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述式(I)芳香族化合物为苯(n为0)或苯酚(R为羟基，且n为1)。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述非人动物为啮齿动物。

12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，以水性媒介物的形式施用所述式(I)芳香族化合物。

13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述角膜扩张疾病为圆锥形角膜。

14.一种用权利要求8所述的方法制备的角膜扩张疾病非人动物模型。

15.如权利要求14所述的非人动物模型，其特征在于，所述至少一只眼睛的角膜包括结构性形变，所述结构性形变的特征在于形状从圆形变为圆锥形。

16.一种筛选调节角膜血管生成或角膜扩张疾病的化合物的方法，所述方法包括：

(i)用下述方法制备角膜血管生成或角膜扩张疾病的非人动物模型，所述方法包括：向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用有效量的式(I)芳香族化合物：

(ii)向非人动物模型的所述至少一只眼睛施用测试化合物；和

(iii)确定所述测试化合物对以下至少之一的影响：角膜内的血管生长和角膜的结构性形变，

其中R选自下组：羟基、卤素、烷基、烷氧基、和氨基，并且n为0、1、2、3、4、5、或6。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在施用式(I)芳香族化合物之前、同时、或之后将所述测试化合物施用于所述的至少一只眼睛。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述式(I)芳香族化合物为苯(n为0)或苯酚(R为羟基，且n为1)。

19.一种鉴定对人类健康有害的物质的方法，所述方法包括：

(i)向非人动物的至少一只眼睛的角膜施用测试物质；和

(ii)确定所述测试物质对以下至少之一的影响：角膜内的血管生长和角膜的结构性形变。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述测试物质为用于选自下组的工业生产的化合物或材料：食品、制药和电子。