CN106591246A - 一种重组禽腺联病毒的制备方法及其应用 - Google Patents

一种重组禽腺联病毒的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组禽腺联病毒的制备方法，包括：步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体；步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA；以及步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。本发明还提供了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的应用。本发明制备的重组禽腺联病毒的病毒滴度为常规方法的十倍，同时该重组禽腺联病毒表达的人溶菌酶，能对常见病原菌产生抑菌作用。

Description

一种重组禽腺联病毒的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及病毒技术领域，更具体地说，本发明涉及一种重组禽腺联病毒的制备方法及其应用。
背景技术
溶菌酶是一种天然抗菌剂，溶菌酶不仅对许多革兰阳性细菌具有直接的溶菌作用，对革兰阴性菌以及一些真菌也有一定的抑制作用，对球虫菌发生一定抵抗能力，对病毒复制也有一定的抑制作用。同时，人溶菌酶对人和动物无毒性，不会出现药物残留带来的公共卫生问题，对人体无不良反应和副作用，即使长期使用，也不会产生耐药性。
杆状病毒表达体系是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，是基因工程中四大表达系统之一，其具有外源基因表达量较高、表达蛋白质生物学活性高和安全性高等优点，被广泛应用于基因工程、药物研发、疫苗生产等方面。
重组禽腺联病毒的制备方法由多种，但是通过这些方法制备的重组禽腺联病毒的病毒滴度较低，大大降低了重组禽腺联病毒的使用范围。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供了一种重组禽腺联病毒的制备方法，该方法制备的重组禽腺联病毒不仅成功表达了具有活性作用的外源基因人溶菌酶，而且病毒滴度为常规方法的近10倍。
本发明还有一个目的是制备的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒对常见病原菌能够产生抑制作用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种重组禽腺联病毒的制备方法，包括：
步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep；
步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA，分别标记为Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep；以及
步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。
优选的是，所述的重组禽腺联病毒的制备方法中，所述步骤一中，所述三个重组杆状病毒转移载体的制备方法为：
以pAITR-KLKI、p215C3LYZ为模板，将鸡卵清蛋白基因启动子控制的人溶菌酶基因表达盒插入AAAV的左右ITR之间，获得了标记为pFastBac-AITR-LYZ的重组杆状病毒转移载体；
以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法扩增翻译起始序列修饰的AAAV VP基因，插入杆状病毒表达pFastBac1载体，获得了标记为pFastBac1-VP的重组杆状病毒转移载体；
将pQE-Trisystem中的Δp10启动子-polyA片段插入pFastBac1载体，构建了杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法分别扩增AAAV的Rep78和Rep52基因，再将扩增后的Rep78和Rep52基因通过DNA重组插入所述杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，获得了标记为pFastBac-Dual-Rep的重组杆状病毒转移载体。
其中，pAITR-KLK1是将禽腺联病毒的ITR与KLK1通过重组DNA技术克隆入商品化载体pUCm-T而获得；p215C3LYZ是将LYZ与改造后pcDNA3通过重组DNA技术构建的。
优选的是，所述的重组禽腺联病毒的制备方法中，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的病毒滴度为2.9×1011v.g./mL。
本发明还提供了一种上述重组禽腺联病毒的应用，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒可抑制常见病原菌的活性，具体为：
对表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒进行纯化和浓缩，量取纯化好的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒25μL，在固体培养基平板上分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和白色念珠菌进行体外抑菌活性试验。所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒均可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和白色念珠菌，其抑制圈分别为20mm、20mm、17mm、16mm和14mm。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法制备的重组禽腺联病毒不仅成功表达了具有活性作用的外源基因人溶菌酶，而且病毒滴度为常规方法的近10倍。
2、本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法制备得到的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒对常见病原菌能够产生抑制作用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中标记为pFastBac-AITR-LYZ的重组杆状病毒转移载体的构建思路图；
图2为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-AITR-LYZ的酶切鉴定图；
图3为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-AITR-LYZ的酶切鉴定图；
图4为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中标记为pFastBac1-VP的重组杆状病毒转移载体的构建思路图；
图5为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac1-VP的酶切鉴定图；
图6为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-DualI的酶切鉴定图；
图7为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-Dual-Rep的酶切鉴定图；
图8为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中标记为pFastBac-Dual-Rep的重组杆状病毒转移载体的构建思路图；
图9为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中重组穿梭载体Bacmid-AITR-LYZ DNA的PCR鉴定图
图10为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中重组穿梭载体Bacmid-VP的PCR鉴定图；
图11为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中重组穿梭载体Bacmid-Rep的PCR鉴定图；
图12为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV的Rep52基因PCR检测图；
图13为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV中LYZ的WesternBlotting检测图；
图14为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV-hLYZ的点杂交图；
图15本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV-KLKI的透射电镜图；
图16为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中人溶菌酶的平板抑菌试验示意图；
图17为本发明所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV-hLYZ对常见菌的抑菌试验。
具体实施方式
下面结合附图以及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep；
利用DNA重组技术，在pAITR-KLKI、p215C3LYZ基础上，将鸡卵清蛋白基因启动子控制的人溶菌酶基因表达盒插入AAAV的左右ITR之间，获得了经酶切鉴定正确的重组载体pFastBac-AITR-LYZ，构建思路如图1所示，鉴定图如图2和图3所示，图2为pFastBac-AITR-LYZ的酶切鉴定，M:λDNA/Eco 1301marker，1:XhoI酶切，2:SnaBI酶切；图3中M:λDNA/Eco1301marker，1:EcoRV单酶切；
以实验室已经构建的pCR-AAAV为模板，利用PCR方法扩增翻译起始序列修饰的AAAV VP基因，插入杆状病毒表达载体pFastBac1，获得了经酶切鉴定正确的重组载体pFastBac1-VP，构建思路如图4所示，鉴定图如图5所示，图5为pFastBac1-VP的酶切鉴定，M:λDNA/Eco 1301marker，1:EcoRI和HindⅢ双酶切；
将由上海生物工程公司合成得pQE-Trisystem中的Δp10启动子-polyA片段插入pFastBac1载体，构建了杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，酶切鉴定如图6所示，M：λDNA/Eco 1301marker；1：EcoRV和Eco01091双酶切；2：XbaI单酶切；以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法分别扩增AAAV的Rep78和Rep52基因，再将这两基因通过DNA重组插入pFastBac-DualI，获得了经酶切鉴定正确的重组载体pFastBac-Dual-Rep，鉴定如图7，M：λDNA/Eco 1301marker；1：XbaI和EcoRV双酶切；具体构建思路如图8；
最终成功构建了三个必需转移载体pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep。
二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA，分别标记为Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep；
常规方法提取已经获得的pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep重组穿梭载体质粒DNA，将三个重组穿梭载体质粒DNA分别转座于DH10Bac感受态细胞，筛选后按改良的碱裂解法提取Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep重组穿梭载体质粒DNA，分别以这些质粒为模板，以M13/PUC通用测序引物为上下游引物进行PCR扩增鉴定，分别得到图9(重组穿梭载体Bacmid-AITR-LYZ DNA的PCR鉴定：M：λDNA/Eco1301marker；1：PCR扩增产物)、图10(重组穿梭载体Bacmid-VP的PCR鉴定：M：λDNA/Eco 1301marker；1：PCR扩增产物)和图11(重组穿梭载体Bacmid-Rep的PCR鉴定：M：λDNA/Eco 1301marker；1：PCR扩增产物)的片段与预期结果一致，从而成功获得重组穿梭载体质粒Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep。
三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒；
按改良的碱裂解法提取重组穿梭载体质粒Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep质粒DNA，并将这三种质粒与转染试剂PEI按照一定比例混匀后转染状态良好的Sf9昆虫细胞，在转染3天之后，可见细胞生长速度明显减慢、形态发生明显变化，由此可推测上述三质粒转染Sf9昆虫细胞，产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。
收集转染细胞，利用反复冻融法收获重组病毒悬液，然后用DNase消化以去除其中的残余质粒DNA及其可能导致的PCR检测假阳性，再利用常规方法提取重组病毒基因组DNA。以病毒基因组DNA为模板，Rep52基因特异引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离后可见预期大小(约1500bp)的特异条带，如图12所示，M：λDNA/Eco 1301marker；1：Rep52基因扩增产物。
将收获的病毒悬液超声裂解后进行变性SDS-PAGE，然后以兔抗人溶菌酶(hLYZ)多克隆抗体为第一抗体，HRP-标记的羊抗兔IgG为第二抗体对样品进行重组人溶菌酶的Western bloting检测，结果显示在14.7KD处有特异性条带出现，如图13所示，1：hLYZ标准品；2：转染细胞液；3：空白对照。
由此证实，通过共转染三个产生重组禽腺联病毒的必需穿梭质粒，获得了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒，为重组禽腺联病毒的大规模制备和重组禽腺联病毒介导的鸡输卵管生物反应器研究奠定了基础。
四、表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒活性与表达量测定方法的建立
采用常规方法对表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒进行浓缩、纯化，用生物素标记的LYZ为探针通过点杂交的方法来测定纯化、浓缩后病毒液中表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的物理滴度，以p215C3LYZ质粒为阳性对照，提取的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的基因组DNA为样品，通过比较杂交信号的强弱来判断重组病毒的物理滴度。结果，测定纯化、浓缩后病毒液中表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的物理滴度为2.9×1011v.g./mL，如图14所示，1：rAAAV-hLYZ基因组DNA样品从左到右依次为：4μl、2μl、1μl及阴极对照；2：p215C3LYZ为阳性对照从左到右依次为8ng、4ng、2ng、1ng。比传统三质粒转染真核细胞获得的重组病毒滴度高了近10倍，已经报道的是2.632×1010v.g./ml。
将纯化、浓缩后的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒进行透射电镜观察，如图15所示，其电镜倍数为×54800，可以看见许多大小均一且完整的病毒颗粒，以实心颗粒为主，极少数的空心颗粒，说明获得了完整的病毒颗粒，跟传统三质粒转染真核细胞获得的重组病毒相一致，具有病毒活性。
选取工程菌微球菌为检测菌，在细菌平板上分别加入不同批次的纯化后表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒，同时设人溶菌酶标准品为阳性对照，37℃，24h后观察结果，如图16所示，其中，1-5为不同批次重组病毒液，6为标准品。结果表明表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒表达的人溶菌酶有抑菌活性。
以上结果证实，利用杆状病毒表达体系制备重组禽腺联病毒，不仅获得了高滴度的重组禽腺联病毒，同时成功表达了具有活性作用的人溶菌酶。
五、表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒对常见病原菌抗菌活性的初步研究
将纯化好的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒溶液25μL(病毒约为7.2×1010v.g)，在固体培养基平板上对常见病原菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠菌进行体外抑菌活性实验，如图17显示了rAAAV-hLYZ对常见病原菌的抑菌试验，且图17中自左至右依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠菌，结果显示：对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌均有抑制作用，抑菌圈分别为：20mm、20mm、17mm和16mm；对白色念珠菌抑菌圈为14mm。
本发明构建的昆虫细胞生产重组禽腺联病毒表达体系表达的外源基因人溶菌酶能对常见病原菌产生抑制作用，有望进一步实现重组人溶菌酶的大量生产与开发利用，为重组禽腺联病毒介导的输卵管生物反应器的进一步研究奠定了基础，具有重要的应用价值。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节与这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一种重组禽腺联病毒的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep；
步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA，分别标记为Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep；以及
步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。
2.如权利要求1所述的重组禽腺联病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述三个重组杆状病毒转移载体的制备方法为：
以pAITR-KLKI、p215C3LYZ为模板将鸡卵清蛋白基因启动子控制的人溶菌酶基因表达盒插入AAAV的左右ITR之间，获得了标记为pFastBac-AITR-LYZ的重组杆状病毒转移载体；
以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法扩增翻译起始序列修饰的AAAV VP基因，插入杆状病毒表达pFastBac1载体，获得了标记为pFastBac1-VP的重组杆状病毒转移载体；
将pQE-Trisystem中的Δp10启动子-polyA片段插入pFastBac1载体，构建了杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法分别扩增AAAV的Rep78和Rep52基因，再将扩增后的Rep78和Rep52基因通过DNA重组插入所述杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，获得了标记为pFastBac-Dual-Rep的重组杆状病毒转移载体。
3.如权利要求1所述的重组禽腺联病毒的制备方法，其特征在于，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的病毒滴度为2.9×1011v.g./mL。
4.一种如权利要求1～3所述的重组禽腺联病毒的应用，其特征在于，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒可抑制常见病原菌的活性，具体为：
对表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒进行纯化和浓缩，量取纯化好的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒25μL，在固体培养基平板上分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和白色念珠菌进行体外抑菌活性试验。
5.如权利要求4所述的重组禽腺联病毒的应用，其特征在于，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒均可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和白色念珠菌，其抑制圈分别为20mm、20mm、17mm、16mm和14mm。
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CN110540996A (zh) * 2019-08-29 2019-12-06 华中农业大学 一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因、其编码的gLysi2蛋白及其应用

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