CN106650197B - 中西联用药物ppk-ppd模型建立方法及妇科千金方组合物与阿奇霉素联用评价应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中西联用药物PPK‑PPD模型建立方法及妇科千金方组合物与阿奇霉素联用评价应用。本发明方法包括建立已确认疗效的西药的PPK模型；确定综合表达总体药效的线性空间或明显指标作为PD输出值；确定合适的PD指标量化模型，建立截断数据的PPD模型；分析组织分布、抗菌类型、感染与炎症关系的量化因素，确定合适的PPK‑PPD联接方式；建立基于作用机制的中药对阿奇霉素协同作用的合并用药PPK‑PPD综合模型，计算相应模型参数；对得到的模型参数进行相关假设检验及区间估计，完成评价等步骤。本发明科学设计了能定量评价引药参与的动力学‑药效学系统变异动力学系统，改变了弱效能药物疗效指标点法测定均值比较的研究方法的弊端。

Description

中西联用药物PPK-PPD模型建立方法及妇科千金方组合物与 阿奇霉素联用评价应用

技术领域

本发明涉及药物评价技术领域，更具体地，涉及中西联用药物PPK-PPD模型建立方法及妇科千金方组合物与阿奇霉素联用评价应用。

技术背景

根据文献报道，中医学认为慢性盆腔炎(chronicpelvicinflammatorydisease，CPID)主要机理是妇人经期、产后血室正开，余血未尽，易为六淫、七情、饮食、劳倦及房劳所伤，影响冲任气血以成瘀为患。

妇科千金片(胶囊)由千斤拔、单面针、金樱根、穿心莲、功劳木、党参、当归、鸡血藤八味活性成分组成，清热除湿，益气化瘀。主要用于湿热瘀阻所致的带下病、腹痛，症见带下量多、色黄质稠、臭秽，小腹疼痛，腰骶酸痛，神疲乏力；慢性盆腔炎、子宫内膜炎、慢性宫颈炎见上述证候者。在治疗慢性盆腔炎方面取得显著的效果。

近年来，随着中医药现代化进程加速，中西药联合应用日趋广泛。临床对慢性盆腔炎的治疗亦常采用中西医结合疗法或中药与抗生素联合应用。目前，大量研究报道妇科千金片与抗生素联合应用治疗慢性盆腔炎疗效显著提高，且不良反应发生率明显降低。妇科千金片联合阿奇霉素对慢性妇科炎症的疗效优于单用阿奇霉素，临床上常将两者合用治疗慢性妇科炎症疾病。

实践中，治疗慢性盆腔炎，中医应用活血化瘀法可明显改善临床症状，西医学则认为其为急性盆腔炎后的无菌性炎症，表现为血液流变学、免疫学、病理学等异常改变。因此，治疗采用抗感染、抗炎和宫腔内药物局部作用为基本治则，也有临床文献认为促使子宫收缩使感染性宫腔分泌物排出或应用大量抗生素的情况下清理宫腔具有较显著疗效。这一治疗思想同当归“引药内消”的本草认识具有思路上的相似处。

“能引诸血各归其所当归之经，故名当归”。“妇人以血为本”，当归乃血家要药，主要有补血活血，调经止痛，润肠通便之功，在妇科疾病中应用极广。《本草新编》云“用当归于败毒化毒药中，正取其性动，则引药内消，直趋大便而出，奏功实神。故已溃者断宜大用，使之活血以生肌，即未溃者尤宜急用，使之去毒而逐秽也。”

但是，在妇科千金片与抗生素联合应用治疗慢性盆腔炎的研究中，鲜见针对妇科千金方中当归“引药内消”作用是否存在及内在作用机制与效果的研究，也未见当归引药作用是用其于败毒化毒之何种活性成分组的效果基础之上，妇科千金片中活性成分以及活性成分组如何提升对阿奇霉素的作用基线水平的机制也缺乏相关研究和指引。

量化妇科千金方中不同药物群对复方以及复方联合阿奇霉素应用的总体功效的贡献率方面进行深入研究，对探究妇科千金方中发挥抗炎和活血作用的主要药物组、全面提高妇科千金片的产品质量，确保临床用药质量可控、均一、安全提供理论依据、指导临床合理用药具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是填补现有妇科千金方组合物联合阿奇霉素治疗慢性盆腔炎的效果评价技术不足，提供一种中西联用药物PPK-PPD模型建立方法及妇科千金方组合物与阿奇霉素联用评价应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

中西联用药物PPK-PPD模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

S31.建立已确认疗效的西药的PPK模型；

S32.确定综合表达总体药效的线性空间或在各个药效指标中选择一个各组方协同作用较明显的指标作为PD输出值；

S33.确定合适的PD指标量化模型，建立截断数据的PPD模型；

S34.分析组织分布、抗菌类型、感染与炎症关系的量化因素，确定合适的PPK-PPD联接方式；

S35.建立基于作用机制的中药对阿奇霉素协同作用的合并用药PPK-PPD综合模型，计算相应模型参数；

S36.对得到的模型参数进行相关假设检验及区间估计，完成评价。

优选地，步骤S35所述建立PPK-PPD综合模型和计算相应模型参数的方法是：参照Kinettica及monolix软件进行整体模型的建立；各节点调整相应参数后，对前后计算结果进行AIC和Log likelihood值比对，设置相应适当的计算参数；使用非线性混合效应模型分析全体药物动力学过程，可估计动力学参数的群体分布及由于生理和病理对个体间变异的贡献；分析算法主要为EM法，E为条件期望贝叶斯估计，M为最大似然估计；条件期望贝叶斯估计时假设群体中药物动力学参数具有已知的先验分布，同时亦假设残余误差分布已知，在所述条件下对个体药物动力学参数进行估计；最大似然估计以条件期望贝叶斯估计的个体参数为初值，以最大似然估计法求算群体均值及方差；EM算法迭代进行时以前后两次模型修正的模型显著性改变为评价标准，前后两次计算模型参数改变无显著性则运算终止。

优选地，是将进行药效评价的所有时间段中的样本进行基于所有测定的生理及药理指标的多变量分类识别；并将所有样本的所有药效按照非监督的分类空间进行二次投影，形成反映综合药效的PPD样本空间，对组成样本空间的高权重分类标志进行区分。

优选地，所述模型的原始数据构成是分析矩阵每一行为一样本，列组成由各时间点体重、取样进脏器重量、脏器系数、血细胞计数各值、血流变各值、炎症指标各值组成，矩阵大小84*44。

本发明同时提供所述方法在妇科千金方组合物与阿奇霉素联用评价应用。

具体应用于妇科千金方组合物与阿奇霉素合并用药时对阿奇霉素药动学的影响结果。

或者应用于妇科千金方组合物与阿奇霉素合并用药时对阿奇霉素药效学的影响结果。

或者应用于妇科千金方各分组组合物与阿奇霉素合并用药时对阿奇霉素药动学或药效学的影响结果。

所述妇科千金方各分组组合物为：以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针为活性成分组成的中药组合物；或者以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、鸡血藤、党参为活性成分组成的中药组合物；或者以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、鸡血藤、当归、党参为活性成分组成的中药组合物。

本申请人结合妇科千金方的处方组成，可认为当归引药作用正是用其于败毒化毒之千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针中，而收“去毒而逐秽”的引药之功；妇科千金方中千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针清热除湿成分极可能发挥抗感染抗炎的解外邪功效，作用类似现代抗微生物药，而当归、鸡血藤、党参的重叠作用类似于“宫腔分泌物排出”有相似之处。据此建立本发明评价方法并通过群体药动学-群体药效学联合模型科学验证。

具体地，本发明是采用基线等加法，首先测定已证实明确有效的治疗药物阿奇霉素的作用水平，将阿奇霉素与供试中药组合物并行给予大鼠，测定合并用药的基线水平和合并用药的疗效趋势，通过群体药动学-群体药效学联合模型进行验证。

本发明科学设计技术路线，提供一种所述妇科千金方中活性成分对阿奇霉素作用基线提升水平的量化评价方法，包括以下步骤：

S1.以慢性盆腔炎大鼠为实验模型；

S2.测定阿奇霉素的作用水平；

S3.构建妇科千金方组合物PPK-PPD联结模型，引入妇科千金方组合物总各组成部分为协变量，量化评价阿奇霉素作用基线提升水平。

其中，步骤S1所述实验模型采用慢性盆腔炎大鼠模型，所述实验模型优选的制备方法是采用混合菌液机械注入大鼠宫腔并轻度机械损伤法完成。所述混合菌液是以金色葡萄球菌和大肠埃希菌为受试菌。优选地，混合菌液中受试菌的最佳培养方式为：分别挑3～4个单菌落于40毫升的M-H(B)培养基中，隔夜增菌培养16小时后取出原菌液用全波长多功能读数议测OD值(细菌生长饱和期)；取20mL，分装于离心管中，每管2mL，离心10000～15000rpm/min，10分钟，弃取上清液之中的M-H(B)，用2mL生理盐水混匀后，再离心15000rpm/min，10分钟，弃取上清液中的生理盐水，收集细菌细胞菌体2mL。将相同方法培养的金色葡萄球菌和大肠埃希菌按1：1混合即获得4mL混合菌液。将该菌液为100菌液浓度，用生理盐水进行10倍稀释，稀释至0.1×10⁰，0.01×10⁰，备用(共3个剂量)。进一步优选地，以0.01×10⁰为最佳感染菌量。

步骤S3是经过分析设计，预试采用包括HPLC-UV或EC(电化学检测)法在内的多种检测方法进行，完成模型大鼠血液及子宫组织两种生物基质内选择性、工作曲线、稳定性试验，最终确定优选地两种生物基质中阿奇霉素的浓度测定方法。所述测定阿奇霉素的作用水平的方法是：HPLC-ECD方法或者HPLC-ESI-MS方法。

所述HPLC-ECD方法或者HPLC-ESI-MS方法的样品前处理方法是取血浆50μL，加入10M NH₄OH溶液和内标罗红霉素甲醇溶液(160ng/mL)；加入二乙醚，涡旋后静置，离心后吸取上层有机相，空气流下吹干，残留物加入流动相溶解，涡旋，离心，取上清液进行分析。

所述HPLC-ECD方法的色谱条件为：色谱柱Aglient poroshell120EC-C18(2.7μm×4.6×100mm)695975-902，在线滤器：SSI35-0149；流动相：乙腈-pH7.0磷酸缓冲溶液(45：55，V/V)；流速0.8mL/min；柱温30℃。玻碳工作电极电位+1.2V，参比电极Ag/AgCl。

所述HPLC-ESI-MS方法的色谱条件为：色谱柱Aglientporoshell120EC-C18(2.7um×4.6×100mm)695975-902，在线滤器：SSI35-0149；流动相：乙腈-10mMpH5.2醋酸铵(65:35)，流速为0.2mL/min，进样量5μL；质谱检测条件为：电喷雾电离源(ESI)，选择性正离子检测(SIM)，阿奇霉素m/z 749.5[M+H]⁺和内标罗红霉素m/z 837.5[M+H]⁺，电离源电压4.5kV，喷雾气(N₂)的流速为1.5L/min，脱溶剂温度为250℃，检测器电压1.5kv。

步骤S4是以分组模式为关键协变量，量化妇科千金方组合物以及方中各活性成分组对阿奇霉素作用的PK及PD参数的群体模型参数的影响方式及相关系数。基本途径如前所述。

本发明的有益效果是：

本发明验证模型中，PPK采用通过大样本全疗程的方法，以全疗程中指标成分在体液及靶部位的暴露量为建模关键数据，综合考虑了样本个体差异的统计学分布，科学设计了能定量评价引药参与的动力学-药效学系统变异动力学系统，改变了弱效能药物疗效指标点法测定均值比较的研究方法的弊端。

本发明明确了妇科千金方组合物对阿奇霉素各药动学参数的增效影响，为临床合理用药提供指导。通过PPK-PPD模型，本发明总结得到妇科千金方组合物中发挥抗炎和活血作用的主要药物组，为全面提高妇科千金片的产品质量，确保临床用药质量可控、均一、安全提供理论依据；通过评价方法的建立和建立科学的PPK/PPD模型，量化了妇科千金方组合物中不同药物群对复方总体功效的贡献率，为妇科千金方组合物的二次开发以及产业提升提供有力的技术参考和依据。

附图说明

图1本发明方法技术路线设计示意图。图2空白基质SIM总离子流图。图3标准物质+空白基质SIM总离子流图。图4典型低浓度样品SIM总离子流图。图5药物联合治疗前后全血低切还原粘度变化情况。图6药物联合治疗前后全血高切还原粘度变化情况。图7药物联合治疗前后高切相对指数变化情况。图8药物联合治疗前后低切相对指数变化情况。图9药物联合治疗前后压积变化情况。图10药物联合治疗前后全血粘度变化情况。图11药物联合治疗前后红细胞刚性指数变化情况。图12药物联合治疗前后红细胞聚集指数变化情况。图13药物联合治疗前后红细胞变形指数变化情况。图14药物联合治疗前后红细胞计数变化情况。图15药物联合治疗前后红细胞比积计数变化情况。图16药物联合治疗前后血红蛋白计数变化情况。图17药物联合治疗前后平均红细胞体积变化情况。图18药物联合治疗前后平均血红蛋白含量变化情况。图19药物联合治疗前后平均蛋白浓度变化情况。图20药物联合治疗前后红细胞宽度变异系数变化情况。图21药物联合治疗前后红细胞宽度标准差变化情况。图22药物联合治疗前后血小板数变化情况。图23药物联合治疗前后平均血小板体积变化情况。图24药物联合治疗前后白细胞数变化情况。图25药物联合治疗前后淋巴细胞百分比变化情况。图26药物联合治疗前后中间细胞百分比变化情况。图27药物联合治疗前后粒细胞百分比变化情况。图28药物联合治疗前后血小板体积变化情况。图29药物联合治疗前后血小板分布宽度变化情况。图30药物联合治疗后动物子宫病理切片图。其中，从左至右分别为AZM、AZMQR、AZMDG、AZMFF治疗组动物子宫病理切片图。图31药物联合治疗前后子宫脏器系数变化情况。图32药物联合治疗前后卵巢脏器系数变化情况。图33药物联合治疗前后脾脏脏器系数变化情况。图34药物联合治疗前后胸腺脏器系数变化情况。图35药物联合治疗前后血浆内毒素变化情况。图36药物联合治疗前后血浆一氧化氮变化情况。图37药物联合治疗前后血浆肿瘤坏死因子变化情况。图38药代动力学PK趋势图。图39药代动力学所有个体PK集中图。图40计算方法第一示意图。图41计算方法第二示意图。图42计算方法第三示意图。图43药效空间的维数选择图。图44药效空间的重组和各样本投影值在取样时间轴上的分布图。图45原始药效指标在药效空间1、2主成分上的权重分布图。图46总体结构模型结构示意图。图47各组平均值对全模型的拟合结果。图48各组平均浓度拟合曲线。图49各组平均浓度拟合值-实测值散点图(左：群体参数拟合对照；右：个体参数拟合对照)。图50用于计算的各组平均效应值。图51全模型拟合后的各组平均效应曲线。图52各组平均效应拟合值-实测值散点图(左：群体参数拟合对照；右：个体参数拟合对照)。图53用于计算的全体样本浓度值。图54全模型前12个个体浓度拟合曲线。图55浓度拟合值-实测值散点图(左：群体参数拟合对照；右：个体参数拟合对照)。图56浓度实测值与拟合值累加概率置信区间。图57浓度实测值变异区间与拟合值累加概率分布区间。图58浓度实测值变异区间与拟合值累加概率分布区间。图59用于计算的全体样本效应值。图60全模型前12个个体效应拟合曲线。图61效应拟合值-实测值散点图(左：群体参数拟合对照；右：个体参数拟合对照)。图62效应实测值与拟合值累加概率置信区间。图63效应实测值变异区间与拟合值累加概率分布区间。图64效应实测值变异区间与拟合值累加概率分布区间。图65各协变量与模型参数的盒式分布图。图66模型参数群体参数误差分布的的盒式图。图67样本在药效空间重投影距离的动力学分布。图68检测NO用的NaNO₂标准液的稀释步骤示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

一、本实施例实验方法建立的原理分析概述

1.处方分析：

处方组成：千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参组成。

功能主治：清热除湿，益气化瘀。主要用于湿热瘀阻所致的带下病、腹痛，症见带下量多、色黄质稠、臭秽，小腹疼痛，腰骶酸痛，神疲乏力；慢性盆腔炎、子宫内膜炎、慢性宫颈炎见上述证候者。

处方分析：从处方组成而言，从表1可见，药物的性味、植物来源、化学成分，可将组方药效方向可划分为两个功效群。其一为清热除湿组，含千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针，其科属来源及现有化学成分多具有抗菌抗炎镇痛及免疫调节作用；其二为活血益气组，含当归、鸡血藤、党参，这三味药作用相互叠加，现代药理研究多具有改善血流变、调节平滑肌功能和血液生成等功能。

表1处方组成及相关植物学和化学成分背景分析简表

2.致病机理及治疗原则初步分析

中医学认为慢性盆腔炎(chronicpelvicinflammatorydisease，CPID)主要机理是妇人经期、产后血室正开，余血未尽，易为六淫、七情、饮食、劳倦及房劳所伤，影响冲任气血以成瘀为患。实践中应用活血化瘀法可明显改善临床症状。西医学则认为其为急性盆腔炎后的无菌性炎症，表现为血液流变学、免疫学、病理学等异常改变。因此，治疗采用抗感染、抗炎和宫腔内药物局部作用为基本治则，也有临床文献认为促使子宫收缩使感染性宫腔分泌物排出或应用大量抗生素的情况下清理宫腔具有较显著疗效。这一治疗思想同当归“引药内消”的本草认识具有思路上的相似处。

“能引诸血各归其所当归之经，故名当归”。“妇人以血为本”，当归乃血家要药，主要有补血活血，调经止痛，润肠通便之功，在妇科疾病中应用极广。《本草新编》云“用当归于败毒化毒药中，正取其性动，则引药内消，直趋大便而出，奏功实神。故已溃者断宜大用，使之活血以生肌，即未溃者尤宜急用，使之去毒而逐秽也。”结合妇科千金方的处方组成，可认为当归引药作用正是用其于败毒化毒之千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针中，而收“去毒而逐秽”的引药之功。

综上考虑，妇科千金方中清热除湿组应为发挥抗感染抗炎的解外邪功效，作用类似现代抗微生物药，而当归、鸡血藤、党参的重叠作用类似于“宫腔分泌物排出”有相似之处。

3.实验原理

通过长期研究分析并通过大量实验，本申请人设计采用基线等加法，首先测定已证实明确有效的治疗药物阿奇霉素的作用水平，将阿奇霉素与供试药物并行给予大鼠，测定合并用药的基线水平和合并用药的疗效趋势。

总体实验方案及流程见图1所示。

二、主要实验过程

1.实验菌种：

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，大肠埃希菌(ATCC25922)购买于中国国家菌种库。受试菌株冻干粉用无菌M-H(B)培养基混悬后均匀铺于无菌M-H(A)平板表面，35℃孵育过夜复活，18h后平板表面生长出菌苔，选取其中长势良好的单一菌团，重新涂抹于M-H(A)斜面，相同条件下孵育18h，密封，4℃条件下冷藏保存；试验前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育过夜，即可使用。所有操作均在超净工作台完成。

2.菌液制备方法

方法一：(高浓度菌液制备)

挑3～4个单菌落于40毫升的M-H(B)培养基中。受试菌隔夜增菌培养16小时(37℃，水浴摇床振摇16小时)，次日取出原菌液用全波长多功能读数议测OD值(细菌生长饱和期)；取20mL，分装于离心管中，每管2mL，离心10000～15000rpm/min，10分钟，弃取上清液之中的M-H(B)，用2mL生理盐水混匀后，再离心15000rpm/min，10分钟，弃取上清液中的生理盐水，收集细菌细胞菌体2mL。将相同方法培养的金色葡萄球菌和大肠埃希菌按1：1混合即获得4mL混合菌液。将该菌液为10⁰菌液浓度，用生理盐水进行10倍稀释，稀释至0.1×10⁰，0.01×10⁰，备用(共3个剂量)。

方法二：(低浓度菌液制备)

挑单一菌落(包括金色葡萄球菌和大肠埃希菌)于2毫升的生理盐水中，分别配制成为0.5麦氏浓度(约1×10⁸CFU·mL^－1)细菌混悬液，将金色葡萄球菌和大肠埃希菌混悬液混合，即得到混合菌液4mL。将该菌液设置成为10A菌液浓度，用生理盐水进行对倍稀释，稀释至0.5×10^A，0.25×10^A，备用(共3个剂量)。

3.药品与试剂：M-H(A)培养基(OXOID公司，生产批号：CM0337A)；M-H(B)培养基(OXOID公司，生产批号：CM0405B)；乌拉坦溶液(20％)；生理盐水(四川科伦药液股份有限公司，生产批号：M12012004)；其他试剂和耗材均由成都雅荣生化设备经营部购买提供。

4.仪器：电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司，BPH-9162)；优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司，UpK-1-10T)；微量加样器(EppendorfResearch，10、100、100uL)；空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发，HZQ-C)；自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂，LDZX-40BI)；全波长多功能读数议(美国Thermo)；菌落计数仪。

5.慢性盆腔炎模型制备

大鼠称重标记，腹部常规消毒，20％乌拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，用1mL注射器抽取预先制备的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10mL注射器磨去针头尖，于阴道底部的子宫颈分叉处小心进入一侧宫腔内，针头在宫腔内来回抽拉2次以机械性损伤子宫内膜组织，然后朝卵巢方向推注菌液0.1mL，同样操作步骤将0.1mL菌液注入另一侧子宫，注射完毕后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。分别于24h，48h观察记录各组大鼠感染情况，以大鼠无死亡，于造模后24h、72h、96h后分别阴道刮片，进行菌落培养，选择菌落计数≥30，≤100的感染菌量作为最佳感染菌量。将该菌量作为体内感染的菌量。受试大鼠感染菌量为表2所示：

表2

动物组别(n＝4)	感染菌量
		1	10<sup>0</sup>
2	0.1×10<sup>0</sup>
		3	0.01×10<sup>0</sup>
4	10<sup>A</sup>
		5	0.5×10<sup>A</sup>
6	0.25×10<sup>A</sup>

所有实验动物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常规消毒腹部，用无菌棉签伸入宫口，来回抽拉2次后，将棉签放入含2mL生理盐水的试管中，获得含测试品混悬液，取出棉签，再用新的无菌棉签充分蘸取混合液均匀涂抹于无菌M-H(A)平板表面，35℃孵育过夜，18h后进行菌落计数。240h牺牲动物，观察子宫感染情况。各组典型鼠感染菌落计数，结果如下表3：

表3受试大鼠感染菌量

动物组别(n＝4)	感染菌量
		1	10<sup>0</sup>
2	0.1×10<sup>0</sup>
		3	0.01×10<sup>0</sup>
4	10<sup>A</sup>
		5	0.5×10<sup>A</sup>
6	0.25×10<sup>A</sup>

所有实验动物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常规消毒腹部，用无菌落计数结果显示，3组鼠所感染菌量符合实验要求。同时，解剖后可见子宫等直观可见炎性充血与炎性水肿。实验确定，方法(一)为受试菌最佳培养方式；0.01×10⁰，为最佳感染菌量；实验方法可以复制大鼠盆腔细菌慢性感染模型。

6.大鼠血浆中阿奇霉素测定方法的构建

(1)HPLC-ECD

仪器：LC-30AUPLC(日本岛津)，AntecDecadeIII电化学检测器(荷兰安泰克)，色谱工作站(labsolution5.5)；QL-901涡旋混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)；MTN-2800W型氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；超低温冰箱(FIS13-990-16THERMOSCIENTIFIC)；H2050R台式冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；电子天平(北京赛多利斯有限公司)等。

动物：SPF级SD大鼠，220g±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所购得，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24。

药品及试剂：希舒美阿奇霉素片(Zithromax，辉瑞制药有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯FisherScientific)；甲酸(色谱纯成都市科龙化工试剂厂)；水为屈臣氏蒸馏水。阿奇霉素、罗红霉素标准品均购自中国食品药品生物制品检定所。

给药及取样：大鼠灌胃给予AZM CMC-Na混悬溶液(60mg/Kg)，分别于给药15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h取血0.2ml于肝素化离心管中，37℃水浴10-20分钟后，3500r/min离心10min，分离上清于-80℃保存。

液液萃取：取血浆50μL，加入10M NH₄OH溶液10μL，加入内标罗红霉素甲醇溶液(160ng/ml)10μL。加入2ml二乙醚，涡旋1min，静置3min，13300r/min离心5min，吸取上层有机相，30℃空气流下吹干，残留物加入150μL流动相溶解，涡旋1min，14000r/min离心3min，取30μL进行分析。

色谱条件：色谱柱Aglient poroshell120EC-C18(2.7μm×4.6×100mm)695975-902，在线滤器：SSI35-0149；流动相：乙腈-pH7.0磷酸缓冲溶液(45∶55，V/V)；流速0.8mL/min；柱温30℃。玻碳工作电极电位+1.2V，参比电极Ag/AgCl。

(2)HPLC-ESI-MS

仪器：岛津HPLC-MS2020，包括在线真空脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ESI、色谱工作站(labsolution5.5)；其余同HPLC-ECD方法下仪器。

色谱条件：色谱柱Aglientporoshell120EC-C18(2.7um×4.6×100mm)695975-902，在线滤器：SSI35-0149；流动相：乙腈-10mMpH5.2醋酸铵(65:35)，流速为0.2mL/min，进样量5μL。

质谱检测条件：电喷雾电离源(ESI)，选择性正离子检测(SIM)，阿奇霉素m/z749.5[M+H]⁺和内标罗红霉素m/z837.5[M+H]⁺，电离源电压4.5kV，喷雾气(N2)的流速为1.5L/min，脱溶剂温度为250℃，检测器电压1.5kv。

典型离子流图：AZM约6min，IS约8.4min。

图2所示为空白基质SIM总离子流图，图3所示为标准物质+空白基质SIM总离子流图。图4所示为典型低浓度样品SIM总离子流图。实验发现，两种方法以ESI检测较为灵敏，定量限可达15ng/ml，并可通过提高流速，以实现分析时间的缩短。同时考虑PPK拟以稳态药浓为主要检测对象，ECD应可基本满足定量需求。

7.IL-1β、LPS、TNF-α、NO检测方法

参照试剂盒使用说明书，进行相关检测。

(1)IL-1β

1、加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品(参照试剂盒使用说明书试剂准备)。空白孔加100μL(参照试剂盒使用说明书)，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2小时。

2、弃去液体，甩干，不用洗涤。

3、每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

4、弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1～2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。

5、每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

6、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。

7、每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在15～25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔梯度不明显时，即可终止)。

8、每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。

(2)LPS

1、加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5孔，依次加入50μL不同浓度的标准品(参照试剂盒使用说明书)。空白孔加50μL(参照试剂盒使用说明书)，余孔加待测样品50μL，然后立即每孔加检测溶液A工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

2、弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1～2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。

3、每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

4、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤2。

5、每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在15～25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的后面3孔有明显的梯度蓝色，前3孔梯度不明显时，即可终止)。

6、每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

7、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。

(3)TNF-α

1、加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品(参照试剂盒使用说明书)。空白孔加100μL(见试剂准备第二步最后一管)，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2小时。

2、弃去液体，甩干，不用洗涤。

3、每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

4、弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。

5、每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

6、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。

7、每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在15～25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。

8、每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。

(4)NO检测

1、NaNO₂标准液的稀释：

取试管7支，依次标号1～7。用滴定管1号依次向2～7号试管加入双蒸水1ml，用滴定管2号向1号试管加入NaNO₂标准液2ml，再用滴定管2号从1号试管吸出1ml液体加入2号试管，混匀，再吸出1ml液体加入3号试管，混匀。重复此步骤。当从6号试管吸出1ml液体时弃去。稀释步骤见图68。

2、用滴定管3号依次向1～7号试管加入1％磺胺0.5ml。

3、用滴定管4号依次向1～7号试管加入0.1％N-1-萘基乙二胺盐酸0.5ml。

4、依次混匀1～7号试管内液体，于常温下孵育20分钟。

5、用7号试管内液体作为对照组，用分光光度计分别测定1～6号试管内液体的吸光度值并记录。

6、用滴定管滴加液体时应注意每一只滴定管只能用于每一种试剂，切忌混用。

8.试验方法

模型及分组150只大鼠(雌性SPF级SD大鼠，220g±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所购得，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24)。16只用于空白，另行饲养。其余均采用造模方法麻醉后注射混合菌液。观察5日，每日均随机抽取6只及空白组2只麻醉后采集阴道分泌物用于细菌涂片。5日后存活大鼠随机分为5组，即model、AZM、AZMQR、AZMDG、AZMFF(分别表示不予治疗的模型组、单独使用阿奇霉素组、阿奇霉素清热合并组、阿奇霉素缺当归合并组、阿奇霉素全方合并组)。

Model：不予治疗的模型组；

AZM：阿奇霉素治疗模型组。

AZMQR：阿奇霉素+以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针按照妇科千金片配方中的比例和方法制得组合物联合治疗模型组。

AZMDG：阿奇霉素+以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、鸡血藤、党参按照妇科千金片配方中的比例和方法制得制得组合物联合治疗模型组。

AZMFF：阿奇霉素+妇科千金片(包括千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参成分，株洲千金药业股份有限公司出品)联合治疗模型组。

1.受试剂量

(1)AZM剂量：本实施例对阿奇霉素(AZM)的可选受试剂量进行了分析和确定，目的为选择一个试用后作用强度适中、时长适中的受试剂量，同时明确同中药合并用药时的时程长度。预试60、30、20、10mg/kg.d三天，发现原设定剂量过高，最终采用10mg/kg.d。

(2)受试药物剂量：

原设定妇科千金方全方(AZMFF)为2.058g/kg.d，但预试发现，此剂量采用最大给容积配制的给药液为稀浆状，无法通过灌胃针头。随调整最终全方AZMFF给药剂量为最大给药量1.66g/kg.d，调整缺当归组剂量DG为1.41g/kg.d、清热组剂量QR为1.16g/kg.d。

2.给药时间

除空白和模型外，造模后第六日开始给予相应药物。AZM与各中药分别给予，相差时间约2小时。所有给药组在8点左右均先给予相应剂量的AZM，两个小时后开始给予相应的中药生理盐水水混物。

3.样本收集

第1日给予AZM两小时后，经尾静脉采集各组大鼠末梢静脉血。从第二日始各给药组大鼠每日两次采血，于给予阿奇前和给予中药前各经尾静脉采集一次，每次采集血量约0.3mL，取样时间误差约30min。于给药第2、4、6、8日给予AZM两小时后，各组麻醉后牺牲约2～4只大鼠，采集下腔动脉抗凝全血，并同时收集牺牲大鼠的靶器官(子宫、孵巢、胸腺、脾脏)。

4.送样测试

所有时间点0.3mL及末次全血，分取约0.2mL血浆用于UPLC-MS检测AZM浓度。末次抗凝全血送检血细胞计数、血流变。末次血浆用于检测LPS、TNF-α、NO。子宫、孵巢、胸腺、脾脏称重并计算脏器系数。子宫从子宫体中部切分，取1/2福尔马林固定后用于病理送检。

实验结果：

图5至图13所示结果表明，实验动物造模后，全血低切还原粘度、全血粘度和红细胞聚集指数，与正常组比较均升高，给予不同的药物组合治疗后，各指数都降低，趋向于回复正常水平。各治疗组之间的治疗效果比较，全血低切还原粘度：AZMFF>AZM>AZMDG>AZMQR；全血粘度：AZMFF>AZMDG>AZMQR>AZM；红细胞聚集指数：AZMDG>AZM>AZMFF>AZMQR。以上结果表明，表明活血化瘀药在血液流变状态改变中起主要作用，可以改善“血瘀”这一病理状态。

血细胞计数及分类实验结果见图14至图29所示。

图30至图34所示结果表明，实验动物造模后，4种脏器的脏器系数与正常组比较均升高，给予不同的药物组合治疗后，各系数都降低，趋向于回复正常水平。各治疗组之间的治疗效果比较，子宫脏器系数：AZMDG>AZMQR>AZMFF>AZM；卵巢脏器系数：AZM优于其他，脾脏脏器系数：难以比较，胸腺脏器系数：AZMFF>AZMDG>AZM>AZMQR。以上结果表明，表明慢性盆腔炎模型大鼠子宫、卵巢、脾脏和胸腺四种脏器由于炎症反应，导致脏器充血、水肿，脏器系数增加；在给予抗菌消炎药后，脏器系数均趋于恢复正常水平，但四种药物之间的作用强度难以比较。

脏器系数又称脏体比，是实验动物某脏器的重量与其体重之比值。正常时各脏器与体重的比值比较恒定。动物染毒后，受损脏器重量可以发生改变，故脏器系数也随之而改变。脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。图35至图37所示结果表明，实验动物造模后，3种炎症因子水平与正常组比较均明显升高，给予不同的药物组合治疗后，各系数都降低，趋向于回复正常水平。各治疗组之间的治疗效果比较，血浆内毒素：AZMQR>AZMDG>AZM>AZMFF；血浆一氧化氮：AZMDG、AZMQR>AZMFF>AZM，血浆肿瘤坏死因子：AZMFF>AZM>AZMDG>AZMQR。以上结果表明，表明慢性盆腔炎模型大鼠血浆内毒素、血浆一氧化氮、血浆肿瘤坏死因子由于感染和炎症的发生，导致这三种炎症因子大量产生，使其水平高于正常值；在给予药物治疗后，炎症因子水平均趋于恢复正常水平，四种药物之间的作于强度大致为：AZMQR>AZMDG>AZMFF>AZM。

9.药代动力学实验

采用Kinetica5计算了相关双次给药的药时曲线及分布域，实验结果见图38和图39。结果表明，每日给予AZM两小时后再给予中药各组基本不影响相关生物利用度。清热组后期略有降低其生物利用度趋势，但这一作用可被复方中的活血组药物引入而抵消，表明复方配伍可能有未知的一些体内影响。

10.群体药动学-群体药效学联合模型的建模

1.基本途径包括以下步骤：

S41.建立AZM的PPK模型；

S42.确定综合表达总体药效的线性空间或在各个药效指标中选择一个各组方协同作用较明显的指标作为PD输出值；

S43.确定合适的PD指标量化模型，建立截断数据的PPD模型；

S44.分析阿奇霉素组织分布、抗菌类型、感染与炎症关系的量化因素，确定合适的PPK-PPD联接方式；

S45.建立基于作用机制的妇科千金方组合物以及方中各活性成分组对阿奇霉素协同作用的合并用药PPK-PPD综合模型，计算相应模型参数；

S46.对得到的模型参数进行相关假设检验及区间估计，完成评价。

其中，步骤S45所述建立PPK-PPD综合模型和计算相应模型参数的方法是：参照Kinettica及monolix软件进行整体模型的建立。各节点调整相应参数后，对前后计算结果进行AIC和Log likelihood值比对，设置相应适当的计算参数。使用非线性混合效应模型分析全体药物动力学过程，可估计动力学参数的群体分布及由于生理和病理(固定效应和协变量)对个体间变异的贡献。分析算法主要为EM法，E为条件期望贝叶斯估计，M为最大似然估计。条件期望贝叶斯估计时假设群体中药物动力学参数具有已知的先验分布(均数±方差)，同时亦假设残余误差分布(均值±方差)已知，在所述条件下对个体药物动力学参数进行估计；最大似然估计以条件期望贝叶斯估计的个体参数为初值，以最大似然估计法求算群体均值及方差。EM算法迭代进行时以前后两次模型修正的模型显著性改变为评价标准，前后两次计算模型参数改变无显著性则运算终止。

2.计算方法见图40至42所示。

3.PPK/PPK模型的建立

3.1总体药效空间的投影设定

药物作用后用于评价的药效指标繁多，如何进行综合性评价及选择何种药效指标进行量化评价具有天然的困难性和偏颇性。因此，为实现无人为主观选择及偏好的综合评价，本发明采用PCA-DA、PLS-DA和OPLS-DA将进行药效评价的所有时间段中的样本进行基于所有测定的生理及药理指标的多变量分类识别，并将所有样本的所有药效按照非监督的分类空间进行二次投影，以形成能反映综合药效的可用于PPD的样本空间，并对组成样本空间的高权重分类标志进行区分。

分析方法：数据分析采用R version 3.1.2(R Core Team；2014 R:A Languageand Environment for Statistical Computing；R Foundation for StatisticalComputing,Vienna,Austria；URL:https://www.r-project.org),PCA-DA,PLS-DA,andOPLS-DA in package MUMA(Metabolomics Univariate and Multivariate Analysis,Ver1.4；Edoardo G,Francesca C,Dimitrios S,Silvia M,Andrea S,and Michela G,2012)，Rpackage version 1.4.https://cran.r-project.org/web/packages/muma/index.html).

(2)原始数据构成：分析矩阵每行为一样本，列组成由各时间点体重、取样进脏器重量、脏器系数、血细胞计数各值、血流变各值、炎症指标各值组成，矩阵大小84*44。

(3)分析结果：采用PCA-DA,PLS-DA,and OPLS-DA分析表明，药效指标可压缩为4主成分(见图43所示)，压缩后能反映总体药效指标的信息百分率约为80％，可反映绝大多数组间药效作用变异。

(4)药效空间的重组和各样本投影值的计算：将各样本在以上四主成分空间各维度坐标值作为位置向量X＝(X1，X2，X3，X4)，以各维度反映原药效空间的信息量作为权重向量W＝(w1，w2，w3，w4)，以空白对照组各样本点X的平均为符号向量N，定义各样本投影值为：sgn((X-N).W)*(X.W)(其中sgn为符号函数)。绘制所得投影值在取样时间轴上的动力学分布图如图44所示，结果表明药效空间重组与各样本重投影后所得距离值可反映整体药效空间随时间的动力学变化，具有明确的规律性。此投影距离可用于综合反映药效的药效代表值。

(5)高分辨率的药效指标：对1，2主成分的构成比进行分析(如图45所示)，明显可见各组间药效变异的主体指标为炎症(右下角：LPS，NO，TNF)和血流变指标(右下角：全血低切还原粘度；左上角：全血高切相对粘度，红细胞刚性指数，红细胞变性指数)。其它血细胞计数、体重、脏器指数在各组间变异极小，不构成反映最终疗效的评价指标。

(6)PD指标的确定:综上所述，采用各样本在以上四主成分空间的投影距离形成最终用于计算的各样本PD指标(如下表4所示)。

表4各样本在线性变化的药效空间的投影距离(信息量79.29％)

3.2 PPK/PPD模型的构建

(1)数据分析的建模软件：ADAPT 5.1、Kinetica5.5、Monolix4.3.3 withinMatlab2014A和R version 3.1.2 with package saemix 1.2(Comets E,Lavenu A,Lavielle M.SAEMIX,an R version of the SAEM algorithm.20th meeting of thePopulation Approach Group in Europe,Athens,Greece(2011),Abstr 2173.http://www.page-meeting.org/default.asp？abstract＝2173)。

(2)PK模型：汇总全样本药时曲线，分别进行分别进行一、二、三室房室模型和反向高斯模型拟合，按模型优度和PPK-PPD模型参数拟合总体优度进行PPK基础模型的选择。

(3)PD模型：从样本PD指标的动力学分布图可见，空白组PD指标随时间变异小，保持近拟线性常态稳定，符合无造模攻击等生理稳态特点；模型组造模攻击后有一定自发恢复现象，对其动力学进行多种曲线模式拟合，结果表明线性增长模型AIC及BIC值均较小，可用于描述相关动态过程。模型组PD指标的动力学变化可视为从病理改变度与生理正常值的改变度。各药物干预组PD曲线是采用药物干预模型组PD空间曲线的宏观反应。模型化的描述这一现象即：模型组PD＝生理PD函数-病理PD函数；各治疗组PD＝生理PD函数-病理PD函数+药物作用函数。药物作用函数考察微分和积分变化。

(4)模型的联结：AZM属于典型的时间依赖性抗生素，即杀菌活性与其同细菌接触的持续时间成正比，即药物的抗菌疗效取决于药物在组织中浓度维持在MIC以上的持续时间。因此本发明考察直接联结和效应室联结的作用部位累加模型，根据拟合优度选择联结方式。

(5)模型参数的概率分布：考察所有模型参数的正态、对数正态、logit的分布组合，选择较优的参数概率分布函数；

(6)协变量模型：确定结构模型和模型参数的概率分布后，计算个体参数与体重、合并用药组别分类的图形分布，选择多种协变量模型拟合，评价拟合优度与假设检验结果，并结合协变量参数分布图选择较有意义的协变量模型。

(7)误差模型：确定结构模型和模型参数的概率分布后，浓度及药效输出的拟合结果对测量值进行误差分布图形检查，选择恰当的模型。

(8)模型参数的随机效应误差协方差模型：为简化工作流程，固定协方差矩阵为对角矩阵，不进行选择与优化。

3.3计算方法

(1)数据：结构模型确定时仅使用给予AZM的四组平均浓度-效应数据，可显著降低机时；确定参数分布概率模型时，采用全体样本，含空白及模型组；确定协变量模型和误差模型时，采用给予AZM的四组全体样本。

(2)初始值：程序迭代的收敛性显著决定于初始值的设定，计算时模型各分块分别计算平均组内值，作为全模型的初始值。

(3)迭代算法：SAME、ML并结合MCMC和BOOTSTRAP验证(样本数随机重复抽样，组成计算例500样本)。

3.4采用的总体模型

(1)总体结构模型设定如图46(结构模型框图)所示。

(2)结构模型：

Structure Model：

pysocolog y(t)＝pysoA+pysoB·t

hazards(t)＝hazaA+hazaB·t

Dose(0)＝f·Dose

Ac(0)＝0

Ad(0)＝0

Effect＝physocolog y(t)-hazrads(t)+Drug(t)

Output＝{Cc，Effect}

(3)协变量模型：

Covariate Model：

(4)非协变量模型参数的概率分布：

other parameters distribution：

(5)误差模型：

residual error Model：

y1＝Cc

y2＝Effect

(6)协方差模型：对角阵，即各模型参数随机效应间无相关性，独立分布。

(7)生物学意义：药动模型以InverseGaussin模型拟合较好，但联结PD后模型收敛性差，因此最终确定二房室模型。药效如前所示分解为三部，分别反映生理状态，病理状态和药物的累加改善。其中生理和病理函数选择为线性模型，拟合结果较好的反映了空白对照组和模型对照组的时变规律，其后计算中其模型群体参数固定，设定其概率分布均为正态分布。根据AZM特点和药效空间投影的时间累加性，比较多种联结模型后选择直接联结的药效部位药物累加量模型，即AZM的药效作用是药效作用靶位的富积药量值的函数，函数形式为Emax模型。回归变量为时间t和靶位重量(uterus，以样本取样时子宫重量计)，体重为连续性协变量，组别为分类性协变量(其中AZM组别编号为2，QR为3，DG为4，FF为5，空白为0，模型组为1)。组别协变量以组2为参比组，即群体值为AZM组的代表值。

3.5模型参数拟合和验证

(1)采用one-in and one-out双向比较方法进行多次计算，并与协变量全作用与全不作用的模型拟合图对照和比较相应参数(其余拟合图见相应文件包，此正文中为减小篇辐不列出)，确定最终模型的中的协变量模型。各组平均值对全模型的拟合结果如图47所示，可见模型对各样本组平均浓度与效应值进行较为充分的结构及作用特点解释。

(2)以上文描述的模型对全体样本进行参数拟合，并采用BOOTSTRAP法，进行模型验证。结果见图53至图66所示。由图53至图66可见，模型拟合结果良好、稳健，对各样本和PK-PD特征进行了较精确的数量表征。协变量和模型参数的误差分布图也表明，设定的协变量模型和误差分布能反映影响最终药代特点和药效特点的变化关系，可以此基础上对合并用药及生理因素影响最终药代和药效作用进行量化解析。

4.6模型参数拟合结果

对全体样本进行如上描述模型的参数拟合，条件概率分布的参数最终迭代值反映模型信息量的AIC和BIC值均小于-10^⁴，群体参数拟合结果见表5所示。

表5模型拟合的参数值

上述实验结果表明：

1.实验动物模型的制备：本发明所建立的慢性盆腔炎动物模型，分别于造模后24h，72h，96h后阴道刮片，进行菌落培养，菌落计数结果显示，各组大鼠所感染菌量符合实验要求。解剖后模型大鼠子宫直观可见明显炎性充血肿胀，多数宫腔迂曲扩张，末端膨大，表明采用该方法可成功复制大鼠慢性盆腔炎模型，为后续实验开展提供可靠保证。

2.大鼠血浆中阿奇霉素测定方法：本发明所采用的HPLC-MS方法测定大鼠血浆中的AZM浓度，该方法选择性好，具有良好的线性、精密度、准确度，样品分析时间短，检测灵敏度高，定量限可达15ng/ml，为后续AZM在大鼠体内的药代动力学研究提供有效方法。

3.合并用药对阿奇霉素药物动力学的影响：与单独使用AZM组相比，合并用药各组阿奇霉素的药动学参数CLt、V1、CLd、V2和MIT均无显著影响(P>0.05)，主要药动学参数见表6所示。此研究结果说明，妇科千金片整方及各拆方组合不明显影响阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的药物动力学特征，证明妇科千金片在临床上可与阿奇霉素联合应用于慢性盆腔炎等疾病的治疗。

表6单独使用AZM组与合并用药组多次给药后阿奇霉素主要药动学参数(n＝10)

4.不同药物组药效综合评价

本发明已对各药效指标在各组间的差异进行说明，由于药物作用后用于评价的药效指标繁多，不能仅通过某一或某几个指标的变化说明机体状态的改善，本发明进一步通过科学的统计学方法，从众多的指标中选择合理的指标对总体药效进行综合性量化评价。采用PCA-DA、PLS-DA、and OPLS-DA分析表明，药效指标可压缩为4主成分，压缩后能反映总体药效指标的信息百分率约为80％，可反映绝大多数组间药效作用变异。将各样本在以上四主成分空间各维度坐标值作为位置向量X＝(X1，X2，X3，X4)，以各维度反映原药效空间的信息量作为权重向量W＝(w1，w2，w3，w4)，以空白对照组各样本点X的平均为符号向量N，定义各样本投影值为：sgn((X-N).W)*(X.W)(其中sgn为符号函数)。绘制所得投影值在取样时间轴上的分布图，即PD指标的动力学分布图，见图67所示。

结果表明药效空间重组与各样本重投影后所得距离值可反映整体药效空间随时间的动力学变化，具有明确的规律性。此投影距离可用于综合反映药效的药效代表值。从样本PD指标的动力学分布图可见，空白组PD指标随时间变异小，保持近拟线性常态稳定，符合无造模攻击等生理稳态特点；模型组造模攻击后有一定自发恢复现象，对其动力学进行多种曲线模式拟合，结果表明线性增长模型AIC及BIC值均较小，可用于描述相关动态过程，模型组PD指标的动力学变化可视为从病理改变度与生理正常值的改变度；各药物干预组PD曲线是对药物干预模型组PD空间曲线的宏观反应。模型化的描述这一现象即：模型组PD＝生理PD函数-病理PD函数；各治疗组PD＝生理PD函数-病理PD函数+药物作用函数。结果显示，实验动物造模后，机体综合特征与正常组比较发生明显改变，给予不同的药物组合治疗后，综合药效均随治疗时间的延续，趋向于回复正常水平。各药物组之间的治疗效果比较，各组总体药效水平相当，无明显差异性。

5.PPK/PPD模型的构建及评价

药动模型以InverseGaussin模型拟合较好，但联结PD后模型收敛性差，因此最终确定二房室模型。药效如前所示分解为三部，分别反映生理状态，病理状态和药物的累加改善。其中生理和病理函数根据图46选择为线性模型，拟合结果较好的反映了空白对照组和模型对照组的时变规律，其后计算中其模型群体参数固定，设定其概率分布均为正态分布。根据AZM特点和药效空间投影的时间累加性，比较多种联结模型后选择直接联结的药效部位药物累加量模型，即AZM的药效作用是药效作用靶位的富积药量值的函数，函数形式为Emax模型。

表7拟合模型群体参数计算结果

(1)合并用药对AZM药动学的影响

由最终确定的结构和协变量模型可见，合并QR、DG和FF组不会对AZM的吸收、分布及排泄参数产生可定量的有显著性的较大影响。

(2)合并用药对AZM药效学的影响

由最终确定的结构和协变量模型可见，合并不对AZM EC₅₀产生明确可测量的影响，但各组均会增强最终的E_max值，E_max_pop＝5.96，QR影响率为e^^0.209＝1.23，DG影响率为e^^0.416＝1.51，FF影响率为e^^0.3＝1.17，即合并QR后AZM的表观最大效应增强1.23倍，其余组效应均相似，倍率也相似。

以InverseGaussin模型对阿奇霉素在各组实验动物体内的药动学参数进行拟合，结果合并用药各组对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的药动学参数无明显影响；结合PPK-PPD模型计算结果，三个合并用药组对阿奇霉素的组织分布具有增强作用，且这种作用强度在AMZQR、AMZDG、AMZFF三组中的倍率相当。此研究结果说明，妇科千金片整方及各拆方组合不明显影响阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的药物动力学特征，提示妇科千金片在临床上可与阿奇霉素联合应用于慢性盆腔炎等疾病的治疗。合并用药不对阿奇霉素EC₅₀产生明确可测量的影响，即但各组均会增强最终的E_max值，三个合并用药组对阿奇霉素E_max的增强效应及倍率相似。结合合并用药组和单独应用阿奇霉素组在药动学和总体药效学上的差异性，三个合并用药组在药动学和药效学上与单独使用阿奇霉素组相比，三者对药动学参数的改善及药效的增强总体作用水平相当。合并用药各组对阿奇霉素总体药效具有一定的增强作用。

本发明通过PPK/PPD模型定量研究妇科千金方不同药物组对阿奇霉素药动学及药效学的影响，创新性地将指导临床用药的PPK/PPD模型，拓展延伸用于中药复方的组方研究中，可定量研究不同因素(如：不同组方药物组)对群体药动/药效参数的影响，为临床合理用药提供指导；同时明确了妇科千金方中发挥抗炎功效的主要药物群，为对中药创新制剂研究，以及妇科千金方的二次开发具有重要意义，为中药组方研究提供一个新的可借鉴方法。

Claims (6)

1.一种中西联用药物组合物PPK-PPD(population pharmacokinetic-populationpharmacodynamic，群体药代动力学-群体药效动力学)模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

S31.建立已确认疗效的西药的PPK模型；

S32.确定综合表达总体药效的线性空间或在各个药效指标中选择一个各组方协同作用较明显的指标作为PD(pharmacodynamic，药效动力学)输出值；将进行药效评价的所有时间段中的样本进行基于所有测定的生理及药理指标的多变量分类识别；并将所有样本的所有药效按照非监督的分类空间进行二次投影，形成能反映综合药效的PPD样本空间，对组成样本空间的高权重分类标志进行区分；

S33.确定合适的PD指标量化模型，建立截断数据的PPD模型；

S34.分析组织分布、抗菌类型、感染与炎症关系的量化因素，确定合适的PPK-PPD联接方式；

S35.建立基于作用机制的中药对阿奇霉素协同作用的合并用药PPK-PPD综合模型，计算相应模型参数；所述中药为妇科千金方组合物以及方中各活性成分组；

其中，所述妇科千金方组合物为：以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针为活性成分组成的中药组合物；

或者以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、鸡血藤、党参为活性成分组成的中药组合物；或者以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、鸡血藤、当归、党参为活性成分组成的中药组合物；

S36.对得到的模型参数进行相关假设检验及区间估计，完成评价。

2.根据权利要求1所述中西联用药物组合物PPK-PPD模型的建立方法，其特征在于，步骤S35所述建立PPK-PPD综合模型和计算相应模型参数的方法是：参照Kinettica及monolix软件进行整体模型的建立；各节点调整相应参数后，对前后计算结果进行AIC(Akaikeinformation criterion，赤池信息量准则)和Log likelihood值比对，设置相应适当的计算参数；使用非线性混合效应模型分析全体药物动力学过程，可估计动力学参数的群体分布及由于生理和病理对个体间变异的贡献；分析算法主要为EM法，E为条件期望贝叶斯估计，M为最大似然估计；条件期望贝叶斯估计时假设群体中药物动力学参数具有已知的先验分布，同时亦假设残余误差分布已知，在所述条件下对个体药物动力学参数进行估计；最大似然估计以条件期望贝叶斯估计的个体参数为初值，以最大似然估计法求算群体均值及方差；EM算法迭代进行时以前后两次模型修正的模型显著性改变为评价标准，前后两次计算模型参数改变无显著性则运算终止。

3.根据权利要求1所述中西联用药物组合物PPK-PPD模型的建立方法，其特征在于，所述模型的原始数据构成是分析矩阵每一行为一样本，列组成由各时间点体重、取样的脏器重量、脏器系数、血细胞计数各值、血流变各值、炎症指标各值组成，矩阵大小84*44。

4.权利要求1至3任一项所述方法在妇科千金方组合物与阿奇霉素联用评价中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于妇科千金方组合物与阿奇霉素合并用药时对阿奇霉素药动学的影响结果。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于妇科千金方组合物与阿奇霉素合并用药时对阿奇霉素药效学的影响结果。