CN106675999A - 海洋comammox富集培养装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海洋comammox富集培养装置和方法。培养基供应桶通过反应器进水管连接圆柱形罐体的内腔；圆柱形罐体的内腔还通过反应器出水管连接废液桶；反应器进水管和反应器出水管均夹持于不同的蠕动泵中；液位传感器设置于圆柱形罐体内腔中，且高于反应器出水管末端高度；圆柱形罐体外壁上套有中空的控温夹套，控温夹套上设有控温夹套进水口和控温夹套出水口，控温夹套出水口、恒温水浴锅和控温夹套进水口通过管路连接形成循环回路。本发明填补了海洋comammox富集装置与方法上的空白，可用于选择性富集comammox。

Description

海洋comammox富集培养装置和方法
技术领域
本发明涉及一种模拟潮汐与培养条件梯度变化的comammox选择性富集培养装置和方法。
背景技术
硝化过程长期以来被认为必须要分两步进行，由原先的氨氧化细菌与亚硝酸盐氧化细菌的组合到最近的氨氧化细菌/古菌与亚硝酸盐氧化细菌的组合来完成整个硝化过程(et al.,2005)。尽管人们通过反应活化能的分析推测，单个微生物从氨氮到硝氮的全程硝化所获得的能量比其中的任意一步都大，理论上采用这一过程的全程硝化菌(complete ammonia oxidizer,comammox)比氨氧化细菌/古菌及亚硝酸盐氧化细菌更加具有竞争优势(Costa et al.,2006)，但是由于生长缓慢、原位富集程度低等原因，人们直到2015年才证实了comammox的存在，并认为comammox倾向于缓慢、基质输入受限的生长，生物量聚集在微生物絮体或生物膜的某一空间部位(Daims et al.,2015；van Kessel et al.,2015)。
目前已经富集的三株comammox都是Nitrospira属(Daims et al.,2015；vanKessel et al.,2015)，在海洋环境中Nitrospira属在海水和沉积物中都有检出(Watsonet al.,1986；Taylor et al.,2007)。通过对NCBI nr数据库的搜索，在海洋沉积物宏基因组中检测到了Nitrospira-like amoA，推测comammox在海洋环境中存在(van Kessel etal.,2015)。这是获得海洋comammox的接种物的基本依据。
Comammox的发现进一步丰富了氮循环的内容，comammox在生物地球化学循环中的作用亟待研究，获得comammox的富集物或纯培物成为研究的一个瓶颈。为获得海洋中的comammox，有必要设计模拟原位海洋环境的富集装置和培养条件，来选择性富集comammox。
发明内容
本发明的目的提供一种富集来自海洋的comammox，提供富集所需的培养装置和培养方法。所采用的具体技术方案如下:
海洋comammox富集培养装置，包括圆柱形罐体、控温夹套、恒温水浴锅、控温夹套进水口、控温夹套出水口、培养基供应桶、反应器进水管、液位传感器、反应器出水管和废液桶；培养基供应桶通过反应器进水管连接圆柱形罐体的内腔；圆柱形罐体的内腔还通过反应器出水管连接废液桶；反应器进水管和反应器出水管均夹持于不同的蠕动泵中；液位传感器设置于圆柱形罐体内腔中，且高于反应器出水管末端高度；圆柱形罐体外壁上套有中空的控温夹套，控温夹套上设有控温夹套进水口和控温夹套出水口，控温夹套出水口、恒温水浴锅和控温夹套进水口通过管路连接形成循环回路。
作为优选，还设有控制装置，控制装置分别连接液位传感器以及反应器进水管、反应器出水管上的蠕动泵。
作为优选，所述的控温夹套进水口设置于圆柱形罐体底部，所述的控温夹套出水口设置于圆柱形罐体顶部。
作为优选，所述的反应器出水管末端距离圆柱形罐体内腔底部的高度为10～20cm。将接种物在反应器内的高度设定为10cm的依据是氨氮在沉积物中的扩散能力，经过试验发现，氨氮在沉积物中24h内能够扩散的深度小于4cm，因此氨氮从最大值到0的梯度变化范围能在10cm范围内全部体现。考虑到长期运行氨氮可能会进一步向深层扩散，因此设定沉积物的深度在10-20cm，从而实现氨氮从最大值到0的梯度变化，而其中总有一层适合comammox生长。
作为优选，所述的液位传感器高于反应器出水管末端5～10cm。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述装置的海洋comammox富集培养方法，步骤如下：
向圆柱形罐体内加入含有comammox菌种的海洋潮间带沉积物后形成10～20cm的接种物沉淀区，接种物沉淀区高度与反应器出水管末端平齐；配置培养基并经过高压蒸汽灭菌后冷却，储备到培养基供应桶，由控制柜控制蠕动泵进行抽液，经过反应器进水管供应到培养基进水排水区；当培养基进水排水区的液面达到液位传感器的位置时，控制柜控制进水的蠕动泵停止工作，启动出水的蠕动泵将培养基进水排水区内的液体经过反应器出水管排出到废液桶；然后不断在进水和出水之间切换循环，模拟海洋的潮汐变化；富集培养过程中，培养基的水温度保持在20℃±0.1℃。恒温保持在20℃附近是为了将培养温度设定在海洋的四季温度变化范围内。
作为优选，进水时间和出水时间均持续12h，保持与常规的潮汐时间对应。
作为优选，培养基中以氨氮为氮源和能源，添加抗生素万古霉素和枯草杆菌抗生素，以人工海水来维持细胞渗透压和其它离子需求。
本发明填补了海洋comammox富集装置的空白，提供了一种简易的原位模拟海洋comammox富集装置，操作简单，可以定向选择富集comammox。
附图说明
图1是海洋comammox富集培养装置示意图。
图中：圆柱形罐体1、接种物沉淀区2、培养基进水排水区3、控温夹套4、恒温水浴锅5、控温夹套进水口6、控温夹套出水口7、控制柜8、培养基供应桶9、反应器进水管10、反应器出水管12、废液桶13。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步阐述。
如图1所示，一种海洋comammox富集培养装置，包括圆柱形罐体1、控温夹套4、恒温水浴锅5、控温夹套进水口6、控温夹套出水口7、控制装置8、培养基供应桶9、反应器进水管10、液位传感器11、反应器出水管12和废液桶13。培养基供应桶9通过反应器进水管10连接圆柱形罐体1的内腔。圆柱形罐体1的内腔还通过反应器出水管12连接废液桶13。反应器进水管10和反应器出水管12均夹持于不同的蠕动泵中，培养基供应桶9中事先存储配制好的培养基，当需要进水时，反应器进水管10上的蠕动泵开始工作，将培养基输送至培养基供应桶9中；当需要出水时，反应器出水管12上的蠕动泵开始工作，培养基供应桶9中的水重新抽取至废液桶13中。液位传感器11设置于圆柱形罐体1内腔中，且高于反应器出水管12末端高度。控制装置8分别连接液位传感器11以及反应器进水管10、反应器出水管12上的蠕动泵，根据液位传感器11的感应信号，反馈控制两个蠕动泵的运行状态。控制装置8可以采用控制柜或者单片机、PLC等，当采用控制柜时，可以将两个蠕动泵集成于控制柜中。
圆柱形罐体1内填充海洋潮间带沉积物后，开始进水，当液位升高至液位传感器11所处位置时，停止进水并启动出水。由此，圆柱形罐体1形成接种物沉淀区2和培养基进水排水区3。且为了模拟潮间带的潮汐水位变化，可以在一天内设置进水和出水的来回切换，较佳的是进水时间和出水时间均持续12h。而且由于接种物沉淀区2存在一定的高度，培养基中的氮源在12小时内不能扩散到最深处，从而形成一个从最高浓度到0的氨氮浓度梯度，使接种物沉淀区2中必然存在一个适合comammox菌生长的区域。
另外，comammox菌对于生长温度有要求，因此可以在圆柱形罐体1外壁上套有中空的控温夹套4。控温夹套4可以直接采用中空结构，其内壁与圆柱形罐体1接触一侧采用导热材料，也可以直接与圆柱形罐体1一体成型，两者之间预留出用于通水的空腔。控温夹套4上设有控温夹套进水口6和控温夹套出水口7，控温夹套出水口7、恒温水浴锅5和控温夹套进水口6通过管路连接形成循环回路。控温夹套进水口6设置于圆柱形罐体1底部，所述的控温夹套出水口7设置于圆柱形罐体1顶部。反应器出水管12末端距离圆柱形罐体1内腔底部的高度为10～20cm。液位传感器11高于反应器出水管12末端5～10cm。
利用上述装置的海洋comammox富集培养方法，步骤如下：
向圆柱形罐体1内加入含有comammox菌种的海洋潮间带沉积物后形成10～20cm的接种物沉淀区2，接种物沉淀区2高度与反应器出水管12末端平齐。配置好的培养基经过高压蒸汽灭菌后冷却，储备到培养基供应桶9，由控制柜8控制蠕动泵进行抽液，经过反应器进水管10供应到培养基进水排水区3；当培养基进水排水区3的液面达到液位传感器11的位置时，控制柜8控制进水的蠕动泵停止工作，启动出水的蠕动泵将培养基进水排水区3内的液体经过反应器出水管12排出到废液桶13；然后不断在进水和出水之间切换循环，模拟海洋的潮汐变化；富集培养过程中，培养基的水温度保持在20℃±0.1℃。
另外，初始时调试进水蠕动泵流量使12h内反应器内液位从0(以接种物沉淀区2上表面开始计)达到液位传感器11，并使出水蠕动泵流量略大于进水蠕动泵流量，使出水时间保持在11-12h。当培养基进水排水区3液位达到液位传感器11触发进水蠕动泵停止12h后，控制装置8内的控制电路重新启动进水蠕动泵并停止出水蠕动泵的运行。由此，能够保证反应器在长期运行过程中模拟海洋潮汐变化过程并防止由于每个进出水周期下进水略多于出水而导致反应器积水或进出水时长紊乱。
培养基可以根据实际需要进行配置。本发明中提供一种优选的配置，具体为以氨氮为氮源和能源，并添加抗生素万古霉素(50mg l-1)和枯草杆菌抗生素(50mg l-1)，以人工海水来维持细胞渗透压和其它离子需求。培养基的具体培养如下：NH4Cl,53.5mg l-1；NaHCO3,100mg l-1；NaCl,26g l-1；MgCl2·6H2O,3g l-1；MgSO4·7H2O,3g l-1；CaCl2,0.5g l-1；KBr,0.2g l-1；Na2HPO4,0.05g l-1；微量元素Ⅰ,1ml l-1；微量元素Ⅱ,1ml l-1；用NaOH溶液调pH到7.0-7.2；
该培养基设定较低的氨氮浓度(相对于氨氧化细菌而言)，使comammox更具有竞争优势。同时，添加的两种抗生素对杂菌具有一定的去除作用，有利于加强comammox的定向选择。

Claims (8)

1.一种海洋comammox富集培养装置，其特征在于，包括圆柱形罐体(1)、控温夹套(4)、恒温水浴锅(5)、控温夹套进水口(6)、控温夹套出水口(7)、培养基供应桶(9)、反应器进水管(10)、液位传感器(11)、反应器出水管(12)和废液桶(13)；培养基供应桶(9)通过反应器进水管(10)连接圆柱形罐体(1)的内腔；圆柱形罐体(1)的内腔还通过反应器出水管(12)连接废液桶(13)；反应器进水管(10)和反应器出水管(12)均夹持于不同的蠕动泵中；液位传感器(11)设置于圆柱形罐体(1)内腔中，且高于反应器出水管(12)末端高度；圆柱形罐体(1)外壁上套有中空的控温夹套(4)，控温夹套(4)上设有控温夹套进水口(6)和控温夹套出水口(7)，控温夹套出水口(7)、恒温水浴锅(5)和控温夹套进水口(6)通过管路连接形成循环回路。
2.如权利要求1所述的海洋comammox富集培养装置，其特征在于，还设有控制装置(8)，控制装置(8)分别连接液位传感器(11)以及反应器进水管(10)、反应器出水管(12)上的蠕动泵。
3.如权利要求1所述的海洋comammox富集培养装置，其特征在于，所述的控温夹套进水口(6)设置于圆柱形罐体(1)底部，所述的控温夹套出水口(7)设置于圆柱形罐体(1)顶部。
4.如权利要求1所述的海洋comammox富集培养装置，其特征在于，所述的反应器出水管(12)末端距离圆柱形罐体(1)内腔底部的高度为10～20cm。
5.如权利要求1所述的海洋comammox富集培养装置，其特征在于，所述的液位传感器(11)高于反应器出水管(12)末端5～10cm。
6.一种利用权利要求1所述装置的海洋comammox富集培养方法，其特征在于，步骤如下：
向圆柱形罐体(1)内加入含有comammox菌种的海洋潮间带沉积物后形成10～20cm的接种物沉淀区(2)，接种物沉淀区(2)高度与反应器出水管(12)末端平齐；配置培养基并经过高压蒸汽灭菌后冷却，储备到培养基供应桶(9)，由控制柜(8)控制蠕动泵进行抽液，经过反应器进水管(10)供应到培养基进水排水区(3)；当培养基进水排水区(3)的液面达到液位传感器(11)的位置时，控制柜(8)控制进水的蠕动泵停止工作，启动出水的蠕动泵将培养基进水排水区(3)内的液体经过反应器出水管(12)排出到废液桶(13)；然后不断在进水和出水之间切换循环，模拟海洋的潮汐变化；富集培养过程中，培养基的水温度保持在20℃±0.1℃。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，进水时间和出水时间均持续12h。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，培养基中以氨氮为氮源和能源，添加抗生素万古霉素和枯草杆菌抗生素，以人工海水来维持细胞渗透压和其它离子需求。
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