CN106591444A - 一种用于表达嵌合抗原受体的t细胞产品的评估方法 - Google Patents

一种用于表达嵌合抗原受体的t细胞产品的评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，该方法包括检测CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的表达水平，检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功能及效力，检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的细胞成分及细胞分化状态，以及T细胞产品污染检测。通过本发明的评估方法应用于慢病毒转化T细胞导入嵌合抗原受体基因，保证了生产的T细胞具有高效表达受体基因和杀伤肿瘤细胞的功效，保证了T细胞产品的质量安全。

Description

一种用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法
技术领域：
本发明属于生物技术与医学技术领域，具体涉及一种用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法。
背景技术：
目前，利用嵌合抗原受体修饰淋巴T细胞，来治疗各种肿瘤取得了令人振奋的效果，但仍面临许多问题。生产表达CD19和CD20嵌合抗原受体的T细胞过程比较复杂，在此过程中需用到大量的不同的试剂，培养基等，而且因为应用慢病毒转化T细胞导入嵌合抗原受体基因，如何保证生产的T细胞具有高效表达受体基因和杀伤肿瘤细胞的功效，保证T细胞产品的质量安全都是至关重要的。因此，提供一种用于评估表达嵌合抗原受体的T细胞产品的方法，是十分有必要和关键的。
发明内容：
针对现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，包括检测CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的表达水平，检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功能及效力，检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的细胞成分及细胞分化状态，以及T细胞产品污染检测。
上述检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功能及效力包括利用51铬释放细胞毒性试验检测表达该T细胞的特异性杀伤能力和利用细胞内染色流式细胞仪测定法检测该T细胞诱导特异性分泌γ-干扰素的能力。
上述T细胞产品污染检测包括厌氧菌和需氧菌无菌检测，细菌内毒素检测，支原体检测和革兰氏染色检测。
上述用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，还包括检测CD19和CD20嵌合抗原受体基因在转化的T细胞中的拷贝数。
本发明综合多种检测手段对生产的T细胞进行全方位地评估，包括CD19和CD20嵌合抗原受体的表达水平，表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功效，细胞成分及细胞分化状态，CD19和CD20嵌合抗原受体基因在转化的T细胞中的拷贝数及T细胞产品是否有污染等，其中：
(1)检测CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的表达水平采用蛋白质L染色流式细胞仪测定法，蛋白质L是分离自大消化链球菌的细菌表面蛋白质，可选择性结合所有免疫球蛋白的可变轻链(Kappa链)而不影响其与抗原结合的特性。蛋白质L也可以结合单链抗体片段(scFv)，因此适用于T细胞嵌合抗原受体表达水平的测定。
(2)检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的细胞成分及细胞分化状态，所用方法是利用不同的抗体组合，将表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞用以下免疫荧光标记的抗人CD3，CD4，CD8，CD14，CD45，CD19，CD56，CD45RA和CCR7抗体染色，然后用流式细胞仪分析细胞成分及细胞分化状态。
(3)检测CD19和CD20嵌合抗原受体基因在转化的T细胞中的拷贝数，所用方法为实时定量荧光PCR。
因此，通过本发明的评估方法应用于慢病毒转化T细胞导入嵌合抗原受体基因，保证了生产的T细胞具有高效表达受体基因和杀伤肿瘤细胞的功效，保证了T细胞产品的质量安全。
附图说明：
图1是本发明实施例中检测CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的表达水平；
图2是本发明实施例中表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的特异杀伤活性；
图3是本发明实施例中利用细胞内染色流式细胞仪测定法检测该T细胞诱导特异性分泌γ-干扰素的能力；
图4是本发明实施例中表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的成分及细胞分化状态分析。
具体实施方式：
下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
1.检测CD19和CD20嵌合抗原受体的表达水平
1)取1X106细胞，加入到12X75mm聚丙烯管中；
2)加入含4％牛血清白蛋白的冰冷的1XPBS 3mL，离心300g，10min，弃上清；
3)重复步骤2)，共洗涤细胞三次；
4)将细胞沉淀悬浮于200μL冰冷的洗液中；
5)加入1μg生物素化的蛋白质L，混匀，置于4℃孵育45min；
6)重复步骤2)共洗涤细胞三次；
7)将细胞沉淀悬浮于200μL冰冷的洗液中；
8)加入10μL藻红蛋白偶联的链霉亲和素和其他相应地染色抗体，4℃避光孵育20min；
9)取等量未转化的T细胞进行同样地染色作为对照；
10)待染色结束加入含4％牛血清白蛋白的冰冷的1XPBS 3mL，离心300g，10min，弃上清；
11)将细胞悬浮500μL洗液中，用流式细胞仪分析嵌合抗原受体的表达水平。
利用蛋白质L染色流式细胞仪法测定CD19和CD20嵌合抗原受体的表达水平，由图1可知：未转化阴性T细胞和转化后阳性T细胞的表达水平。
2.检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功能及效力
A.利用51铬释放细胞毒性试验检测表达该T细胞的特异性杀伤能力
1)取约2X106Raji细胞，离心300g，10min，弃上清；
2)将Raji细胞悬浮于0.5mL 10％小牛血清RPMI-1640中，加入100微居51铬，混匀，37℃孵育2h；
3)加入2％小牛血清1XPBS 10mL洗液，离心300g，10min，弃上清；
4)重复洗标记后的Raji细胞共三次，然后将细胞悬浮于0.5～1mL 10％小牛血清RPMI-1640中；
5)取少量细胞计数，调整细胞浓度至5X104/mL，置冰浴备用；
6)取约各2X106转化和未转化的T细胞，用2％小牛血清1XPBS 10mL洗液洗3次，离心300g，10min；
7)将T细胞悬浮于10％小牛血清RPMI-1640中，细胞浓度调整至2.5X106/mL；
8)于96孔圆底板第一排孔中加入200μL/孔T细胞，做3个复孔；在第2，3，4排孔中加入100μL/孔10％小牛血清RPMI-1640，同样3个复孔；然后从第一排含有T细胞的孔中取100μL细胞与第二排孔混合，以此类推做两倍稀释，第四排孔稀释完毕后弃去100μL细胞；
9)在含有T细胞的96孔板中加入预备好的Raji细胞，100μL/孔；
10)另将Raji细胞按100μL/孔加入到另外12个孔中，其中6孔加入10％小牛血清RPMI-1640100μL/孔作为自然释放对照，另外6孔加入100μL/孔0.5％Triton X-100作为最大释放对照；
11)将含有细胞的96孔板离心200g，2min，然后置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育4h；
12)从每孔中移取30μL上清转移至LimaPlate中，风干过夜，第二天用液闪计数仪计数并计算细胞杀伤活性。
计算公式为：
T细胞特异性杀伤活性＝(实验孔CPM均值－自然释放对照孔均值)/最大释放孔对照均值X100％
如图2所示，为表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的特异杀伤活性。
B.利用细胞内染色流式细胞仪测定法检测该T细胞诱导特异性分泌γ-干扰素的能力
1)取约10X106Raji细胞，离心300g，10min，弃上清；
2)用10mL 10％小牛血清RPMI-1640中洗Raji细胞一次，离心300g，10min，弃上清，然后将细胞悬浮于1mL 10％小牛血清RPMI-1640中，置冰浴备用；
3)取约各3X106转化和未转化的T细胞，用10mL 10％小牛血清RPMI-1640洗1次，离心300g，10min；
4)将T细胞悬浮于10％小牛血清RPMI-1640中，细胞浓度调整至2X106/mL，将T细胞均分至3个15mL聚丙烯管中，0.5mL/1X106/管，分别标记为无刺激，Raji刺激和葡萄球菌肠毒素B刺激(SEB)；
5)于Raji刺激管中分别加入预备好的Raji细胞0.5mL，5X106；于无刺激和SEB刺激管中各补加0.5mL10％小牛血清RPMI-1640培养基；同时在SEB刺激管中加入25μLSEB；
6)在上述含有T细胞管中分别加入10μL CD28/CD49，混匀，置37℃，5％CO2孵育箱中孵育1h；
7)在T细胞管中分别加入1：10稀释后的蛋白转运抑制剂Brefeldin A(BFA)20μL，混匀，置37℃，5％CO2孵育箱中继续孵育5h；
8)待孵育结束时，将细胞置于18℃水浴锅中过夜或将细胞离心514g，5min，然后悬浮细胞沉淀于0.5mL1XPBS中；
9)分别于各管中加入50μL 20mM EDTA/PBS，高速漩涡振荡混匀，室温放置10min，再次漩涡振荡10s；
10)分别于各管中加入1mL 20mM 1X BD FACS溶解液，轻轻混匀，室温孵育10min；
11)分别于各管中加入2mL FACS洗液(1XPBS，1％小牛血清)，离心914g，10min，弃上清；
12)分别将细胞悬浮于0.5mL 1XPerm溶液中，漩涡振荡混匀，室温放置10min；
13)分别于各管中加入2mL FACS洗液(1XPBS，1％小牛血清)，离心914g，10min，弃上清；
14)加入荧光标记的抗IFN-γ,CD69,CD4,CD8和CD3抗体，室温避光染色30min；
15)分别于各管中加入2mL FACS洗液(1XPBS，1％小牛血清)，离心914g，10min，弃上清；
16)将细胞沉淀悬浮于0.5mL FACS洗液中，利用流式细胞仪分析，如图3所示，为未转化T细胞+Raji细胞和转化的T细胞+Raji细胞利用细胞内染色流式细胞仪测定法检测该T细胞诱导特异性分泌γ-干扰素的能力。
3.检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的细胞成分及细胞分化状态
1)取适量收获的T细胞，用2mL FACS洗液(1XPBS，1％小牛血清)洗一次，离心300g，10min，弃上清；
2)利用不同的抗体组合，将T细胞用以下免疫荧光标记的抗人CD3，CD4，CD8，CD14，CD45，CD19，CD56，CD45RA和CCR7抗体染色20min；
3)加入2mL FACS洗液洗涤，离心300g，10min，弃上清；
4)将细胞沉淀悬浮于0.5mL FACS洗液中，利用流式细胞仪分析，如图4所示，为表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的成分及细胞分化状态分析结果，图中可知：初始T细胞；CM:中心记忆T细胞；EM：效应记忆T细胞；TM：末端分化记忆T细胞。
4.检测CD19和CD20嵌合抗原受体基因在转化的T细胞中的拷贝数
1)从转化的T细胞中采用DNAeasy试剂盒提取基因组DNA；
2)实时定量荧光PCR目的基因引物及探针序列：
GAG-F(正向引物)：ggagctagaacgattcgcagtta
GAG-R(反向引物)：ggttgtagctgtcccagtatttgtc
GAG-P(探针，反向)：5'-(FAM)-acagccttctgatgtttctaacaggccagg-(TAMRA)-3'
3)实时定量荧光PCR管家基因引物及探针序列：
BAC-F(正向引物)：tcacccacactgtgcccatctacga
BAC-R(反向引物)：cagcggaaccgctcattgccaatgg
BAC-P(探针)：atgccctcccccatgccatcctgcgt
4)按下述用量准备PCR反应混合物，96孔反应板，9μL/孔：
8.5μL 2X PCR buffer(Applied Biosystem qPCR MasterMix)
0.17μL正向引物(10μM)
0.17μL反向引物(10μM)
0.17μL探针(10μM)
加8μL基因组DNA
5)盖上反应板盖子，离心200g，1min；
6)运行PCR程序：98℃5s变性，60℃1min，30个循环；
7)分析数据。
5.T细胞产品污染检测
1)厌氧菌和需氧菌无菌检测：
将获得的T细胞接种于厌氧与需氧培养基中，培养时间14天。
2)细菌内毒素检测：采用试剂盒检测。
3)支原体检测：采用试剂盒检测。
4)革兰氏染色检测。

Claims (7)

1.一种用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述评估方法包括检测CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的表达水平，检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功能及效力，检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的细胞成分及细胞分化状态，以及T细胞产品污染检测。
2.根据权利要求1所述的用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的功能及效力包括利用51铬释放细胞毒性试验检测表达该T细胞的特异性杀伤能力和利用细胞内染色流式细胞仪测定法检测该T细胞诱导特异性分泌γ-干扰素的能力。
3.根据权利要求1所述的用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述T细胞产品污染检测包括厌氧菌和需氧菌无菌检测，细菌内毒素检测，支原体检测和革兰氏染色检测。
4.根据权利要求1所述的用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，还包括检测CD19和CD20嵌合抗原受体基因在转化的T细胞中的拷贝数。
5.根据权利要求1所述的用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述检测CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的表达水平采用蛋白质L染色流式细胞仪测定。
6.根据权利要求1所述的用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述检测表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞的细胞成分及细胞分化状态是利用不同的抗体组合，将表达CD19和CD20嵌合抗原受体T细胞用以下免疫荧光标记的抗人CD3，CD4，CD8，CD14，CD45，CD19，CD56，CD45RA和CCR7抗体染色，然后用流式细胞仪分析细胞成分及细胞分化状态。
7.根据权利要求4所述的用于表达嵌合抗原受体的T细胞产品的评估方法，其特征在于：所述检测CD19和CD20嵌合抗原受体基因在转化的T细胞中的拷贝数采用实时定量荧光PCR测定。
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