CN106620647B - 微囊藻毒素-lr在制备预防和治疗肺纤维化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微囊藻毒素‑LR的医药用途，尤其是微囊藻毒素‑LR在制备预防和治疗肺纤维化的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明经过验证，微囊藻毒素‑LR可以改善由博来霉素引发的肺纤维化状态。微囊藻毒素‑LR可抑制博莱霉素引发的肺纤维化相关分子TGF‑β、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、NF‑κB、ET‑1 mRNA表达的升高。微囊藻毒素‑LR可抑制博莱霉素引发的肺组织VEGF mRNA表达的增高。微囊藻毒素‑LR通过TGF‑β/Smad通路及抑制血管生成等途径，干预并缓解博莱霉素诱导大鼠肺纤维化。为制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物提供新的途径。

Description

微囊藻毒素-LR在制备预防和治疗肺纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明涉及微囊藻毒素-LR的医药用途，尤其是微囊藻毒素-LR在制备预防和治疗肺纤维化的药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多种原因引起的严重肺间质慢性疾病。根据病因可分为继发性肺纤维化(Secondary pulmonary fibrosis，SPF)和特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)。前者病因明确，代表性病种有尘肺、矽肺、石棉肺，及自身免疫性疾病相关的肺纤维化等；后者病因不明确，是目前临床干预乏术的常见肺疾病。IPF作为一种慢性炎症性间质性肺疾病，主要表现为成纤维细胞灶的出现，大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积，胶原积聚，最终导致正常肺组织构型改变，肺泡结构破坏，是一种慢性、进行性、不可逆转的肺结构改变，是一种高死亡率的临床肺疾病[1]。流行病学研究显示，IPF发病率呈不断上升趋势，由于发病机制不清，目前没有确切有效的治疗方法，临床也缺乏特异性的治疗药物[2]，病情一般持续性进展，最终多死于呼吸衰竭[3]，因此寻找有效的干预靶点和治疗药物十分重要。

在整个IPF发生过程中，尤其是疾病早期的炎症阶段，诸多细胞因子也参与其中。从某种意义上说，肺纤维化的发生是从上皮细胞受损、炎症细胞浸润和细胞因子网络调控失衡开始，进而成纤维细胞增殖、胶原纤维沉积。。对IPF患者肺组织研究发现，TGF-β在肺纤维化早期主要是由肺泡巨噬细胞分泌，当出现成纤维细胞灶时，增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞上调TGF-β表达。TGF-β是目前已知最强的促ECM积聚诱导因子，也是肺纤维化形成机制研究的热点分子和治疗药物开发的一个重要干预靶点。近十年研究表明，TGF-β可以促使上皮间质转化(epithelial-mesenehymal transition，EMT)[4，5，6]和成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，进而导致ECM积聚。研究表明用特异TGF-β抑制剂可明显下调肺纤维化相关指标[7]。同时TGF-β还可刺激成纤维细胞合成ECM、抑制基质蛋白酶的酶解、抑制肌成纤维细胞凋亡，这些作用都会进一步导致肺纤维化的发生和发展。

TNF-α是临床检验肺纤维化的一个重要指标。在纤维化的肺部组织中，发现TNF-α大量增殖，TNF-αmRNA的水平高于正常肺组织[8]。Liu等[9]研究发现，TNF-α和IL-1β不但直接促进纤维化的发生，而且促进纤维蛋白溶酶原抑制物Ⅰ的产生，抑制ECM降解。在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，内源性的TNF-α过量表达能促进肺纤维化。此外，当TNF-α与膜受体结合后还可激活胞内的NF-κB和MAPK通路，调节基因转录，产生包括TGF-β，IL-1和IL-6在内的多种细胞因子。

一些IL能促进肺纤维化的发生，例如，IL-1和IL-6[10]。IL-1亚型IL-1β能够引发促炎因子IL-6、TNF-α和TGF-β1的表达量迅速增加，引起严重的炎症反应。肺组织结构被破坏，造成严重损伤，ECM不断沉积，逐渐形成肺纤维化。Markovics发现IL-1β能够通过激活TGF-β在细胞膜受体上的avβ8活性亚基，间接激活TGF-β，启动肺纤维化[11]。

核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一种多功能的核转录因子，具有广泛的生物学活性，能促进多种细胞因子、黏附分子和趋化因子的基因转录。Fujimoto等[12]给肺纤维化模型大鼠胃饲NF-κB信号通路抑制剂SP100030。一周后，将NF-κB抑制剂胃饲组与对照组比较发现:NF-κB处理鼠的肺损伤明显减轻，炎症因子的分泌量也明显减少，纤维化程度减轻。表明NF-κB通路与肺纤维化形成有关。氧化应激可诱导NF-κB活化[13]，促进TGF-β、TNF-α等炎症因子的产生，介导肺泡炎和肺纤维化形成。Francesco等[14]研究发现，当肺组织氧化抗氧化失衡，活性氧产生增加，可下调谷胱甘肽和一氧化氮的表达量，造成单核细胞和表皮细胞的调节异常。IL-1、IL-6、髓过氧化物酶、双氧化酶、过氧化物酶等细胞因子和蛋白酶大量释放，造成严重肺损伤和剧烈的炎症反应。ECM分泌增加，逐渐形成肺纤维化。

在动物模型中，肺损伤之后会发生包括新生血管形成的显著肺血管的变化。有研究发现，在IPF患者中存在广泛的血管新生。同时，在IPF患者血浆中发现了促血管生成因子和细胞因子的表达增加[15]。此外，Farkas等[16]发现IPF中存在微血管和大血管重塑。进一步的研究表明，IPF中的微纤维化区或正常肺组织区毛细血管密集程度增加，但在纤维化程度最严重的区域毛细血管密集程度却减少，IPF中的成纤维细胞灶无血管组织，其周围是由毛细血管分布的杂乱无章的组织所包绕[15]。

VEGF是迄今已知功能效应最强的血管生成因子之一[15,17]。VEGF能增加血管通透性，是维持血管完整性的关键因素。VEGF在博来霉素诱导的肺纤维化中存在作用，纤维化肺组织中存在大量含VEGF的II型肺泡上皮细胞和肌成纤维细胞，它们中的VEGF活性增强可能会诱导巨噬细胞活化、肥大细胞迁移和聚集，从而将参与纤维化形成过程的细胞与血管新生联系起来[15]。内皮素1(ET-1)被认为有促成纤维细胞和肺泡上皮细胞增殖，促成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，促进胶原合成和抑制胶原降解的作用。ET-1能通过旁分泌刺激不同细胞类型诱导产生大量促纤维生长因子包括TNF-α、TGF-β和纤维连接蛋白。此外ET-1可以通过诱导VEGF的产生，以增强新生血管形成。

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是环境水资源中蓝藻水华污染产生的常见毒素之一，其主要是通过抑制丝氨酸/苏氨酸磷酸酶1和2A(Serine/threonine proteinphosphatases 1 and 2A，PP1和PP2A)的活性而产生毒性。目前发现MCs有80多种异构体，其中微囊藻毒素-LR(MC-LR)存在面广，且是MCs中毒性最强的一种异构体。我们早期的研究发现，给予小鼠连续12个月饮水暴露MC-LR，小鼠肺部仅出现炎症反应，但没有发生肺纤维化现象，说明MC-LR可能存在抗纤维化作用，但迄今为止，未见有关微囊藻毒素-LR抗肺纤维化的生物活性或临床应用方面的研究。

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发明内容

本发明公开了微囊藻毒素-LR的医药新用途，即微囊藻毒素-LR用于制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物的用途。

通过博来霉素诱导大鼠肺纤维化这一经典模型，通过MC-LR干预比较及相关分子分析，创新性的提出MC-LR可从抑制TGF-β通路和抑制血管生成途径，有效阻止肺纤维化进程。

基于以上研究本发明提供了MC-LR在干预、治疗大鼠肺纤维化的药物中的应用。

本发明提供了MC-LR为抑制博来霉素诱导的肺纤维化相关分子TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ET-1 mRNA表达的药物中的应用。

本发明提供了MC-LR可促进抗博来霉素诱导的肺纤维化相关分子Nrf2 mRNA表达的药物中的应用。

本发明提供了MC-LR为抑制博来霉素诱导的肺组织血管生成的药物中的应用。

本发明提供了在MC异构体中寻找干预、治疗大鼠肺纤维化药物的线索。

本发明经过验证，微囊藻毒素-LR可以改善由博来霉素引发的肺纤维化状态。微囊藻毒素-LR可抑制博莱霉素引发的肺纤维化相关分子TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ET-1 mRNA表达的升高。微囊藻毒素-LR可抑制博莱霉素引发的肺组织VEGF mRNA表达的增高。微囊藻毒素-LR通过TGF-β/Smad通路及抑制血管生成等途径，干预并缓解博莱霉素诱导大鼠肺纤维化。为制备预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物提供新的途径。

附图说明

图1为MC-LR对各组肺组织炎症程度的影响(Masson染色×200)。其中A为空白组大鼠肺组织纤维化程度(Masson染色×200)结果图；B为博来霉素诱导肺纤维化模型大鼠肺组织纤维化程度(Masson染色×200)结果图；C为采用博来霉素诱导肺纤维化后，第7天开始给予MC-LR干预后大鼠肺组织纤维化程度(Masson染色×200)结果图；D为采用博来霉素诱导肺纤维化后，第14天开始给予MC-LR干预后大鼠肺组织纤维化程度(Masson染色×200)结果图；E为采用博来霉素诱导肺纤维化后，第28天开始给予MC-LR干预后大鼠肺组织纤维化程度(Masson染色×200)结果图；F为各组大鼠肺组织纤维化程度统计结果。

图2为各组大鼠肺组织中TGF-β mRNA表达情况。MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的TGF-β上升产生一定的抑制作用。

图3为各组大鼠肺组织中TNF-α mRNA表达情况。MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的TNF-α上升产生明显的抑制作用，且早期处理组抑制作用更为显著。

图4为各组大鼠肺组织中IL-1β mRNA表达情况。MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的IL-1β上升产生明显的抑制作用，三组处理组间无显著差异。

图5为各组大鼠肺组织中IL-6 mRNA表达情况。MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的IL-6上升产生明显的抑制作用，且早期处理表现出更为显著的抑制作用。

图6为各组大鼠肺组织中NF-κB mRNA表达情况。MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的NF-κB上升产生明显的抑制作用，晚期处理组呈现明显差异。

图7为各组大鼠肺组织中ET-1 mRNA表达情况。MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的ET-1上升产生明显的抑制作用，且处理在较后期进行反而呈现较为显著的抑制作用。

图8为各组大鼠肺组织中Nrf2 mRNA表达情况。博来霉素及MC-LR各处理组均呈现Nrf2 mRNA表达上升。

图9为各组大鼠肺组织中VEGF mRNA表达情况。MC-LR各处理组均有效抑制由博来霉素诱导的VEGF表达上升，且较晚处理效果更佳。

具体实施方式

实施例

用博莱霉素制作的肺纤维化模型，其病理组织学和生理学改变与人类肺纤维化近似，因此已成为国际、国内各实验室构建肺纤维化动物模型的常用药物。博莱霉素经口腔气管内滴注给药可诱导大鼠发生肺纤维化，对照为生理盐水口腔气管内滴注给大鼠。

实验动物：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，体重150g-200g，常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物合格证号为：SCXK(苏)2011-0003。

大鼠博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化模型的建立：SD成年雄性大鼠，腹腔注射氨基甲酸乙酯(乌拉坦，200g/L)1g/kg进行麻醉，大鼠麻醉后，固定，经口行气管插管，注入博来霉素(5mg/kg)。然后迅速将鼠板直立，旋转鼠板，观察大鼠呼吸情况。将大鼠放回干燥洁净的鼠笼休息，等待苏醒，之后正常饲养。实验室条件下饲养60天(即通气良好的20℃恒温环境中，每12小时光照与黑暗交替，水粮足量，自由取用)，60天后取大鼠肺脏组织，石蜡包埋固定，部分肺组织冷冻保存。

取6-8周成年SD大鼠30只，采用随机分组的办法，将小鼠随机分为5组，分空白对照组(control)，模型组(BLM)，建模加MC-LR给药组(BLM7+MC-LR、BLM14+MC-LR和BLM28+MC-LR)，每组各6只。按照如上所述的方法建模(对照组滴注生理盐水)。control组、BLM组建模后自然饮水(灭菌超纯水)，建模加MC-LR给药组分别在建模后的第7天(BLM7+MC-LR)、第14天(BLM14+MC-LR)和第28天(BLM28+MC-LR)开始给予浓度20μg/L的MC-LR自然饮水。大鼠于建模后第60天麻醉后，心脏取血，处死。收集大鼠肺组织，用PBS冲洗2次，去除表面残余的血液。左上叶肺入4％甲醛中固定，逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋后，常规切片，Masson染色，进行肺纤维化形态学观察，结果如图1。其余肺组织直接放置液氮里，用于其他测定，如mRNA测定。

所有数据均用均数±SD(x±s)表示。应用SPSS11.5统计软件处理，统计采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

如图1中A空白；B博莱霉素模型；C～E不同时间MC-LR处理组；F肺纤维程度统计图。病理组织切片经Masson染色，结果表明对照组大鼠肺组织内可见少量染成蓝色的胶原纤维，是细胞外基质的主要组成部分。模型组大鼠肺纤维化形成，Masson染色后可见多量致密被染成蓝色的胶原纤维，呈束状或片状沉积，基本符合肺纤维化的特点，说明实验大鼠肺纤维化模型制备成功。经MC-LR处理后，可见大鼠肺组织成纤维细胞增生、胶原纤维沉积程度均比模型组轻。

图2结果显示MC-LR在20ug/L下可不同程度的降低TGF-β含量，较好地干预BLM诱导的大鼠肺纤维化发展程度。TGF-β是组织纤维化中公认的致纤维化因子，通过经典的TGF-β1/Smads途径参与纤维化进程。

TNF-α是一种具有广泛生物活性的细胞因子，主要来源于活化的巨噬细胞、肥大细胞和T淋巴细胞，是致炎因子刺激下机体组织产生的一种重要的细胞免疫防御因子，它可促进内皮细胞表达黏附分子，增进白细胞与之黏着，促进中性粒细胞的聚集和激活间质组织释放蛋白水解酶，刺激肺成纤维细胞的增生和胶原的合成。适量的TNF-α对肺泡正常结构的维持和防止肺纤维化是必要的，过量内源性TNF-α的表达能促进肺纤维化的形成和发展。

图3研究结果显示，MC-LR干预各组均能有效抑制BLM诱导的TNF-α表达的上升，且建模7天即开始干预的组大鼠肺组织中TNF-α表达减少最为显著。MC-LR各处理组均对博莱霉素诱导的TNF-α上升产生明显的抑制作用，且早期处理组抑制作用更为显著。

图4对大鼠肺组织中IL-1βmRNA检测显示，MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的IL-1β上升产生明显的抑制作用，三组处理组间无显著差异。有大量研究表明IL-1β在肺组织损伤和修复过程中起直接作用，IL-1β能够有效的诱导TGFβ造成肺纤维化的形成。

IL-6是一种由多种细胞包括成纤维细胞产生的多功能细胞因子，通过自分泌或旁分泌方式作用于多种细胞包括成纤维细胞。越来越多的证据表明IL-6可能是一种促纤维化细胞因子。如图5显示，IL-6在MC-LR处理后可以显著抵抗由BLM引发的IL-6表达增高，且MC-LR处理越早抑制效果越明显。

NF-κB是一个二聚化合物的转录因子，存在于胞浆内，当被激活后进入胞核，诱导基因表达，参与转录调控多种细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β等)的基因表达，通过不同的机制促进肺纤维化的发生和发展。如图6显示，MC-LR各处理组均对博来霉素诱导的NF-κB上升产生明显的抑制作用，且晚期处理组差异显著。

如图7所示，内皮素1(ET-1)被认为有促成纤维细胞和肺泡上皮细胞增殖，促成纤维细胞向肌纤维母细胞分化，促胶原纤维合成，并抑制胶原纤维降解的作用。在本研究中，我们观察到肺组织中的ET1在BLM处理组显著上升，而在MC-LR的三组中均发生不同程度的下降，具统计学差异。

Nrf2主要通过抗氧化反应元件调控多种抗氧化基因的表达，进而增加抗氧化物质的生成，抑制肺纤维化的发生发展。如图8研究结果显示，BLM组肺组织中Nrf2 mRNA发生上调，MC-LR干预后Nrf2的表达增加更为明显。

近年来血管生成在肺纤维化发生中的作用日益受到重视，血管生成可能是肺纤维化形成过程中的一个关键环节。很多研究发现在BLM诱导的肺纤维化动物模型中，抑制促血管生成因子或给予抗血管生成因子干预、减轻血管生成可缓解肺纤维化的进展。血管内皮生长因子(VEGF)是目前己知的最主要的血管生成因子，能够促进新血管的生成，增加血管通透性，并参与炎性细胞浸润。我们的结果同样显示，在BLM组肺组织中VEGF过度表达，而给予MC-LR干预后能有效阻抑VEGF的表达，如图9所示。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (4)

1.微囊藻毒素-LR用于制备预防和/或治疗特发性肺纤维化疾病的药物的用途。

2.根据权利要求1所述微囊藻毒素-LR用于制备预防和/或治疗特发性肺纤维化疾病的药物的用途，其特征在于：所述微囊藻毒素-LR用于制备抑制由博来霉素诱导的肺纤维化相关分子TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ET-1 mRNA表达的药物的用途。

3.根据权利要求1所述微囊藻毒素-LR用于制备预防和/或治疗特发性肺纤维化疾病的药物的用途，其特征在于：所述微囊藻毒素-LR用于制备促进抗博来霉素诱导的肺纤维化相关分子Nrf2mRNA表达的药物的用途。

4.根据权利要求1所述微囊藻毒素-LR用于制备预防和/或治疗特发性肺纤维化疾病的药物的用途，其特征在于：所述微囊藻毒素-LR用于抑制博来霉素诱导的肺组织血管生成的药物的用途。