CN106604736B - 副干酪乳杆菌促进生态失调后肠道菌群多样性恢复的应用 - Google Patents

副干酪乳杆菌促进生态失调后肠道菌群多样性恢复的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei在患有生态失调的受试者中维持或增加肠道菌群的多样性中的应用。

Description

副干酪乳杆菌促进生态失调后肠道菌群多样性恢复的应用
技术领域
本发明涉及益生菌领域。具体地，本发明与副干酪乳杆菌(L.paracasei)在恢复受试者中的肠道菌群多样性中的应用有关。在具体的实施方式中，本发明涉及副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei)在患有肠道生态失调的受试者中促进肠道菌群中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)减少中的应用。
背景技术
根据联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)中对具有活乳酸菌的奶粉的健康和营养特性的专家评议会在2001年批准的定义，益生菌是“活的微生物，该活的微生物当以恰当的量施用时，赋予了宿主健康益处”。已在属于乳品工业中常用的乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)和乳球菌属(Lactococcus)的物种中，描述了益生菌。据认为，益生菌通过阻碍致病微生物的生长和/或通过更直接地作用于免疫系统，而在肠道菌群的水平上进行干预。
导致医疗保健相关感染(HAI)的机会细菌感染对患者死亡率和发病率，以及发达国家和发展中国家的医疗保健成本造成了深远影响(WHO，2008)。胃肠道(GIT)是机会致病菌的贮主，其中机会致病菌受益于肠道菌群平衡的破坏或生态失调而侵入和感染易感患者。抗生素治疗对肠道菌群的多样性产生有害影响，并且抗生素治疗促进了人的细菌性机会致病菌(包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)或艰难梭菌(Clostridium difficile)的扩增。
在获得抗生素耐性和其他致病性状后，植入和/或侵入的多重耐药性粪肠球菌(E.faecalis)菌系(其导致严重的院内感染)被分类为7种医院适应(hospital-adapted)的复合体，这7种医院适应的复合体被命名为高风险肠道球菌克隆复合体(HiRECC)。HiRECC在GIT内的增殖和持久生存是产生耐万古霉素性肠球菌(VRE)感染的主要风险，从而非常需要更好地了解粪肠球菌(E.faecalis)定植在GIT中所涉及的生物因素和生化因素。在美国和几个欧洲国家中，属于HiRECC-2的菌系是粪肠球菌(E.faecalis)感染的最常见病因之一。一些粪肠球菌(E.faecalis)菌株获得致病性状并且能引起严重感染。实际上，它们可能定植在GIT中，和/或穿过肠上皮屏障并进入血流。此外，肠球菌属(Enterococcus spp.)是社区获得性腹内感染的部分原因，并且被认为是医疗保健相关感染(HCAI)中最常被分离出来的十种微生物之一。因此，特别是GIT内HiRECC的粪肠球菌(E.faecalis)的增殖和持久存在的降低不仅降低发生GIT感染的风险，还降低发生腹内感染的风险。
从上文清楚的是，需要用于治疗或预防粪肠球菌(E.faecalis)感染的抗生素的替代物或补充物。
“肠道菌群”是指居于隶属动物界的任何生物体(人、动物、昆虫等)的肠内的微生物群落。虽然每个个体具有独特的菌群组成(来自总共400至500个不同细菌种类/个体的50％以上的取样群落中，60至80种的细菌是相同的)，但是它总是实现类似的主要生理功能，并且对个体健康具有直接影响：
·有助于消化胃和小肠不能消化的某些食物(主要是非消化性纤维)；
·有助于产生一些维生素(B和K)；
·保护免受其他微生物的侵袭，维持肠粘膜的完整性；
·在适当免疫系统的发育中发挥重要作用；
·健康、多样且平衡的肠道菌群是确保适当肠道功能的关键。
考虑到肠道菌群在身体正常功能中发挥的主要作用及其所完成的不同功能，有时认为肠道菌群是“器官”。然而它是“获得性”器官，因为婴儿出生时是无菌的；也即，肠道定植始于出生，之后逐渐形成。
肠道菌群在扰动(诸如，饮食变化、抗生素治疗和外源微生物的侵入)之后出现紊乱的幅度，以及恢复到扰动前状态的速度和程度被限定为“菌群的恢复力”。菌群的恢复力在个体间以及个体内不同扰动之间是有差异的。
从上文可知，还非常需要用于提高菌群恢复力的治疗。
越来越多的证据表明，益生菌或粪菌移植预防或治疗包括肠道感染的许多疾病。这样的方法也与小鼠中的肠VRE的较高清除率相关。
令人惊奇地是，本发明人已经发现，细菌菌种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)能够在体内促进肠道菌群多样性的恢复和/或减少粪肠球菌(E.faecalis)菌株的负荷。
因此，本发明的主题是副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在提高肠道菌群的恢复力中的应用。特别地，本发明与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在增加受试者的肠道菌群多样性中的应用有关。在具体的实施方式中，本发明在于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株在患有由抗生素引起的肠道生态失调的受试者中，加速肠道菌群中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)减少中的应用。
本发明的其它方面提供了副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在以下方面中的应用：预防、缓解或治疗肠道生态失调；和/或预防由存在于胃肠道中的致病菌引起的疾病；和/或在增加受试者中短链脂肪酸的水平。
本发明还提供了组合物，该组合物包括用于本发明的应用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
发明内容
在本文中，短语“维持菌群多样性”用于表示：尤其是在生态失调的情况下，不会显著地改变或影响个体中菌群的物种多样性(物种丰富度和/或物种均匀性)。特别地，维持菌群多样性可以帮助受试者在有生态失调风险的情况下更快地恢复，或者可以避免生态失调恶化。短语“增加菌群多样性”、“促进菌群多样性的恢复”、“生态失调的治疗/缓解/降低”等用于表示：个体中菌群的物种多样性(物种丰富度和/或物种均匀性)的增加。用于计算物种多样性、物种丰富度和物种均匀度的方法是本领域已知的，包括但不限于辛普森指数，辛普森多样性指数和辛普森相互指数，曹指数(Chao Index)和香农指数。
此外，“加速肠道菌群多样性的增加”、“促进肠道菌群多样性的恢复”、“有利于恢复至基线/正常/健康的肠道菌群多样性”、“加速生态失调的缓解/降低/消失”等用于表示：在抗生素治疗后患有肠道生态失调的个体内的菌群多样性(丰富度和/或均匀性)在服用益生菌菌株的受试者中比未服用益生菌菌株的对照受试者在统计学上增加更快，从而抗生素治疗后三周的菌群的结构在服用益生菌菌株的受试者中比未服用益生菌菌株的受试者在统计学上更接近于治疗前的结构。如本文中所使用的，术语“生态失调”应当被理解为与健康或普通群体相比，菌群共生物种多样性的改变，并且应包括有益微生物的减少和/或致病菌(致病性微生物或潜在致病性微生物)的增加和/或总体菌群物种多样性的减少。许多因素可能伤害肠道菌群的有益成员，从而导致生态失调，这些因素包括抗生素的使用、心理和生理压力、辐射和饮食变化。抗生素的使用是导致正常菌群中发生重大改变的最常见且不可忽略的原因。因此，如本文所使用的，术语“抗生素诱导的生态失调”是指由抗生素所引起的生态失调，包括促进细菌性机会致病菌的过度生长，其中细菌性机会致病菌包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)或艰难梭菌(Clostridium difficile)。如本文所使用的，术语“乳品组合物”应当被理解为适于动物食用，特别是人类食用的奶类组合物。
如本文所使用的，术语“奶”应理解为包括蔬菜奶或动物奶，例如但不限于大豆奶、杏仁奶、斯佩尔特小麦奶(spelt milk)、燕麦奶、麻籽奶(hemp milk)、椰奶、米奶、山羊奶、绵羊奶或牛奶。
如本文所使用的，术语“x％(w/w)”被认为等于“x g/100g”。
如本文所使用的，所提及的细菌菌株或物种应当被理解为包括由此衍生的保留缓解受试者(优选患有抗生素诱导的生态失调的受试者)的肠道生态失调的能力的细菌。为了评估该能力，可使用与下文实施例中所述相同的模型。衍生自可以根据本发明使用的亲本菌株的菌株包括突变菌株和遗传转化菌株。这些突变菌株或遗传转化菌株可以是其中亲本菌株中的一个或多个内源基因已经发生突变的菌株，例如改变它们的一些代谢性质(例如它们发酵糖的能力，它们对酸度的耐性，它们在胃肠道中运输的存活能力，它们的后酸化性质或它们的代谢产物)。它们还可以是由亲本菌株经遗传转化以增加一个或多个感兴趣的基因而产生的菌株，其中增加一个或多个感兴趣的基因例如是为了给予所述遗传转化菌株额外的生理特征，或允许它们表达希望通过施用该菌株来表达的感兴趣的治疗性蛋白质或疫苗。这些突变体或遗传转化菌株可以利用细菌的随机或定点诱变和遗传转化的常规技术，或利用被称为“基因组重排”的技术由亲本菌株来获得。在本文中，当提及亲本物种或菌株时，应理解其涵盖衍生自所述亲本物种或菌株并且保留在患有抗生素诱导的生态失调的受试者中维持或增加肠道菌群多样性的能力的菌株、突变体和变体，例如，短语“副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)”和“菌株CNCM I-3689”应被理解为包括衍生自它们的菌株、突变体和变体。
如本文所使用的，术语“食物补充剂”应被理解为由食品中常用的化合物制成的产品，但其为片剂、粉末、胶囊、饮剂的形式或通常不与营养物相关的任何其它形式，并且对个体健康具有有益的影响。
如本文所使用的，术语“功能性食物”应被理解为除了提供营养之外，还对个体的健康具有有益效果的营养物。特别地，食物补充剂和功能性食物可以具有生理效应-用于疾病(例如慢性疾病)的预防、改善或治疗。
如本文所使用的，术语“发酵乳”或“发酵奶”是指分别通过至少一种乳酸菌的酸化作用从乳品组合物或奶品组合物得到的组合物，所述乳酸菌可包含在发酵物、培养物或引酵物中。
如本文所使用的，术语“可勺取的”应被理解为可利用勺子或其他器具食用的固体或半固体。
如本文所使用的，短语“加速粪肠球菌(E.faecalis)的减少”、“减少粪肠球菌(E.faecalis)的负荷”、“促进粪肠球菌(E.faecalis)的减少”等用于表示存在于在抗生素治疗后患有肠道生态失调的个体的微生物群中的粪肠球菌(E.faecalis)的量在服用益生菌菌株的受试者中比未服用益生菌菌株的对照受试者减少得更快。
副干酪乳杆菌(LACTOBACILLUS PARACASEI)的应用
本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在受试者(优选患有肠道生态失调的受试者)中维持或增加肠道菌群多样性中的应用。
因此，一个实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在预防或缓解受试者的肠道生态失调中的应用。根据布达佩斯条约，将副干酪乳杆菌副干酪亚种(L.paracasei subsp.Paracasei)菌株CNCM I-3689于2006年11月9日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes,25rue du Docteur Roux,巴黎)。该菌株公开在国际专利申请WO 2009/130423中。
在优选的实施方式中，肠道生态失调由受试者的抗生素治疗引起或在受试者的抗生素治疗后引起。典型地，抗生素相关的生态失调的特征可为胃肠的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和/或艰难梭菌(Clostridium difficile)的增加。
令人惊奇地是，本发明人已经发现副干酪乳杆菌(L.paracasei)不仅促进受试者中肠道菌群的多样性，还降低胃肠的机会致病菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。因此，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在降低粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或加速粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的减少中的应用。在替代性实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在阻止粪肠球菌(Enterococcus faecalis)穿过肠道屏蔽的移位中的应用和/或在预防粪肠球菌(Enterococcus faecalis)引起的腹内感染中的应用。在另一实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在降低抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)或加速抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)的减少中的应用。因此，在一个实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在降低通常在肠内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)或加速通常在肠内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)的减少中的应用。典型地，所述耐性是指对选自以下项的一种或多种抗生素的耐性：青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和糖肽类。
优选地，所述受试者患有肠道生态失调。在优选的实施方式中，所述肠道生态失调由受试者的抗生素治疗引起或受试者的抗生素治疗后引起。优选地，上述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为胃肠的，更优选为肠内。
组合物
本发明的另一方面提供了一种组合物，所述组合物包括副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689，用于根据本发明的应用中。
因此，在本发明优选的实施方式中，菌株副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689以可口服施用组合物的形式提供。在这样的组合物中，所述菌株可以以活的或死的全菌形式使用。可替代地，所述菌株可以细菌裂解物的形式来使用。优选地，细菌细胞以活的且可存活的细胞形式存在。
根据本发明，所述组合物可以是适合于可口服施用的任何形式。这包括例如固体、半固体、液体和粉末。半固体组合物(诸如酸奶)和液体组合物(例如饮料)是优选的。
优选地，所述组合物包括每克重量至少1.106菌落形成单位(cfu)、至少1.107菌落形成单位(cfu)或优选至少1.108cfu的副干酪乳杆菌L.paracasei、优选干酪paracasei亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689。优选地，基于本发明的每克组合物，所述组合物包括至多约1011菌落形成单位(cfu)，更优选至少1010菌落形成单位(cfu)并且最优选至少109菌落形成单位(cfu)的根据本发明的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689。
所述组合物可进一步包括：除上述菌株之外的乳杆菌属(Lactobacillus)的其它菌株和/或细菌的其它菌株，特别是益生菌菌株，例如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳球菌(Lactococcus)菌株。
所述组合物可为药物组合物或营养组合物。根据优选的实施方式，所述组合物是营养组合物，诸如食品(包括功能性食物)或食物补充剂。
可根据本发明使用的营养组合物包括乳品组合物，优选发酵乳品组合物。发酵组合物可以是液体形式，或者是通过干燥发酵液体而获得的干粉形式。乳品组合物的实例包括乳酪、酸奶，和凝固、搅拌(stirred)或可饮用形式的发酵奶和/或发酵乳清。发酵产品还可以是凝固、搅拌或可饮用形式的发酵植物，例如发酵的大豆、谷物和/或果实。可根据本发明使用的营养组合物还包括幼儿食物、婴儿配方奶粉和婴儿后续(follow-on)配方奶粉。在优选的实施方式中，发酵产品是新鲜产品。未经过严格热处理步骤的新鲜产品具有细菌菌株以存活形式存在的优点。
特别优选的是，根据本发明的组合物是乳品组合物，特别是发酵乳品组合物。
优选地，根据本发明的乳品组合物包含或衍生自(特别是通过发酵)：含有30％至100％(w/w)的奶、更优选50％至100％(w/w)的奶和甚至更优选70％至100％(w/w)的奶的组合物。还优选地，根据本发明的乳品组合物包括或衍生自(特别是通过发酵)：基本上由奶(优选牛奶)组成的组合物，或仅由奶(优选牛奶)组成的组合物。
优选地，根据本发明的乳品组合物包括或衍生自(特别是通过发酵)：含脱脂奶或非脱脂奶之一或两者的组合物。优选地，所述奶或多种奶可以是液体、粉末和/或浓缩形式。在一个实施方式中，所述奶或多种奶可以富含或强化了另外的奶组分或其它营养物，诸如但不限于维生素、矿物质、微量元素或其它微量营养物。
所述发酵乳品组合物通过至少一种乳酸菌的酸化作用衍生自本发明的乳品组合物，该至少一种乳酸菌可以包含在发酵物、培养物或引酵物中。更优选地，根据本发明所述的发酵乳品组合物通过至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸菌菌株的酸化作用获得。因此，“发酵乳品组合物”包括至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸菌菌株。
用于制备发酵奶制品(诸如酸奶或其等同物)的方法是本领域公知的。典型地，通过与合适的微生物一起培养热处理(例如巴氏杀菌的)脱脂奶和/或非脱脂奶以使pH降低，来制备发酵奶制品。合适的微生物(例如嗜热乳酸菌)的选择在本领域技术人员的范围内。
根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物可选地进一步包含辅助成分，诸如果实、蔬菜、营养性和非营养性甜味剂、谷物、调味剂、淀粉、增稠剂、防腐剂或稳定剂。优选地，根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物应包含至多约30％(w/w)的所述辅助成分，例如，至多约10％、15％、20％、25％(w/w)的辅助成分。
优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物、更优选发酵奶品组合物，包括或基本上包括经过至少相当于巴氏杀菌的热处理的奶，或由经过至少相当于巴氏杀菌的热处理的奶组成，优选所述热处理在制备所述乳品组合物或发酵乳品组合物之前进行。
优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选每100g重量包含约0.3g以上游离乳酸的发酵奶品组合物，更优选地，本发明提供了每100g重量包括约0.7g或0.6g以上游离乳酸的发酵奶品组合物。优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是包括至少与奶或其来源的奶的蛋白含量相等的发酵奶品组合物。
优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是pH等于或低于5、更优选约3.5至约4.5的发酵奶品组合物。
优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是在10℃下，64/s的剪切速率时，粘度低于200mPa.s、更优选低于100mPa.s并且最优选低于60mPa.s的发酵奶品组合物。在一个实施方式中，根据本发明的乳品组合物是可饮用的发酵乳品组合物，更优选地是饮料发酵奶饮料，诸如但不限于酸奶饮料、克非尔(kefir)等。在替代性实施方式中，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是可勺取的发酵奶制品组合物。
还优选地，根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物或根据本发明的产品可以在1℃至10℃的温度下储存。
根据本发明的乳品组合物、特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物或者产品的单份量以重量计，优选为约50g、60g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、200g、300g或320g，或者可替代地为约1盎司、2盎司、3盎司、4盎司、5盎司、6盎司或12盎司。
优选地，根据本发明的乳品组合物、特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物包括：每克(g)根据本发明的组合物，至少106、更优选至少107、并且最优选至少108菌落形成单位(CFU)的根据本发明的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689。
治疗用途
本发明的主题还在于副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，优选菌株CNCM I-3689或如上定义的组合物，在制造用于维持或增加肠道菌群多样性，和/或用于预防或治疗肠道生态失调的药物中的应用。本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在制备用于降低或降低粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或加速粪肠球菌(Enterococcus faecalis)减少的药物中的应用。在一替代性实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689o在制备用于阻止粪肠球菌(Enterococcus faecalis)穿过肠道屏蔽的移位，和/或用于预防粪肠球菌(Enterococcus faecalis)引起的腹内感染的药物中的应用。在另一实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在制备用于降低抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)或加速抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)减少的药物中的应用。因此，在一个实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种，进一步优选菌株CNCM I-3689在制备用于降低通常在肠道内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)或加速通常在肠道内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)减少的药物中的应用。典型地，所述粪肠球菌(E.faecalis)对选自青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和糖肽类中的一种或多种抗生素具有耐性。
本发明的主题还在于副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、优选菌株CNCM I-3689，或如上定义的组合物在预防或治疗肠道生态失调中的应用。
本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689或在治疗粪肠球菌(Enterococcus faecalis)感染中的用途。在一替代性实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689在治疗或阻止粪肠球菌(Enterococcus faecalis)穿过肠道屏蔽的移位中的应用，和/或在治疗或预防粪肠球菌(Enterococcus faecalis)引起的腹内感染中的应用。在另一实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689在治疗抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)中的应用。因此，在一个实施方式中，本发明提供了副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689在治疗通常在肠道内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)中的应用。典型地，所述粪肠球菌(E.faecalis)对选自青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和糖肽类中的一种或多种抗生素具有耐性。
本发明的主题还在于用于维持或增加肠道菌群多样性的方法，和/或预防或治疗肠道生态失调的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选如上定义的副干酪(paracasei)亚种、优选菌株CNCM I-3689，或如上定义的组合物。
特别是在考虑到本文提供的详细公开内容下，治疗有效量的确定是本领域技术人员熟知的。
本发明的主题还在于制备用于维持或增加肠道菌群多样性的药物的方法，和/或制备用于预防或治疗肠道生态失调的药物的方法，所述方法包括将副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689并入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂中。本发明提供了制备用于降低粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或加速粪肠球菌(Enterococcus faecalis)减少的药物的方法，所述方法包括将副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689并入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂中。在一替代性实施方式中，本发明提供了制备用于阻止粪肠球菌(Enterococcus faecalis)穿过肠道屏蔽的移位的药物，和/或预防粪肠球菌(Enterococcus faecalis)引起的腹内感染的药物的方法，所述方法包括将副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689并入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂中。在另一实施方式中，本发明提供了制备用于降低抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)或加速抗生素治疗后耐药性肠球菌(优选HiRECC)减少的药物的方法，所述方法包括将副干酪乳杆菌(L.paracasei、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689并入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂中。因此，在一个实施方式中，本发明提供了用于降低通常在肠道内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)或加速通常在肠道内的抗生素耐性粪肠球菌(E.faecalis)减少的药物中的方法，所述方法包括将副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689并入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂中。典型地，所述粪肠球菌(E.faecalis)对选自青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和糖肽类中的一种或多种抗生素具有耐性。
优选地，上述药物、应用和/或方法的所述受试者患有肠道生态失调；进一步优选地是，所述生态失调由受试者的抗生素治疗引起或者在受试者的抗生素治疗后引起。优选地，上述药物、应用和/或方法的粪便球菌(Enterococcus faecalis)在胃肠道内，更优选在肠道内。
服用量(dosage)
在一个实施方式中，本发明提供了约108至约1011菌落形成单位(CFU)，优选约108至约109菌落形成单位、更优选约109至约1010菌落形成单位(CFU)的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689的食用剂量或施用剂量；并且在一替代性实施方案中，约1010至约1011菌落形成单位(CFU)的副干酪乳杆菌(L.paracasei)，优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689的食用剂量或施用剂量，用于本申请所公开的应用和方法。在另一实施方式中，在24小时时段内提供至少1、2、3或4剂。进一步优选地，日剂量方案保持至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天；或在替代性实施方式中，该日剂量方案保持至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周或7周。
因此，在一个实施方式中，本发明提供每日食用或施用至少1份、2份、3份或4份根据本发明的乳品组合物、特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物。每份可以单独地被食用或施用，或者在单次中可食用或施用多份。上述多份中的每一份可在进餐时或在进餐之间食用(例如作为零食，在体育活动等之后)。
根据本发明的乳品组合物、特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物的单份量以重量计，优选为约50g、60g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、200g、300g或320g，或者约1盎司、2盎司、3盎司、4盎司、5盎司、6盎司或12盎司。
优选地，根据本发明的组合物包含：每克(g)根据本发明的组合物，至少106菌落形成单位、更优选至少107菌落形成单位并且最优选至少108菌落形成单位(CFU)的根据本发明的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689。还优选地，根据本发明的组合物包括：每克(g)根据本发明的组合物的细菌为至少1011菌落形成单位、更优选至少1010菌落形成单位并且最优选至少109菌落形成单位(CFU)的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、进一步优选菌株CNCM I-3689。
例如，在一个实施方式中，本发明提供了至少2份或至少3份的100g或125g份的发酵奶品的日食用量，所述发酵奶品包括每g制品约至少107至至少108菌落形成单位(CFU)的副干酪乳杆菌(L.paracasei)、优选副干酪(paracasei)亚种、更优选菌株CNCM I-3689。在另一实施方式中，维持所述日食用水平至少1周、2周、3周、4周或更多周的时段。
从以下进一步描述中将更清楚地理解本发明，其中，该进一步描述涉及阐明副干酪乳杆菌(L.paracasei)缓解体内生态失调的能力的实施例。
附图说明
图1为表示实验顺序的图示。
图2显示了通过对小鼠中总肠球菌群落的选择性铺板来确定动力学和水平，其中使用0.1ml的0.9％盐水溶液(对照)的日剂量饲喂小鼠，或通过含109CFU的益生菌菌株的0.1ml的0.9％盐水溶液的日剂量通过口胃接种来饲喂小鼠(A)；由粪肠球菌(E.faecalis)V583菌株建立的动力学和水平(B)；以及在停止抗生素治疗后11天(对应于D21)，E.faecalis V583的水平(C)。实验一式三份进行。
图3显示了小鼠中，第0天(“基线”；图3A)和第21天(处死，图3B)时，放线菌(Actinobacteria)门、拟杆菌(Bacteroidetes)门、硬壁菌(Firmicutes)门和变形杆菌(Proteobacteria)门的相对丰富度，其中使用0.1ml的0.9％盐水溶液的日剂量饲喂小鼠(对照“C”)，或通过含109CFU的益生菌菌株(鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)“L.r”或副干酪乳杆菌(L.paracasei)“L.p”)的0.1ml的0.9％盐水溶液的日剂量通过口胃接种饲喂小鼠。
具体实施方式
实施例
方法
细菌生长
粪肠球菌(E.faecalis)V583菌株在补充有0.5％葡萄糖的M17(GM17)中生长，并在达到稳定期后通过离心1小时来收集。细菌细胞用0.9％盐水溶液洗涤两次，并于-80℃下以干燥冷冻块状物的形式储存。该菌株属于CC2，并且是在美国报道的第一个耐万古霉素的分离株(Sahm等人，1989)。
使益生菌菌株在MRS培养基中生长，并如上所述进行收集。
在接种前至少两天，将冷冻的细菌悬浮在盐水溶液中，并将连续稀释液铺板在GM17或MRS琼脂平板上，以测定该块状物的细菌计数。
小鼠粪肠球菌(E.faecalis)模型定植化
使用特定的无致病菌的雄性CF-1小鼠(Harlan，USA)进行小鼠实验6～8周。每个笼中饲养总共5只小鼠，并用高压灭菌的食物和水自由饲喂。
利用钢饲喂管(Ecimed)通过口胃接种，小鼠接受含109CFU的益生菌菌株的0.1ml的0.9％盐水溶液的日剂量。将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CNCM I-3690施用予Lr组，并且将副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CNCM I-3689施用予Lp组。对照组的动物以相同的方式接受0.1ml的0.9％盐水溶液。在益生菌治疗一周后，每天皮下施用剂量为1.4mg/天的克林霉素，持续三天。一天后，利用钢饲喂管(Ecimed)通过口胃接种，施用含1010菌落形成单位(CFU)的粪肠球菌(E.faecalis)(耐万古霉素性肠球菌，称为“VRE”)菌株V583的0.1ml的0.9％盐水溶液。
统计学分析
通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验(GraphPad)来分析细菌计数的差异。当P<0.05时，认为差异是显著的。
菌群分析
在第0天(基线)和第21天(处死)收集粪便样品。使用Godon等人的方法提取DNA(Godon，1997)。对于焦磷酸测序，基于Sim等人(2012)的设计，使用密钥(key)标记的真细菌引物(Lifesquencing SL，Valencia，西班牙)扩增16S rRNA基因的V3-V5区域。使用20ng宏基因组DNA，每种200μM的四种脱氧核苷三磷酸，每种400nM的引物，2.5U的FastStart HiFi聚合酶以及由制造商(Roche，Mannheim，德国)提供的含有MgCl2的合适缓冲液，4％的20μg/mL BSA(Sigma，Dorset，英国)和0.5M甜菜碱(Sigma)，来进行PCR反应。热循环由以下组成：在94℃下初始变性2分钟，接着进行94℃下变性20秒、50℃下退火30秒以及72℃下延伸5分钟的35次循环。将扩增子以等摩尔浓度合并在单管中。将合并的扩增子混合物纯化两次(AMPure XP试剂盒，Agencourt，Takeley，英国)，并使用PicoGreen测定(Quant-iT，PicoGreen DNA测定，Invitrogen)再次量化无污染的合并物。随后，扩增子提交给由LifeSequencing S.L.(Valencia，西班牙)提供的焦磷酸测序服务，其中进行EmPCR，随后按照Roche Amplicon Lib-L方案，在454Life Sciences GS FLX+仪器(Roche)上进行单向焦磷酸测序。使用QIIME v.1.6(Caporaso，2010)进行生物信息学分析。根据以下质量标准过滤后，将数据分为50个样本：大小在500nt和1000nt之间，50个碱基对窗口上的质量在25以上，引物和条形码序列中经核定没有错配，以及不存在大于6nt的聚合物。使用cd-hit(Li，2006)，将剩余的解读信息聚类成定义为97％一致性的运算分类单位(OTU)，并且利用Greengenes v_13_08数据库，对每个OTU的代表性序列进行比对和分类学上的分配。
结果：副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689促进微生物群组成多样性的恢复 和耐万古霉素性粪肠球菌(E.faecalis)V583的肠道清除
使用粪肠球菌(E.faecalis)定殖模型，从抗生素治疗前1周开始，直到停止抗生素治疗和VRE接种后两周，将两种益生菌菌株副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)CNCM I-3690每日口服施用予小鼠。通过选择性铺板来监测总肠球菌群体和VRE的水平。在对照小鼠和益生菌治疗的小鼠(A&B)之间，肠球菌群的动力学和水平以及粪肠球菌(E.faecalis)VRE菌株建立的动力学是相似的。相比之下，与对照小鼠和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)CNCM I-3690治疗的小鼠(B)相比，用副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689治疗的小鼠的VRE清除率显著不同。在停止抗生素后的11天(对应于实验的第21天)，在接受副干酪乳杆菌(L.paracasei)的一半小鼠中未检测到VRE，并且，在另一半小鼠中，VRE水平比对照小鼠显著降低(C)。
总之，这些结果表明，副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689的施用显著地降低了肠道中的致病性粪肠球菌(E.faecali)的存在。鉴于在抗生素治疗后肠道定植或携带(carriage)的减少会限制VRE感染和传播的风险，副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689是促进VRE清除的有力候选物。副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689可能是在抗生素生态失调后促进机会致病菌的肠道清除的非抗生素策略的一部分。为了描述克林霉素治疗+VRE接种，和副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-3689对菌群结构的影响，对在第0天(基线)以及第21天(“恢复”)时从小鼠收集的粪便样品进行细菌16S rRNA基因V3-V5可变区的454焦磷酸测序。对第0天和第21天收集的粪便样品的菌群分析表明，对照样品中，克林霉素治疗导致菌群组成的急剧变化，并且厚壁菌门占优势和一小部分的变形菌门。与此相比，在副干酪乳杆菌(L.paracasei)组(图2)中以及在鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)组中，观察到拟杆菌属的一定程度的恢复。

Claims (4)

1.副干酪乳杆菌（ Lactobacillus paracasei） 菌株CNCM I-3689在制备营养组合物中的应用，所述营养组合物用于减少患有肠道生态失调的受试者的肠道菌群中的粪肠球菌（ Enterococcus faecalis） ，所述肠道生态失调由受试者的抗生素治疗引起或在受试者的抗生素治疗后引起，其中所述粪肠球菌（ Enterococcus faecalis） 是耐万古霉素性的。
2.根据权利要求1所述的应用，所述应用用于阻止粪肠球菌（Enterococcus faecalis）穿过受试者的肠道屏蔽的移位。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述营养组合物为食品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述营养组合物为发酵乳品。
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