CN106661544A - 用于牲畜生产系统的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于保护免于肠细菌感染的活疫苗。

Description

用于牲畜生产系统的疫苗
发明领域
本发明涉及用于保护免于肠细菌感染的活疫苗。
发明背景
说明书中对任何现有技术的引用并非是承认或表明了本技术形成任何管辖区中公知常识的一部分或本技术可合理地预期被本领域的技术人员所理解、被认为是相关的，和/或与现有技术的其他部分进行组合。
非伤寒沙门氏菌(Nontyphoidal Salmonella)是美国最大的食源性疾病负担，其导致最多的感染、住院和死亡，具有每年报告的103万例疾病。与疾病相关的经济负担是惊人的，而仅医疗开销就达到每年110亿美元，且通过食品工业(召回、诉讼、降低消费者信心)和通过州、地方和联邦公共卫生机构响应NTS爆发产生大量额外费用。在全球范围，非伤寒沙门氏菌估计为9,380万例且每年死亡15.5万，并已经成为撒哈拉以南的非洲(sub-Saharan Africa)中菌血症的主要原因，其中其致死率达到多至25％。
随着抗生素的长期施用已经导致在世界范围内传播的多药抗性菌株的出现，与沙门氏菌相关的健康和经济负担可能会恶化；例如，鼠伤寒沙门氏菌DT104在过去二十年已引起了数起食源性疾病爆发，并且对兽药中五种最常用的抗生素中的四种(四环素、β-内酰胺、氨基糖苷和磺酰胺)有抗性。这些多药抗性菌株常常与更多的住院和菌血症相关，并且它们在自然中的维持可以通常在包括地下水的环境中发现的非常低的抗生素浓度发生。此外，在2009年从患者中分离出了一种新类型的碳青霉烯抗性肠杆菌科，其对于β-内酰胺、氟喹诺酮类和氨基糖苷类有抗性，并且这种抗性现在表现出在革兰氏阴性病原体(包括沙门氏菌)中的广泛分布。此外，最近(2012)从源自牲畜的天然微生物群体中已分离出“超毒力(hypervirulent)”沙门氏菌。这些超毒力菌株的毒力是大多数临床分离株的100倍，更易杀死免疫接种的动物，且由于离体快速转变为较低毒力状态以致在标准实验室测试条件下检测不到。总之，这些发现支持这样的观点，即沙门氏菌疾病负担随着更具毒力的多药抗性菌株的潜在出现而将恶化，所述菌株难以使用目前可获得的抗生素加以控制。
肠沙门氏菌(Salmonella enterica)经由粪-口途径获得且包含6个亚种，其基于糖、脂多糖(LPS)和鞭毛组成细分为超过2500个血清型(血清学变体)，其中肠亚种包含超过99％的人致病性分离株。肠沙门氏菌感染可导致任何下述四种不同的疾病综合征：小肠结肠炎/腹泻、菌血症、肠(伤寒)发热和慢性无症状携带。多种血清型感染人和动物两者，且疾病的严重性是血清型、菌株毒力和宿主易感性的函数。
对牲畜中的沙门氏菌属控制的努力由于下述原因持续性存在问题：1)大多数牲畜感染是亚临床的；2)疾病爆发是零星的且经常由特定血清型引起，尽管许多血清型是牲畜生产系统特有的；3)环境持续性为牲畜感染提供了持续性的储存；4)最近出现了更具毒力和可以杀死接种动物的菌株变体；5)一些源自人沙门氏菌病患者的菌株与动物来源的那些不同；和6)管理和环境事件可增加病原体暴露和/或损害宿主免疫力。
接种代表任何食品安全计划的可持续性方法，其在食品生产链的开始减少病原体暴露[1]。然而，由常规疫苗赋予的免疫力受限于狭窄范围的密切相关菌株，并且农场上(on-farm)的控制需要开发引发针对多种病原性血清型的保护的疫苗[1]。最近的进展已经导致修饰的活沙门氏菌属交叉保护疫苗的开发，其中许多包含有利于抗原生产的全球调节网络中的突变；并且也适合于异源抗原的表达[2-6]。交叉保护疫苗效力的分子基础尚未完全清楚。相关参数可包括：病原性血清型中共享的多个抗原的表达；减少的疫苗诱导的免疫抑制；靶向去除免疫显性抗原以暴露交叉保护表位；重组抗原的III型分泌；和/或用于免疫响应的增强刺激的延迟疫苗减毒([1,3,7,8]中进行了综述)。
在基因中携带功能缺失突变的修饰的活减毒肠沙门氏菌鼠伤寒血清型可用于提供针对沙门氏菌的多样性的保护。可考虑用于提供可应用的功能缺失突变的基因座的数目是庞大的，如在每个基因座可应用的突变数目般。用于提供功能缺失的基因座的一些实例包括涉及细菌的粘附、侵入和细胞内和细胞外存活的基因座(包括编码参与代谢过程的蛋白的多种基因)。编码DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)的基因的一些突变能够引起针对沙门氏菌的多样性的保护。当作为修饰的活疫苗在小鼠[2,9]、家禽[10,11]、绵羊[12]和小牛[13-15]中应用时，这些看起来被充分耐受。免疫力的诱导是快速的，且疫苗可以低成本和牲畜群体的低应激免疫以经由饮用水的递送施用[12,16]。
任何疫苗的商业成功取决于治疗指数、安全性/毒力的比率，且安全性对于具有回复至升高毒力的潜力的修饰的活疫苗是特别关注的。一般而言，疫苗应满足4个安全类别才能被考虑作为牲畜生产系统中商业用途的候选。相关的安全性表型如下：减少的i)疫苗脱落；ii)激发株脱落；iii)在全身组织(肝/脾)中的持续性；和iv)在环境中的持续性。
理解的是在提供包含功能缺失突变的减毒株中，重要的是由相关突变产生的改进的安全性概貌就其提供的保护而言不减少疫苗效力。最终，寻找的是其不减少免疫的个体中低水平感染的持续性且当病原体从免疫动物脱落并释放到环境中时不增加免疫原在环境中的持续性的突变。
难以预测哪些功能缺失突变在减毒中比其他更有效，特别是考虑到与每个基因座和突变相关的效力和回复到病原性的数据产生自不同的实验室系统。
另一复杂性是希望选择多于一个基因座用于突变，使得在至少一种功能缺失突变丢失时防止回复到病原性表型。这样的方法需要组合来自大量候选基因座的至少2个基因座，然而对于特定组合是否可能增加或减少回复的可能性或可能增加或降低所得的减毒疫苗的效力仍仅有有限指导。
对于用于保护针对沙门氏菌属感染的减毒活疫苗存在需要。
对于具有改进的安全性表型的用于保护针对沙门氏菌属感染的减毒活疫苗也存在需求。
对于具有有限的或没有从动物脱落的倾向、当从动物脱落时在环境中具有最小持续性，且在动物中保持可接受水平的持续性以引起免疫力的减毒活疫苗存在需求。
发明概述
本发明寻求改善或解决上述一个或多个问题、限制或需要，且在一个实施方案中提供了肠细菌，其包含：
-编码DNA腺嘌呤甲基化酶的基因(本文称为dam)中的第一功能缺失突变和
-选自下组的基因中的第二功能缺失突变：sifA、spvB和mgtC。
在另一实施方案中提供了疫苗，其包含：
-如上文所述的肠细菌；和
-载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂。
在另一实施方案中提供了预防或治疗细菌性肠疾病或病况的方法，其包括下述步骤：将如上文所述的疫苗提供给其待预防或治疗细菌性肠疾病或病况的个体。
在另一实施方案中提供了用于产生适用于预防或治疗细菌性肠疾病或病况的疫苗的免疫原集合的方法，其包括：
-提供具有dam中的功能缺失突变的肠细菌，
-将功能缺失突变引入选自下组的细菌基因：sifA、spvB和mgtC。
在另一实施方案中提供了用于产生适用于预防或治疗细菌性肠疾病或病况的疫苗的免疫原集合的方法，其包括：
-提供具有选自下组的功能缺失突变的肠细菌：sifA、spvB和mgtC，
-将功能缺失突变引入所述细菌的dam基因。
附图简述
图1.评估用于菌落化的沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物和在粘膜和全身组织中的持续性。用鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物(dam aroA[MT3138],damhtrA[MT3142],dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spiC[MT3154],dam spvB[MT3158],dam ssaV[MT3162])或亲本UK-1damΔ232疫苗株(MT3134)(109CFU)口服免疫BALB/c小鼠。在口服免疫后第2周(A)和第4周(B)，评估了从派尔集合淋巴结(Peyer’spatches，PP)、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN)、肝(L)和脾(S)回收的细菌在LB培养基上的集落形成单位(CFU)。检测限制：PP、MLN、脾<100CFU；肝<50CFU。
图2.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的同源菌株效力评估。用鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物(dam aroA[MT3138],dam htrA[MT3142],dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spiC[MT3154],dam spvB[MT3158],dam ssaV[MT3162])或亲本UK-1 damΔ232疫苗株(MT3134)(109CFU)口服免疫BALB/c小鼠。免疫后11周，用200LD50口服剂量的同源菌株、野生型鼠伤寒沙门氏菌UK-1(χ3761)激发接种的小鼠。未免疫的对照小鼠在感染后第21天全部死亡。毒力激发存活的小鼠比例的差异使用逻辑回归分析(Genstat第15版[34])。接种提供显著的保护(P<0.01)。相比亲本dam疫苗，通过将并入次级缺失mgtC、sifA和spvB的dam疫苗提供了相似的保护。引入次级缺失aroA、htrA、spiC和ssaV后观察到dam疫苗效力的显著减少(**P<0.01；***P<0.001)。
图3.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的异源交叉保护效力评估。用鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物(dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spvB[MT3158]；109CFU)口服免疫BALB/c小鼠(16-25只每窝)。免疫后11周，用100LD50口服剂量的与畜牧业临床相关的异源沙门氏菌属血清型(都柏林沙门氏菌8895[牛]、病牛沙门氏菌225[羊]、鼠伤寒沙门氏菌131[羊])激发接种的小鼠。未免疫的对照小鼠在感染后第21天全部死亡。毒力激发存活的小鼠比例的差异使用逻辑回归分析(Genstat第15版[34])。用并入了次级缺失mgtC、sifA和spvB的每种dam疫苗的接种提供了针对所评估的同源和异源激发株的显著保护(***P<0.001)。
图4.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物中疫苗安全性评估(回复至2-AP抗性)。用105CFU的鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物(dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spvB[MT3158])或dam UK-1亲本疫苗株[MT3134]腹膜内感染BALB/c小鼠。在感染后第5天计数了脾(A)或肝(B)中2-AP敏感(开放框)或2-AP抗性(封闭框)沙门氏菌属生物的数目。0CFU值表示其中脾和肝中的细菌载荷低于检测限(<25CFU)的小鼠数目。鼠伤寒沙门氏菌UK-1 dam双突变疫苗的持续性(2-APs)和回复至提高毒力(2-APr)相比亲本沙门氏菌属damΔ232疫苗株的统计学显著性使用方差分析确定(*P<0.05)。
图5.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的疫苗粪便脱落评估。
将鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物dam mgtC(MT3183)、damsifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1亲本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物用于通过口服途径接种BALB/c小鼠(109CFU)。在免疫后第2、4、7、11、14和21天从个体小鼠收集粪便并铺板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。使用REML重复测量分析对沙门氏菌属dam双缺失疫苗候选物对亲本沙门氏菌属damΔ232疫苗株的粪便脱落进行了分析。免疫后疫苗和时间都是显著的(*P<0.05)。不同双缺失dam疫苗之间未观察到粪便脱落的显著差异。给出的值是接种后小鼠粪便中CFU/g的模型预测平均数。检测的极限是60CFU。
图6.使用沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物免疫的小鼠中激发株的粪便脱落。将鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1亲本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物用于通过口服途径免疫BALB/c小鼠(109CFU)。免疫后四周实现疫苗菌株粪便清除。免疫后11周，使用100LD50剂量的野生型鼠伤寒沙门氏菌UK-1(MT2315；107CFU)的卡那霉素抗性衍生物激发接种的小鼠。在免疫后第2、4、7、11、14和21天从个体小鼠收集粪便并铺板用于在卡那霉素50μg/mlLB平板上的CFU/g。使用REML重复测量分析对激发免疫小鼠后野生型激发株的粪便脱落进行了分析。免疫后疫苗和时间都是显著的(*P<0.05)且存在时间和疫苗之间显著相互作用的趋势(P＝0.075)。逐对比较揭示了毒力激发后在不同时间组间的显著差异；a＝双缺失疫苗的脱落显著小于亲本dam疫苗的脱落；b＝dam sifA和dam spvB疫苗的脱落小于亲本dam疫苗的脱落且dam sifA脱落显著少于dam mgtC和dam spvB疫苗的脱落；c＝dam sifA和damspvB疫苗的脱落显著少于dam mgtC和dam spvB疫苗的脱落且dam spvB疫苗的脱落显著少于dam mgtC疫苗的脱落；d＝dam sifA、dam spvB和dam mgtC疫苗的脱落显著少于dam spvB疫苗的脱落。给出的值是激发后粪便中野生型激发株的模型预测的平均CFU。检测限是60CFU。
图7.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的环境疫苗持续性(去离子水)评估。
将鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物dam mgtC(MT3183)、damsifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1亲本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物用于接种20ml的去离子水(104CFU/ml)。在具有松顶帽的50ml锥形管中在室温实施一式三份测定。将样品涡旋并在两周期间在所示时间点铺板用于CFU/ml。给出的值是具有误差棒的平均CFU/ml，指示±平均值的标准误(SEM)。使用REML重复测量分析对随时间水中存在的CFU/ml数目进行了分析。观察到疫苗组和时间之间显著的相互作用(P<0.001)。逐对比较揭示了在不同时间组之间的显著差异(P<0.05)。a＝全部疫苗具有比亲本UK-1野生型株低的CFU/ml；b＝damΔ232株的CFU/ml显著少于dam mgtC、dam sifA和dam spvB株的CFU/ml；c＝damΔ232和dam spvB株的CFU/ml显著少于dam sifA和dam mgtC株。
图8.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的环境疫苗持续性(绵羊粪便)评估。通过添加20ml的去离子水至5g干绵羊粪便(来自Barbara Byrne,University of California,Davis的礼物；[32,33])生成20％的粪便干物质。使用鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)或dam UK-1亲本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物接种20％粪便干物质(104CFU/ml)。在具有松顶帽的50ml锥形管中在室温实施一式三份测定。涡旋样品并在两周期间在所示时间点铺板用于CFU/ml。给出的值是具有误差棒的平均CFU/ml，表明±平均值的标准误(SEM)。使用REML重复测量分析对随时间粪便中存在的CFU/ml数目进行了分析。观察到疫苗组和时间之间显著的相互作用(P<0.001)。逐对比较揭示了在不同时间组之间的显著差异(P<0.05)。除第1天和第6天在全部时间点全部疫苗株的CFU/ml小于亲本UK-1野生型。a＝dam sifA显著少于dam、dam mgtC和dam spvB；b＝dam sifA显著少于dam和dam mgtC；c＝dam sifA显著少于dam mgtC；d＝dam spvB显著少于dam mgtC；e＝dam spvB显著少于dam；f＝dam mgtC显著少于dam。
实施方案的详述
如上文所述，肠细菌疾病例如胃肠炎和以腹泻、发热和脱水为特征的其它病况仍为畜牧生产中的主要问题。沙门氏菌属感染和沙门氏菌病为核心问题。至今，牲畜动物中预防或治疗这些病况的所有尝试仅获得了有限的成功，这是由于疫苗的所包含的/受损的或有限的效价或包含的/受损的安全性概貌。特别引起关注的是从动物脱落并保持在环境中的疫苗。
激发已提供足够稳固的减毒细菌以便能够在牲畜动物中保持，由此提供免疫性，并在粪便和更一般的环境(如饲养场或畜牧生产链的其他部分)中具有有限的脱落和持续的潜力。提供双突变以预防回复至病原性表型的需要是额外的复杂性水平，特别是在已知非常大量的用于失活的候选基因的情况下。
本发明的发明人有兴趣提供作为活免疫原有用的具有改进的安全性概貌或表型的肠细菌(例如在减毒活疫苗中)，只要其具有更少回复至致病性表型的可能性、更少脱落的可能性和更少在环境中保持的可能性。从广泛的潜在候选基因座列表中，本发明的发明人已鉴定了3个基因座，其可用于在dam失活菌株中引入功能缺失突变以提供具有合意的安全性概貌的减毒微生物，同时保持治疗或保护免于宽范围的肠细菌且特别是广泛的沙门氏菌属的效力。
A.定义
‘功能缺失突变’一般指完全或部分失活基因在给定生物过程中的相关功能的基因突变。感兴趣的具体功能缺失突变是中断宿主中肠细菌生命周期，同时不中断细菌的免疫原性概貌的那些。
‘肠细菌’一般指肠或肠道的细菌。特别感兴趣的是‘肠杆菌科(Enterobacteriaceae)’，其为包括病原体如沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)和志贺氏菌属(Shigella)的革兰氏阴性肠细菌的大家族。此家族中其他导致疾病的细菌包括变形菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。
‘沙门氏菌属’是肠杆菌科的肠细菌。
‘dam’指编码DNA腺嘌呤甲基化酶的基因，也称为脱氧腺苷甲基化酶，DNA腺嘌呤甲基转移酶或脱氧腺苷甲基转移酶。鼠伤寒沙门氏菌dam基因登录号的实例为NCBI登录号：1255007。该基因的基因座标签是STM3484。
‘sifA’指编码分泌的效应蛋白SifA的基因。鼠伤寒沙门氏菌sifA基因的登录号的实例为NCBI登录号1252742。该基因的基因座标签是STM 1224。
‘spvB’指编码沙门氏菌属质粒毒力蛋白B(SpvB)的基因。鼠伤寒沙门氏菌spvB基因登录号的实例为NCBI登录号1256199。该基因的基因座标签为PSLT039。
‘mgtC’指编码Mg(2+)转运ATP酶蛋白C，MgtC的基因。鼠伤寒沙门氏菌mgtC基因登录号的实例为NCBI登录号1255288。该基因的基因座标签为STM3764。
‘减毒的’例如在‘减毒细菌’中一般指减少细菌毒力但仍使其保持活力(或"活着")使得其能够复制的细菌的修饰(尽管以较慢的速率或在不同的条件下)。减毒需要感染剂并将其改变使得其变为无害或较少毒力。通常，减毒基本上不减少相关细菌的免疫原性。
‘疫苗’一般指包含免疫原(即能够引起免疫响应的物质)的组合物。通常疫苗暴露至病原体时可用于免疫、预防或提供保护免于感染或表现相关症状，特别是其中暴露为激发形式的情况中。疫苗可用于预防或治疗病况。疫苗可用于最小化以病原体感染的可能性。
‘细菌肠疾病或病况’一般指由以肠细菌感染个体产生的病况。这样的病况可包括下述症状：胃炎、脱水、腹泻、发热。沙门氏菌病是细菌肠疾病或病况的一个实例。
如本文使用的‘免疫’一般指通过其受试者的免疫系统针对免疫原被强化的过程。本发明减毒的沙门氏菌属微生物可用于免疫受试者抵抗沙门氏菌属并由此预防其他以更具毒力的沙门氏菌属血清型的感染。
如本文使用的‘基因’指编码序列和其调节序列如启动子和终止信号。
‘包含(comprise)’和该术语的变型如‘包含(comprising)’、‘包含(comprises)’和‘包含(comprised)’并非意在排除其他添加剂、组分、整数或步骤。
本发明的发明人已发现沙门氏菌属基因中功能缺失突变的特定组合在沙门氏菌属的活的减毒株的产生中提供特别的优势，其作为活疫苗可用于赋予对于以沙门氏菌属的毒力或致病性血清型的感染的免疫力。
具体而言，本发明的发明人已发现在还具有dam基因中的功能缺失突变的沙门氏菌属菌株中的sifA、spvB或mgtC基因中引入突变导致可安全施用至受试者的微生物的生成，其在环境中安全并维持赋予对沙门氏菌属的异源致病性血清型的保护的能力。
本发明因此提供活的减毒沙门氏菌属微生物，其中所述微生物在dam基因中包含功能缺失突变和在选自下组的基因中的至少一个其他功能缺失突变：sifA、spvB和mgtC。
在特别优选的实施方案中，根据本发明的微生物具有dam中的功能缺失突变和sifA中的另一功能缺失突变。在该实施方案中，微生物或肠细菌可不具有spvB或mgtC中的功能缺失突变。
本发明的减毒沙门氏菌属微生物可通过已知技术制备，例如通过缺失诱变、插入失活或靶基因中一个或多个核苷酸的取代。本领域的技术人员会理解的是假如天然基因产物的表达以某些方式被破坏，则靶基因不必需是突变的。例如，突变可在靶基因上游进行，例如在启动子或调节区中。
在一个实施方案中，工程化入dam、sifA、mgtC和spvB基因中的功能缺失突变是框内缺失。使用框内缺失以维持下游基因的转录。
其他合适的技术包括自杀载体的使用，其包含突变的基因和选择性标记。将自杀载体通过偶联引入携带野生型基因序列(尽管如本领域的技术人员所理解，在可选的基因座可包含一个或多个突变)的沙门氏菌属微生物。用突变的基因经由同源重组替换野生型基因，并使用选择性标记鉴定突变的微生物。其他合适的技术描述于例如WO 1996/17951中。
本领域的技术人员还会容易地确定引入的突变是否已导致功能缺失或基因功能是否受损。例如，mgtC基因对于具有低镁浓度的环境中的沙门氏菌属的存活是必须的。
引入dam基因和sifA、spvB或mgtC基因任一者中的功能缺失突变可有效产生微生物的减毒。
优选地，微生物是肠细菌，且特别是致病性肠细菌，如肠杆菌科的成员。
最优选地，微生物是沙门氏菌属。本领域的技术人员会理解的是，通常为毒力或致病性的任何数目的沙门氏菌属血清型可使用上述技术处理以生成活的减毒株。例如，沙门氏菌属微生物可来自多种肠沙门氏菌肠亚种血清型，包括但不限于血清型鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、都柏林沙门氏菌(S.Dublin)、纽波特沙门氏菌(S.Newport)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)或病牛沙门氏菌(S.Bovismorbificans)。在一个特别优选的实施方案中，将功能缺失突变引入鼠伤寒沙门氏菌微生物。
在另一优选的实施方案中，减毒的活微生物是在dam和sifA基因中都具有功能缺失突变的鼠伤寒沙门氏菌。
本发明的发明人已发现本发明的微生物特别适于用作用于免疫受试者抵抗沙门氏菌属的毒力血清型并最小化以毒力血清型感染的可能性的疫苗。具体而言，本发明的发明人已发现相比在其他基因组合中具有功能缺失突变的沙门氏菌属，在dam基因中以及在sifA、spvB或mgtC基因的任一者中具有突变的沙门氏菌属在要免疫的受试者中和在环境中呈现改进的疫苗安全性。
因此，另一方面，本发明提供用于在受试者中诱导对肠细菌(优选致病性细菌如沙门氏菌属)的免疫响应的疫苗组合物。疫苗组合物包含足以在受试者中引起免疫响应的量的活的减毒沙门氏菌属微生物和适当的载剂或稀释剂，其中所述活的减毒微生物包含在dam基因中的功能缺失突变和在选自下组的基因中的至少一个其他功能缺失突变：sifA、spvB和mgtC。
在一个特别优选的实施方案中，疫苗组合物包含一定量的活的减毒沙门氏菌属，其在dam和sifA基因中都包含功能缺失突变。
为配制疫苗组合物，减毒的微生物可在组合物中与任何适当的赋形剂一起存在。例如，组合物可包含任何适当的佐剂。此外，组合物可适应多种施用方式。优选的施用途径包括口服、粘膜(例如鼻)或全身途径(例如胃肠外注射)且所述疫苗为活的减毒沙门氏菌属微生物。在一个特定的实施方案中，可提供疫苗组合物用于包含在将被递送于受试者的饮用水或食物或饲养场中。
存在于疫苗组合物中的减毒微生物的数目可取决于疫苗组合物的预期施用途径和最终其将被递送的受试者由本领域的技术人员容易地确定。
在疫苗组合物中采用的特别合适的载剂或稀释剂对本发明并非是关键的且为本领域常规的那些。稀释剂的实例包括：用于缓冲抵抗胃中的胃酸的缓冲液，如包含蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0)、仅有碳酸氢盐的缓冲液(pH 7.0)或包含抗坏血酸、乳糖和任选的阿斯巴甜的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)。载剂的实例包括：蛋白，例如，如在脱脂乳中发现的；糖，例如蔗糖；或聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的发明人已发现将本发明减毒微生物或包含该微生物的疫苗组合物施用至受试者赋予受试者对于以野生型或致病性血清型后续感染的抗性。
因此，另一方面，本发明提供预防以沙门氏菌属的毒力株感染的方法，所述方法包括：
-向对其有需要的受试者施用：
-一定量的活的减毒沙门氏菌属微生物，其中所述微生物包含dam基因中的功能缺失突变和选自下组的基因中的至少一个其他功能缺失突变：sifA、spvB和mgtC，或
-疫苗组合物，其包含活的减毒沙门氏菌属微生物和合适的载剂或稀释剂，其中所述活的减毒微生物包含dam基因中的功能缺失突变和选自下组的基因中的至少一个其他功能缺失突变：sifA、spvB和mgtC。
-其中施用的微生物或疫苗的量足以在受试者中引起免疫响应。
可以理解的是在以沙门氏菌属的毒力株感染的预防中，本发明还提供免疫受试者抵抗沙门氏菌属的毒力血清型的感染的方法。
本发明的减毒微生物和包含该微生物的疫苗组合物适于免疫受试者抵抗通常导致沙门氏菌病的沙门氏菌属的毒力和致病性血清型的感染。本发明的减毒微生物和包含所述微生物的疫苗组合物特别适于免疫任何对沙门氏菌属微生物感染易感的动物。例如，在一些实施方案中，可被免疫的受试者可为人。可替换地，待免疫的受试者可为兽医种类和牲畜。依据本发明的待免疫的受试者的实例包括猪、绵羊、小牛、牛、鹿、山羊、骆驼、马、鸡、火鸡、鸭、鹌鹑等。
减毒的沙门氏菌属微生物或疫苗的量或数目可由本领域的技术人员容易地确定。一般而言，施用约102cfu至约1010cfu，优选约105至约1010cfu的微生物。免疫剂量根据施用途径变化。本领域的技术人员将理解的是胃肠外施用的疫苗的有效剂量(例如通过静脉内、腹膜内或皮下注射)可能小于口服施用(例如在饮用水中或在食物中)的相似疫苗。
如本文使用的‘免疫的量’意为能够在接受减毒微生物或包含所述微生物的疫苗的受试者中诱导保护性免疫响应的量。免疫响应可为体液的、粘膜的、局部的和/或细胞的免疫响应。此外，如本领域的技术人员会理解的，所需减毒微生物或疫苗的量还会取决于与待免疫的受试者相关的年龄、体重和其他因素。
本领域的技术人员会理解的是为产生足够数目的本文所述的活减毒微生物，在适当的环境中培养所述微生物可为必需的。例如，取决于微生物的意欲施用途径，在需氧或厌氧条件下培养所述微生物可为必需的。本领域的技术人员将容易地能够确定相关的培养条件。此外，一旦培养物中已产生足够数目的微生物(例如，一旦微生物已达到对数期生长)，理想的是纯化培养物以去除并非意欲包含于微生物下游使用的生长培养基的任何元素。
因此，在一个实施方案中，本发明提供如上文所述的活的减毒沙门氏菌属微生物的纯化的培养物。
可纯化包含活的减毒沙门氏菌属微生物的培养物从而其可在下游应用中使用，包括用作疫苗或用于制造疫苗组合物以在受试者中诱导对沙门氏菌属微生物的免疫响应。
可以理解的是取决于培养物的意欲下游应用，可冷冻干燥、冷冻或重构纯化的培养物。
之前段落中所述的本发明的另外的方面和所述方面的另外的实施方案将从通过实施例方式给出的下述说明并参照附图而变得显而易见。
可理解的是，在本说明书中公开和定义的本发明延伸到从文本或附图提及或显而易见的两个或多个单独特征的所有可替换的组合。所有这些不同的组合构成本发明多种可替换的方面。此说明书中引用的全部的专利、专利申请和出版物通过提述以其整体并入本文，其程度如同具体而单独地指示各独立的专利申请或出版物以通过提述并入。
实施例
1.材料和方法
1.1.细菌菌株和生长条件
沙门氏菌属动物分离株源自不同疫情、个体病例或至诊断实验室的监督提交[31]。毒力鼠伤寒沙门氏菌UK-1在全部用于比较的研究中使用[17]。除非另外详明，细菌源自含有Luria-Bertani(LB)培养基的37℃通气的固定相(stationary phase)培养物[18]。以下述浓度使用抗生素：卡那霉素(Kn)，50μg/ml，氨苄青霉素(Ap)，50μg/ml。
1.2.包含额外减毒突变的鼠伤寒沙门氏菌dam疫苗候选物的构建
使用标准遗传方案[20]通过引入定义的dam序列的框内300bp缺失(称为damΔ232[19])构建了鼠伤寒沙门氏菌UK-1Δdam。获得的鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232株(MT3134)显示对嘌呤类似物2-氨基嘌呤(2-AP)敏感，其对于缺少非功能性DNA腺嘌呤甲基化酶的菌株是毒性的[21,22]，且对于全部研究将其用作亲本沙门氏菌属dam疫苗株。如所述[20]利用自杀载体pCVD442将次级毒力减毒缺失突变引入亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232株，在下述靶向基因中获得定义编码序列的框内缺失的构建：dam aroA(MT3138；1056bp缺失)；dam htrA(MT3142；1341bp缺失)；dam mgtC(MT3146；606bp缺失)；dam sifA(MT3150；807bp缺失)；dam spiC(MT3154；306bp缺失)；dam spvB(MT3158；1563bp缺失)；和dam ssaV(MT3162；1959bp缺失)。所得的基因构建体使用缺失序列侧翼的引物通过PCR确认。
1.3.毒力和保护测定
口服和腹膜内致死剂量50(LD50)：杀死50％的感染动物所需的剂量经由口服(经由胃插管)和腹膜内(i.p.)途径通过感染至少10只小鼠确定[30,19]。沙门氏菌属测试株和野生型鼠伤寒沙门氏菌参照株14028在LB培养基中生长过夜。将在0.2ml的0.2M Na2HPO4pH8.1或0.1ml的0.15M NaCl(分别用于口服和腹膜内施用)中重悬的细菌细胞用于感染小鼠，每日检查其发病率和死亡率直至感染后3周。鼠伤寒沙门氏菌UK-1的口服和腹膜内LD50分别为105和<10生物体[30]。将6-8周龄的BALB/c小鼠用于全部毒力研究。保护测定法.使用鼠伤寒沙门氏菌dam疫苗株以109CFU的剂量口服免疫小鼠[30,19]。为避免归因于疫苗株在宿主组织中持续性的瞬时非特异性交叉保护免疫响应[23-25]，直至疫苗株从免疫动物的粘膜(派尔集合淋巴结；肠系膜淋巴结)和全身组织(肝；脾)清除后4-5周，不使用毒力沙门氏菌属激发免疫小鼠。免疫后11周，用相当于100-至200-倍LD50的感染剂量的毒力肠沙门氏菌血清型口服激发小鼠。激发后每日检查小鼠的发病率和死亡率直至激发后3周。
1.4.构建沙门氏菌属疫苗候选物的抗生素抗性衍生物以评估疫苗和激发株粪便脱落，和在去离子水和绵羊粪便内的持续性
构建鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物的卡那霉素抗性(Knr)衍生物以评估疫苗粪便脱落。鼠伤寒沙门氏菌株MT2057是野生型参照株14028的Knr衍生物，其包含用于将其与其他作为固有地Lac-的沙门氏菌属辨别的编码Knr的Lac+MudJ转录融合[19,26]。将生长在供体株MT2057上的噬菌体P22用于将受体沙门氏菌属dam疫苗候选物转导为卡那霉素抗性[18]，生成Knr鼠伤寒沙门氏菌UK-1 dam Δ232双突变疫苗候选物dammgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1亲本株(MT3180)。疫苗株 脱落.用Knr鼠伤寒沙门氏菌UK-1 dam双突变疫苗候选物通过口服途径接种BALB/c小鼠(109CFU)。在免疫后第2、4、7、11、14和21天从个体小鼠收集粪便并铺板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。激发株脱落.用Knr鼠伤寒沙门氏菌UK-1 dam双突变疫苗候选物通过口服途径接种BALB/c小鼠(109CFU)。疫苗株粪便清除发生在免疫后4周。免疫后11周，用100LD50剂量的鼠伤寒沙门氏菌UK-1的Knr衍生物(MT2315；107CFU)激发接种的小鼠。在免疫后第2、4、7、11、14和21天从个体小鼠收集粪便并铺板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。去离子水和绵羊粪便内的持续性.通过将20ml的去离子水添加至5g干燥的绵羊粪便(来自Barbara Byrne,University of California,Davis的礼物；[27,28])制备20％的粪便干物质。使用鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物的Knr衍生物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)或dam UK-1亲本株(MT3180)接种去离子水(20ml)和20％绵羊粪便(2x105CFU)。在具有松顶帽的50ml锥形管中在室温实施一式三份测定。将样品涡旋并在两周期间铺板用于CFU。
1.5统计学分析
使用残留(或受限)的最大似然(REML)分析对连续重复的测量数据进行了分析(Genstat,第15th版,VSN International,UK,[34])。对于因素时间和用于可变的CFU的治疗拟合单变量、重复测量模型。将Wald卡方检验用于确定显著的个体效果和或因素之间显著的相互作用。从模型中删除任何非显著项并重复分析。如下分析数据作为基于预测模型的平均值表示。预测的平均值是从拟合模型而非原始样品平均值获得的那些。这是重要的，因为预测的平均值代表调整至通用变量集合(a common set of variables)的平均值，因此可允许平均值间有效的比较。将小于0.05的P值认为是统计学上显著的。使用方差分析(ANOVA,Genstat,第15版,VSN International,UK)对尸检时组织中存在的CFU的数目进行了分析。使用REML和ANOVA计算的个体平均值间的差异通过计算近似最小显著差异(LSD)确定。超过计算的LSD的平均值差异认为是显著的。
使用逻辑回归模型(Genstat,第15版,VSN International,UK,[34])分析了二项式数据(脱落[是/否]和结果[活/死])。将疫苗拟合至模型。使用Wald统计评估了整体显著性(P<0.05)。根据相对于参照组的t参数估计评估了固定效果(疫苗)的显著性。小于0.05的p值认为是统计学上显著的。
1.6.伦理声明
全部动物实验依照国立健康研究院对于实验室动物的饲养和护理指南实施，并在加州大学圣巴巴拉分校机构动物护理和使用委员会相关审查和批准后依照机构规章实施。
2.结果
2.1.包含次级毒力减毒突变的沙门氏菌属dam疫苗候选物的构建
修饰的活疫苗的商业成功取决于治疗指数、安全性/效力的比，且因此将次级毒力减毒突变引入肠沙门氏菌鼠伤寒血清型dam疫苗以改进疫苗安全性。构建了亲本菌株UK-1的抗生素敏感的dam-缺失衍生物以消除抗生素抗性向其他微生物菌株的潜在传播(材料和方法)。将所得的鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232(MT3134)用作全部研究的亲本疫苗背景。随后将次级毒力减毒突变引入鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232以改进疫苗安全性(材料和方法)。这些突变靶向参与细胞内和/或系统性存活的基因，包括aroA(氨基酸生物合成)；htrA(应激响应)；mgtC(镁运输)；sifA、spiC、ssaV(沙门氏菌属致病性岛-2(SPI-2)；和spvB(细胞毒素产生)。随后评估了所得的沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物dam aroA、damhtrA、dam mgtC、dam sifA、dam spiC、dam spvB、dam ssaV相比亲本沙门氏菌属dam疫苗株改进的安全性/效力。
2.2.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物用于菌落化和在粘膜和全身组织中持续性的评估
将次级毒力减毒突变引入修饰的活疫苗的主要问题是由于作为加速的疫苗清除的结果的减少的抗原暴露所致的可能的效力损失。因此，检查了鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物dam aroA、dam htrA、dam mgtC、dam sifA、dam spiC、dam spvB、dam ssaV中维持与在亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232疫苗株中发现的那些相似的菌落化和持续性的那些。使用沙门氏菌dam双突变疫苗候选物口服感染BALB/c小鼠(109CFU)，并在感染后第2和4周在粘膜(派尔集合淋巴结；肠系膜淋巴结)和全身组织(肝和脾)中评估了疫苗株的菌落化/持续性(图1)。将沙门氏菌属dam双突变候选物分为两组，I类：相对亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232单突变疫苗株显示相似的菌落化/持续性的那些(dam mgtC；dam sifA；dam spvB)；和II类：相对由亲本沙门氏菌属dam疫苗所呈现的，呈现菌落化/持续性的那些(dam aroA、dam htrA、dam spiC、dam ssaV)。这些数据指示I类疫苗候选物疫苗在宿主组织中维持低级别的持续性，而II类疫苗显示了在接种动物中的快速清除。
2.3.沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的效力评估
检查了沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物(I类和II类)以辨别低级别的持续性是否对赋予与由亲本沙门氏菌属dam疫苗引起的情况相似的保护性免疫响应是必须的。使用7种沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的每一种口服免疫BALB/c小鼠(109CFU)。为避免归因于疫苗株在宿主组织中持续性的瞬时非特异性交叉保护的免疫响应[23-25]，直至疫苗株从免疫动物的粘膜(派尔集合淋巴结；肠系膜淋巴结)和全身组织(肝；脾)清除后4-5周，不用毒力沙门氏菌属激发免疫小鼠。免疫后11周，用200-倍LD50感染剂量以毒力亲本株鼠伤寒沙门氏菌UK-1口服激发小鼠。用全部(3种中的3种)I类疫苗候选物(dam mgtC、dam sifA、dam spvB)免疫的小鼠呈现了抵抗毒力同源激发的稳固保护，与由亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232株呈现的情况相似(图2)。反过来，呈现加速清除的II类疫苗候选物(dam aroA、dam htrA、dam spiC、dam ssaV)中相比亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 dam 23株无一(4种中的0种)赋予对毒力同源激发的显著保护(**P<0.01,***P<0.001)。
评估了I类疫苗候选物引起对异源株交叉保护的能力，如已在沙门氏菌病的鼠类[2,9]、鸟类[10,11]、羊[12]和牛[13-15]模型中的沙门氏菌属dam疫苗株所显示的。用I类疫苗候选物(dam mgtC、dam sifA或dam spvB；109CFU)口服免疫BALB/c小鼠。免疫后11周，用分别包含血清组C2-C3、B和D、源自绵羊(病牛沙门氏菌174,鼠伤寒沙门氏菌131)和牛(都柏林沙门氏菌8895)的畜牧业相关致病性沙门氏菌属菌株激发小鼠。全部3种I类疫苗候选物赋予对测试的三种异源毒力株的稳固的交叉保护(图3；***P<0.001)，与先前用鼠伤寒沙门氏菌14028damΔ232疫苗株接种的小鼠中针对这3种异源激发株呈现的交叉保护水平相似[2]。这些数据与宿主组织中I类疫苗(dam mgtC、dam sifA和dam spvB)低级别的持续性可随时间提供稳定的抗原来源(需要其以转变为形成强适应性免疫响应)[2,9,19]的假设一致。
2.4.经由回复至2-AP抗性的评估的疫苗安全性评价
对于全部修饰的活疫苗，关注的是回复至提高的毒力。经由甲基定向错配修复基因中突变的获得，腹膜内(但非口服)感染后沙门氏菌属dam突变疫苗具有经历回复至更具毒力状态的能力[29]。这种回复可使用嘌呤类似物2-氨基嘌呤(2-AP)评价，其对缺乏Dam功能的细菌是毒性的[21]。也就是说，可评估亲本dam株(2-APS)在全身组织中至2-APr的回复(作为提高的毒力的潜在指标)[29]。用沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物dam mgtC、damsifA、dam spvB或亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232株(103CFU)腹膜内(i.p.)感染BALB/c小鼠。感染后5天，评估从肝和脾回收的细菌的2-APs(持续性)和至2-APr表型的回复(图4)。全部3种疫苗候选物(dam mgtC、dam sifA、dam spvB)显示了相对亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1damΔ232株的情况相对在脾/肝中显著减少的菌落化/持续性(2-APs)和减少的至2-AP抗性的回复(*P<0.05)。
沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的2-Apr衍生物和从感染的小鼠的脾分离的亲本dam UK-1疫苗经由口服和腹膜内致死剂量(LD50)毒力测定法进行了评价。野生型UK-1的口服和腹膜内LD50分别为105和<10CFU。源自全部沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的全部2-APr分离株(11种中的11种)或亲本沙门氏菌属dam疫苗(5种中的5种)的口服LD50通过口服施用为无毒的(表2)。相反，源自沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物的全部2-APr分离株(11种中的11种)经由腹膜内感染高度减毒，而源自亲本dam疫苗的那些(5种中的5种)与回复至更具毒力的状态相关，如先前所证明的[29]。这些数据指示沙门氏菌属dam mgtC、dam sifA和dam spvB疫苗株呈现了显著改进的疫苗安全性，如通过在感染过程中不能产生毒力回复体所证实，与沙门氏菌属dam疫苗相反。
2.5.沙门氏菌属dam双突变疫苗株的疫苗和激发株脱落评价
对于疫苗的安全性，在接种的动物中减少的疫苗和激发株脱落是合意的性状。构建了鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232双突变疫苗候选物的卡那霉素抗性衍生物以评估在免疫动物的粪便中疫苗株和激发株脱落。用沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物(dam mgtC[MT3183]；dam sifA[MT3184]；dam spvB[MT3186])或dam UK-1亲本株(MT3180)通过口服途径免疫BALB/c小鼠(109CFU)。疫苗株脱落.在感染后第2、4、7、11、14和21天获得粪便颗粒并评估Knr细菌。全部的沙门氏菌属dam双缺失疫苗候选物相比亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232株的情况呈现显著减少的疫苗株粪便脱落(图5；P<0.05)。激发株脱落.免疫后11周，用100LD50剂量的鼠伤寒沙门氏菌UK-1(MT2315；107CFU)的Knr衍生物激发接种的小鼠。在感染后第2、4、7、11、14和21天获得粪便颗粒并评估Knr细菌。在3周期间，相对亲本鼠伤寒沙门氏菌UK-1 damΔ232疫苗，沙门氏菌属dam mgtC、dam sifA和dam spvB株呈现了激发株脱落中的显著减少，其中dam sifA和dam spvB株从第4天至第21天显示减少的脱落(图6；P<0.05)。这些数据指示相对亲本沙门氏菌属dam疫苗，用沙门氏菌属dam双突变疫苗的接种导致较少的疫苗粪便脱落，且双缺失接种在毒力激发后提供比dam亲本疫苗更稳固的野生型沙门氏菌属脱落的减毒/弱化。
2.6.沙门氏菌dam双突变疫苗株的环境持续性(去离子水和绵羊粪便)评价
评价了沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物在去离子水和在绵羊粪便中的环境持续性。去离子水.用沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物(dam mgtC[MT3183]；dam sifA[MT3184]；dam spvB[MT3186])或dam UK-1亲本株(MT3180)的Knr衍生物接种去离子水(104CFU/ml)(图7)。在两周期间将水样品铺板用于CFU/g。相比野生型UK-1株的情况，全部(3种中的3种)沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物和亲本dam株在去离子水中在两周温育期间显示显著减少的活力(图7；P<0.05)。此外，水中低水平的疫苗持续性可与槽水疫苗施用兼容。绵羊粪便.用沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物(dam mgtC[MT3183]；dam sifA[MT3184]；dam spvB[MT3186])或dam UK-1亲本株(MT3180)的Knr衍生物接种20％干物质绵羊粪便(104CFU/ml)。在两周期间将粪便样品铺板用于CFU/g。相比野生型UK-1株的情况，全部(3种中的3种)沙门氏菌属dam双突变疫苗候选物在绵羊粪便中在两周温育期间显示了显著减少的活力(图8；P<0.05)。此外，沙门氏菌属dam sifA在绵羊粪便中显示了相对其他3种疫苗株测试显著更少的活力(P<0.05)。这些数据指示相比野生型UK-1株的情况，沙门氏菌属疫苗候选物在去离子水和绵羊粪便中都显示减少的环境持续性。
3.讨论
虽然有良好的农业管理实践，沙门氏菌病持续成为在集约化生产系统中利于粪-口传播的重要问题。疾病主要由增加的病原暴露和疾病易感性导致。环境条件的波动导致环境病原体载荷的变化和随后的宿主激发。与妊娠和分娩相关的生理变化增加对疾病的易感性，如新生儿的天然免疫状态所表现。管理实践还可对具有经历农场库存(运输前的集群、堆场、食物和水剥夺)和运输过程中(食物和水剥夺、环境应激)和在销售场(共混、病原体暴露)的积累的应激因素的宿主免疫力产生负面影响。
针对沙门氏菌病的牲畜接种是预防疾病的可行方法，因为它在开始时防止食品和水供应的污染，导致减少的病原体暴露、传播、动物疾病和牲畜衍生食品的直接污染和水果和蔬菜食品通过污染的水的间接污染。
理想情况下，应在原产地农场接种牲畜以在牲畜经历与销售、运输和进入饲养场后的高风险期相关的应激因素和病原体暴露前引起免疫。因为疾病的成本不在原产地产生，挑战是说服为饲养场提供库存的生产者在销售前接种动物，这导致在进入饲养场后紧接下来的高风险期进行牲畜免疫的目前实践。
如果向商业部门提供可负担和有效的产品，则疫苗可在整个动物生产工业广泛应用，因为疫苗接种简单，被生产者理解，并可能被采用，且因此可以在任何全面的食品安全计划的成功中起关键作用。
作为解决这一问题的潜在手段，修饰的活沙门氏菌属dam疫苗已显示在免疫的储备中是有效的和良好耐受的[10-15]，并且可经由饮用水施用[12,16]。然而，活疫苗的主要问题是安全性、脱落和环境持续性。
本文中，将次级毒力减毒突变引入沙门氏菌属dam株以筛选在动物和环境中安全的疫苗候选物，并保持赋予交叉保护效力的能力。鼠伤寒沙门氏菌dam sifA呈现了改进的疫苗安全性，减少的疫苗和激发株脱落、减少的环境持续性，并赋予了宿主组织中低级别的持续性，其足以赋予源自感染牲畜的异源致病性沙门氏菌属血清型的交叉保护[31]。这些数据指示，沙门氏菌属dam sifA对于商业应用呈现出有利的治疗指数(安全性/效力)，这支持了接种者和环境中改进的安全性，连同引起针对致病性血清型的交叉保护免疫的能力。
本文中，在接种的动物中和在模拟环境的条件中评价了疫苗的安全性。沙门氏菌属dam mgtC、dam sifA和dam spvB疫苗株在宿主组织中维持低级别的持续性，其与针对源自感染牲畜的异源致病性血清型的交叉保护免疫力的维持相关。此外，沙门氏菌属damsifA疫苗呈现了改进的疫苗安全性(疫苗脱落；激发株脱落；在全身组织中的持续性；在环境中的持续性)，同时维持了针对用同源和异源致病性血清型的毒力激发的稳固效力。因此，沙门氏菌属dam sifA疫苗候选物呈现大大增加的安全性而无损交叉保护效力且可证明是牲畜口服给药的安全、有效和低成本手段而无显著的环境持续性。
表1.本研究中使用的细菌株
表2.体内选择的dam双突变沙门氏菌属的2-APr衍生物经由腹膜内或口服感染途径是无毒的
a独立分离的、体内选择的沙门氏菌属dam突变疫苗株的2-氨基嘌呤抗性(2-APr)衍生物分离自感染的小鼠的脾，并评价了在未治疗小鼠中口服和腹膜内(IP)的毒力[29]。这些菌株中的每一种的LD50测定与野生型(UK-1)的情况进行了比较。通过感染5只小鼠每激发剂量确定了腹膜内LD50；通过感染10只小鼠每激发剂量确定了经由胃插管的经口LD50。野生型UK-1的口服和腹膜内LD50分别为105和<10CFU[30]。存活的小鼠评分为感染后>2周。
参考文献
[1]Mahan MJ,Heithoff DM,House JK.Salmonella cross-protectivevaccines:fast-forward to the next generation of food safety.FutureMicrobiol.2012；7:805-8.
[2]Heithoff DM,Enioutina EY,Bareyan D,Daynes RA,Mahan MJ.Conditionsthat diminish myeloid-derived suppressor cell activities stimulate cross-protective immunity.Infect Immun.2008；76:5191-9.
[3]Hegazy WAH,Hensel M.Salmonella enterica as a vaccinecarrier.Future Microbiol.2012；7:111-27.
[4]Kong Q,Yang J,Liu Q,Alamuri P,Roland KL,Curtiss III R.Effect ofdeletion of genes involved in lipopolysaccharide core and O-antigen synthesison virulence and immunogenicity of Salmonella enterica serovarTyphimurium.Infect Immun.2011；79:4227-39.
[5]Li Y,Wang S,Scarpellini G,Gunn B,Xin W,Wanda SY等Evaluation of newgeneration Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccines with regulateddelayed attenuation to induce immune responses against PspA.Proc Natl AcadSci USA.2009；106:593-8.
[6]Nagy G,Palkovics T,Otto A,Kusch H,Kocsis B,Dobrindt U等"Gentlyrough":the vaccine potential of a Salmonella enterica regulatorylipopolysaccharide mutant.J Infect Dis.2008；198:1699-706.
[7]Curtiss R,Xin W,Yuhua L,Kong W,Wanda SY,Gunn B等New technologiesin using recombinant attenuated Salmonella vaccine vectors.Crit RevImmunol.2010；30:255-70.
[8]Singh B.Salmonella vaccines for animals and birds and their futureperspective.Open Vaccine J.2009；2:100-12.
[9]Heithoff DM,Enioutina EY,Daynes RA,Sinsheimer RL,Low DA,MahanMJ.Salmonella DNA adenine methylase mutants confer cross-protectiveimmunity.Infect Immun.2001；69:6725-30.
[10]Dueger EL,House JK,Heithoff DM,Mahan MJ.Salmonella DNA adeninemethylase mutants elicit protective immune responses to homologous andheterologous serovars in chickens.Infect Immun.2001；69:7950-4.
[11]Dueger EL,House JK,Heithoff DM,Mahan MJ.Salmonella DNA adeninemethylase mutants prevent colonization of newly hatched chickens byhomologous and heterologous serovars.Intl J Food Microbiol.2003a；80:153-9.
[12]Mohler VL,Heithoff DM,Mahan MJ,Walker KH,Hornitzky MA,Gabor L等Protective immunity conferred by a DNA adenine methylase deficient Salmonellaenterica serovar Typhimurium vaccine when delivered in-water to sheepchallenged with Salmonella enterica serovar Typhimurium.Vaccine.2011；29:3571-82.
[13]Dueger EL,House JK,Heithoff DM,Mahan MJ.Salmonella DNA adeninemethylase mutants elicit early and late onset protective immune responses incalves.Vaccine.2003；21:3249-58.
[14]Mohler V,Heithoff D,Mahan M,Walker K,Hornitzky M,McConnell C等Cross-protective immunity in calves conferred by a DNA adenine methylasedeficient Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine.Vaccine.2006；24:1339.
[15]Mohler V,Heithoff D,Mahan M,Walker K,Hornitzky M,Shum L等Cross-protective immunity conferred by a DNA adenine methylase deficient Salmonellaenterica serovar Typhimurium vaccine in calves challenged with Salmonellaserovar Newport.Vaccine.2008；26:1751-8.
[16]Mohler V,Heithoff D,Mahan M,Hornitzky M,Thomson P,HouseJ.Development of a novel in-water vaccination protocol for DNA adeninemethylase deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine in adultsheep.Vaccine.2012；30:1481-91.
[17]Hassan JO,Curtiss R,3rd.Development and evaluation of anexperimental vaccination program using a live avirulent Salmonellatyphimurium strain to protect immunized chickens against challenge withhomologous and heterologous Salmonella serotypes.Infect Immun.1994；62:5519-27.
[18]Davis RW,Botstein D,Roth JR.Advanced bacterialgenetics.Plainview,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press；1980.
[19]Heithoff DM,Sinsheimer RL,Low DA,Mahan MJ.An essential role forDNA adenine methylation in bacterial virulence[see comments].Science.1999；284:967-70.
[20]Donnenberg MS,Kaper JB.Construction of an eae deletion mutant ofenteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicidevector.Infect Immun.1991；59:4310-7.
[21]Glickman B,van den Elsen P,Radman M.Induced mutagenesis in dam-mutants of Escherichia coli:a role for 6-methyladenine residues in mutationavoidance.Mol Gen Genet.1978；163:307-12.
[22]Julio S,Heithoff D,Provenzano D,Klose K,Sinsheimer R,Low D等DNAAdenine methylase is essential for viability and plays a role in thepathogenesis of Yersinia pseudotuberculosis and Vibrio cholerae.InfectImmun.2001；69:7610-5.
[23]Harrison JA,Villarreal-Ramos B,Mastroeni P,Demarco de HormaecheR,Hormaeche CE.Correlates of protection induced by live Aro-Salmonellatyphimurium vaccines in the murine typhoid model.Immunology.1997；90:618-25.
[24]Hormaeche CE,Joysey HS,Desilva L,Izhar M,Stocker BA.Immunityconferred by Aro-Salmonella live vaccines.Microb Pathog.1991；10:149-58.
[25]Hormaeche CE,Mastroeni P,Harrison JA,Demarco de Hormaeche R,Svenson S,Stocker BA.Protection against oral challenge three months afteri.v.immunization of BALB/c mice with live Aro Salmonella typhimurium andSalmonella enteritidis vaccines is serotype(species)-dependent and onlypartially determined by the main LPS O antigen.Vaccine.1996；14:251-9.
[26]Conner CP,Heithoff DM,Julio SM,R.L.S,Mahan MJ.Differentialpatterns of acquired virulence genes distinguish Salmonella strains.Proc NatlAcad Sci U S A 1998.；95:4641-5.
[27]Griggs T.Determining forage dry matter concentration with amicrowave oven AG/Forage&Pasture/2005-01.2005.
[28]Pitt R,Brusewitz G,Chase L,Collins M.Forage moisturedetermination.NRAES(59)(Cooperative Extension).1993.
[29]Heithoff D,Badie G,Julio S,Enioutina E,Daynes R,Sinsheimer R等Invivo-selected mutations in methyl-directed mismatch repair suppress thevirulence attenuation of Salmonella dam mutant strains followingintraperitoneal,but not oral,infection ofmice.J Bacteriol.2007；189:4708-17.
[30]Heithoff DM,Shimp WR,House JK,Xie Y,Weimer BC,Sinsheimer RL等Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strainsin nature.PLoS Pathogens.2012；8:e1002647.
[31]Heithoff DM,Shimp WR,Lau PW,Badie G,Enioutina EY,Daynes RA等HumanSalmonella clinical isolates distinct from those of animal origin.ApplEnviron Microbiol.2008；74:1757-66.
[32]Griggs T.Determining forage dry matter concentration with amicrowave oven AG/Forage&Pasture/2005-01.2005.
[33]Pitt R,Brusewitz G,Chase L,Collins M.Forage moisturedetermination.NRAES(59)(Cooperative Extension).1993.
[34]International V.GenStat for Windows 15th Edition VSNInternational,Hemel Hempstead,UK.2012.

Claims (17)

1.一种沙门氏菌属(Salmonella)微生物，其中所述微生物包含dam基因中的功能缺失突变和选自下组的基因中的至少一个另外的功能缺失突变：sifA、spvB和mgtC。
2.根据权利要求1的沙门氏菌属微生物，其中所述功能缺失突变选自下组：在所述基因中插入、缺失和/或取代一个或多个核苷酸。
3.权利要求1或2的沙门氏菌属微生物，其中所述微生物是选自下组的肠沙门氏菌肠亚种血清型(Salmonella enterica subsp.Enterica serovar)：鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、都柏林沙门氏菌(S.Dublin)、纽波特沙门氏菌(S.Newport)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)和病牛沙门氏菌(S.Bovismorbificans)。
4.上述权利要求任一项的沙门氏菌属微生物，其中所述微生物是鼠伤寒沙门氏菌。
5.上述权利要求任一项的沙门氏菌属微生物，其中所述至少一个另外的功能缺失突变在sifA基因中。
6.一种用于在受试者中诱导对沙门氏菌属微生物的免疫响应的组合物，所述组合物包含足以在所述受试者中引起免疫响应的量的权利要求1-5任一项的微生物和佐剂、稀释剂、载剂或赋形剂。
7.权利要求1-5任一项的沙门氏菌属微生物的纯化的培养物。
8.权利要求7的纯化的培养物，其中所述培养物是冷冻干燥的、冷冻的或重构的。
9.一种预防或减少受试者以毒力沙门氏菌属微生物感染的可能性的方法，所述方法包括：
-将一定量的权利要求1-5任一项的微生物、权利要求6的组合物或权利要求7或8的纯化的培养物施用至对其有需要的受试者；
-其中施用的微生物、组合物或纯化的培养物的量足以在所述受试者中引起免疫响应。
10.根据权利要求9的方法，其中所述微生物、组合物和/或纯化的培养物经由口服、鼻或胃肠外途径施用。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述受试者是人受试者。
12.根据权利要求9或10的方法，其中所述受试者是兽医种类。
13.根据权利要求12的方法，其中所述受试者选自下组：牛、马、山羊、绵羊、猪和家禽。
14.根据权利要求1-5任一项的沙门氏菌属微生物在制造药物中的用途，所述药物用于预防或减少受试者以毒力沙门氏菌属微生物感染的可能性。
15.权利要求7或8的纯化的培养物在制造药物中的用途，所述药物用于预防或减少受试者以毒力沙门氏菌属微生物感染的可能性。
16.根据权利要求14或15的用途，其中所述药物是疫苗。
17.根据权利要求1-5任一项的沙门氏菌属微生物，其用于预防或减少受试者以毒力沙门氏菌属微生物感染的可能性。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112618706B (zh) * 2020-11-21 2021-09-14 青岛博霖生物科技有限公司 沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070110717A1 (en) * 2003-10-08 2007-05-17 Yunping Luo Dna vaccines against tumor growth and methods of use thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020086032A1 (en) * 1999-02-02 2002-07-04 Mahan Michael J. Producing antibodies with attenuated bacteria with altered DNA adenine methylase activity
US20020068068A1 (en) * 1999-02-02 2002-06-06 Mahan Michael J. Method of creating antibodies and compositions used for same
EP1245679A4 (en) * 1999-12-21 2005-03-16 Japan Science & Tech Agency IMPF STAMPS AGAINST INFECTIONS WITH PATHOGENIC BACTERIA
NZ519477A (en) * 1999-12-23 2004-04-30 Microscience Ltd Attenuated microorganisms for the treatment of infection
WO2002026251A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Microscience Limited Attenuated salmonella microorganisms comprising a mutation in the sifa gene
EP1622648B1 (en) * 2003-03-24 2010-06-30 The Scripps Research Institute Dna vaccines against tumor growth and methods of use thereof
US8761034B2 (en) 2008-02-27 2014-06-24 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) System and method of demultiplexing provider backbone bridging traffic engineering instances

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070110717A1 (en) * 2003-10-08 2007-05-17 Yunping Luo Dna vaccines against tumor growth and methods of use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B.R. SINGH: "Salmonella Vaccines for Animals and Birds and Their Future Perspective", 《THE OPEN VACCINE JOURNAL》 *
BADIE G等: "Altered levels of Salmonella DNA adenine methylase are associated with defects in gene expression, motility, flagellar synthesis, and bile resistance in the pathogenic strain 14028 but not in the laboratory strain LT2", 《J BACTERIOL》 *
MARCELLO JAKOMIN等: "Regulation of the Salmonella enterica std Fimbrial Operon by DNA Adenine Methylation, SeqA, and HdfR", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *

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RU2017110230A3 (zh) 2019-04-24
NZ729153A (en) 2022-03-25
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MX2017002594A (es) 2017-05-19
EP3186363A4 (en) 2018-04-11
JP6683684B2 (ja) 2020-04-22
AU2015308695B2 (en) 2020-11-05
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US10329552B2 (en) 2019-06-25
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Dziva et al. Colibacillosis in poultry: unravelling the molecular basis of virulence of avian pathogenic Escherichia coli in their natural hosts
Hanes nontyphoid Salmonella
Methner et al. Intestinal colonisation-inhibition and virulence of Salmonella phoP, rpoS and ompC deletion mutants in chickens
Haig et al. Comparative susceptibility of Atlantic salmon and rainbow trout to Yersinia ruckeri: relationship to O antigen serotype and resistance to serum killing
Karasova et al. Comparative analysis of Salmonella enterica serovar Enteritidis mutants with a vaccine potential
Dueger et al. Salmonella DNA adenine methylase mutants prevent colonization of newly hatched chickens by homologous and heterologous serovars
Varmuzova et al. Immune protection of chickens conferred by a vaccine consisting of attenuated strains of Salmonella Enteritidis, Typhimurium and Infantis
Fouz et al. Vibrio vulnificus serovar A: an emerging pathogen in European anguilliculture
Omwandho et al. Salmonella enterica serovar Enteritidis: a mini-review of contamination routes and limitations to effective control
Sanderson et al. Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi A
Fratamico et al. Escherichia coli infections
Lumsden et al. Resistance to fecal shedding of salmonellae in pigs and chickens vaccinated with an aromatic-dependent mutant of Salmonella typhimurium
US7026155B2 (en) Method of reducing bacterial proliferation
Wallis et al. Salmonella epidemiology and pathogenesis in food-producing animals
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Sang et al. Salmonella typhi and Salmonella paratyphi
Choi et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium ruvB mutant can confer protection against salmonellosis in mice
Robinett The effect of Salmonella autogenous vaccination on serotype surveillance, recovery, and phenotypic characteristics

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