CN106635863A - 厌氧降解处理采油废水的梭菌属菌株yb‑7的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种厌氧降解处理采油废水的梭菌属菌株YB‑7的培养方法。将活性污泥经过梯度稀释后选择10‑6~10‑8浓度的菌液采用平板涂布法涂布于强化梭菌培养基中，然后置于厌氧培养箱中于37℃下分离培养7天，接着从强化梭菌培养基中挑选长势好、形态各异的单菌落，分别采用划线培养法接种于新的强化梭菌培养基中，然后置于厌氧培养箱中于37℃下培养7天，即筛选得到梭菌属菌株，其菌落白色，不规则形，表面光滑，不透明，边缘不整齐，命名为YB‑7，然后对YB‑7分别进行三次纯化培养，得到无其他杂菌干扰的纯的梭菌属菌株YB‑7。本发明所培养的梭菌属菌株YB‑7对采油废水的厌氧降解处理效果良好，便于推广应用。

Description

厌氧降解处理采油废水的梭菌属菌株YB-7的培养方法
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，特别涉及一种厌氧降解处理采油废水的梭菌属菌株YB-7的培养方法。
背景技术
采油废水主要是石油开采、储藏、运输、脱水和再利用过程中产生废水的混合物。采油废水成分复杂，主要含有淤泥和泥沙等固体悬浮物、溶解的油质、苯的有机物、硫化氢、铜和镍等重金属以及硫酸盐等组分，同时其具有COD含量高、BOD含量低、毒性高和溶解性油难去除等特点，因此属于难降解废水。采油废水的组分是持续变化的，这主要与所提炼油的性质、阶段和油水层的地质特征有关，所以如何利用现有技术高效稳定环保的处理采油废水是企业所关注的焦点。如今，采油废水的物化处理方法主要包括电化学法、吸附法、臭氧法、絮凝法和催化法，但是物化处理工艺存在高能耗、低产率和二次污染等问题，并不符合国家节能环保的要求。相比之下，生物法效率高投入低，处理效果稳定。目前主要的生物处理法包括活性污泥法、生物膜法、厌氧-好氧法和自然人工湿地处理法，重视并应用生化处理技术是国内外采油废水处理的趋势。
生物处理工艺中厌氧法可以稳定有机物密度和种类，有一定的抗冲击负荷能力；好氧法则可以彻底的去除废水中的有机物。虽然厌氧法或者好氧法均能处理废水，但是单一的好氧或者厌氧工艺均存在一定的局限性。为了更好的处理废水中的有机物，越来越多的研究者将两个或两个以上工艺组合起来，以提高废水的处理效果。本研究中的采油废水处理厂采用ABR-SBR联用工艺，COD、石油类、SS、S2-的去除率分别为83-94%，78-92%，99%和94%，出水达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级排放标准。因此，本文从ABR活性污泥池内筛选出高效石油降解厌氧菌株，为下一步构建高效除油菌剂提高采油废水的处理效果具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种厌氧降解处理采油废水的梭菌属菌株YB-7的培养方法。
具体步骤为：
(1)将活性污泥经过梯度稀释后选择10-6~10-8浓度的菌液采用平板涂布法涂布于强化梭菌培养基中，并将强化梭菌培养基置于厌氧培养箱中于37℃下分离培养7天，待选备用。
(2)从步骤(1)所得的待选备用的强化梭菌培养基中挑选长势好、形态各异的单菌落，分别采用划线培养法接种于新的强化梭菌培养基中，然后将强化梭菌培养基置于厌氧培养箱中于37℃下培养7天，即筛选得到在强化梭菌培养基中生长良好的梭菌属菌株，其菌落白色，不规则形，表面光滑，不透明，边缘不整齐，命名为YB-7，然后对YB-7分别进行三次纯化培养，得到无其他杂菌干扰的纯的梭菌属菌株YB-7。
所述活性污泥为采油终端处理厂的厌氧折流板反应器中的污泥，即AnaerobicBafflted Reactor中的污泥，简称ABR污泥。
所述强化梭菌培养基的组成如下：牛肉浸出粉9~11g/L，胨9~11g/L，酵母浸出粉2~4g/L，可溶淀粉0.5~1.5g/L，葡萄糖4~6g/L，盐酸半胱氨酸0.5~1g/L，氯化钠4~6g/L，醋酸钠2~4g/L，琼脂的质量百分数含量为2%；该强化梭菌培养基的pH值6.8±0.2。
所述梭菌属菌株YB-7现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2016年03月15日，保藏编号：CGMCC No.12213，分类命名：梭菌Clostridium sp.；其菌体形态和分子生物学特征：菌体杆状，0.4~0.5μm×2.5~4.0μm，单个或成堆排列，芽胞中生，柱状，胞囊不膨大，革兰氏阳性。
本发明方法操作简单，所培养的梭菌属菌株YB-7对采油废水的厌氧降解处理效果良好，对采油废水中的TOC的降解率在40%以上，且成本低廉，便于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例中得到的梭菌属菌株YB-7的菌落形态示意图。
图2为本发明实施例中得到的梭菌属菌株YB-7的显微镜菌体形态示意图。
图3为本发明实施例中得到的梭菌属菌株YB-7的序列信息。
图4为本发明实施例中得到的梭菌属菌株YB-7与相关种的16S rDNA序列系统发育树图。
具体实施方式
实施例：
本实施例以广西北海涠洲岛中海油终端处理厂的ABR（Anaerobic Bafflted Reactor，厌氧折流板反应器）中的活性污泥为样品具体实施，完整展现梭菌属菌株YB-7的筛选、鉴定及其厌氧降解处理采油废水的应用。
(1)将活性污泥经过梯度稀释后选择10-7浓度的菌液采用平板涂布法涂布于强化梭菌培养基中，并将强化梭菌培养基置于厌氧培养箱中于37℃下分离培养7天，待选备用。
(2)从步骤(1)所得的待选备用的强化梭菌培养基中挑选长势好、形态各异的单菌落，分别采用划线培养法接种于新的强化梭菌培养基中，然后将强化梭菌培养基置于厌氧培养箱中于37℃下培养7天，即筛选得到在强化梭菌培养基中生长良好的梭菌属菌株，其菌落白色，不规则形，表面光滑，不透明，边缘不整齐，如图1所示，命名为YB-7，然后对YB-7分别进行三次纯化培养，得到无其他杂菌干扰的纯的梭菌属菌株YB-7。
所述强化梭菌培养基的组成如下：牛肉浸出粉10g/L，胨10g/L，酵母浸出粉3g/L，可溶淀粉0.5g/L，葡萄糖5g/L，盐酸半胱氨酸0.5g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，琼脂的质量百分数含量为2%；该强化梭菌培养基的pH值6.8。
通过显微镜观察本实施例得到的梭菌属菌株YB-7的菌体形态，如图2所示，菌体杆状，0.4~0.5μm×2.5~4.0μm，单个或成堆排列，芽胞中生，柱状，胞囊不膨大；然后进行革兰氏染色鉴定，经过初染、媒染、脱色、复染后，将载玻片覆上盖玻片，置于Classica E220LED双目光学显微镜100×油镜下观察，鉴定其为革兰氏阳性。
对本实施例得到的梭菌属菌株YB-7采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行菌株基因组DNA的提取，操作步骤按说明书进行。DNA样品的浓度通过Quawell Q5000超微量紫外分光光度计检测，同时用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并在Gel DocTM XR+成像仪上显像。对梭菌属菌株YB-7采用FMIC-QO01-002细菌16S rDNA检测方法进行分子生物学鉴定，得到的碱基序列在GeneBank数据库中比对，用比对的结果构建系统发育树。结果表明，YB-7为梭菌属（Clostridium sp.）的一个潜在新种，菌株的序列信息和16S rDNA序列系统发育树分别如图3和图4所示。将所得梭菌属菌株YB-7送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2016年03月15日，保藏编号：CGMCC No.12213，分类命名：梭菌Clostridium sp.。
将本实施例培养的梭菌属菌株YB-7在新的强化梭菌培养基中富集，置于厌氧培养箱中于37℃下培养7天，制得富集菌液，将制得的富集菌液接种到采油废水中，富集菌液和采油废水的体积比为1:150，然后在37℃下恒温厌氧培养96h，即完成对采油废水的厌氧降解处理，结果如下：采油废水TOC含量为112.30~147.10 mg/L，COD含量为451~496 mg/L，pH值在7.76~7.91之间，37℃恒温厌氧培养96h后取10ml作为检测样品，使用Multi N/C3100测定仪测定采油废水中TOC含量在接种前后的变化情况，结果表明，梭菌属菌株YB-7对于采油废水的TOC降解率为42.8%。

Claims (1)

1.一种厌氧降解处理采油废水的梭菌属菌株YB-7的培养方法，其特征在于具体步骤为：
(1)将活性污泥经过梯度稀释后选择10-6~10-8浓度的菌液采用平板涂布法涂布于强化梭菌培养基中，并将强化梭菌培养基置于厌氧培养箱中于37℃下分离培养7天，待选备用；
(2)从步骤(1)所得的待选备用的强化梭菌培养基中挑选长势好、形态各异的单菌落，分别采用划线培养法接种于新的强化梭菌培养基中，然后将强化梭菌培养基置于厌氧培养箱中于37℃下培养7天，即筛选得到在强化梭菌培养基中生长良好的梭菌属菌株，其菌落白色，不规则形，表面光滑，不透明，边缘不整齐，命名为YB-7，然后对YB-7分别进行三次纯化培养，得到无其他杂菌干扰的纯的梭菌属菌株YB-7；
所述活性污泥为采油终端处理厂的厌氧折流板反应器中的污泥，即AnaerobicBafflted Reactor中的污泥，简称ABR污泥；
所述强化梭菌培养基的组成如下：牛肉浸出粉9~11g/L，胨9~11g/L，酵母浸出粉2~4g/L，可溶淀粉0.5~1.5g/L，葡萄糖4~6g/L，盐酸半胱氨酸0.5~1g/L，氯化钠4~6g/L，醋酸钠2~4g/L，琼脂的质量百分数含量为2%；该强化梭菌培养基的pH值6.8±0.2；
所述梭菌属菌株YB-7现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2016年03月15日，保藏编号：CGMCC No.12213，分类命名：梭菌Clostridium sp.；其菌体形态和分子生物学特征：菌体杆状，0.4~0.5μm×2.5~4.0μm，单个或成堆排列，芽胞中生，柱状，胞囊不膨大，革兰氏阳性。
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