CN106570484B - 基于序列切片的显微镜图像采集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于序列切片的显微镜图像采集方法。该方法包括获取序列切片样本及其导航图;采用图像处理与机器学习的方法对导航图中的序列切片样本进行识别标记;将序列切片样本置于显微镜中,将导航图中任一像素点导航定位至显微镜视场中心;在低分辨率视场下定位序列切片样本,进行样本采集参数的装订;基于样本采集参数的装订,记录高分辨率采集区域的中心点与样本模板匹配后的中心点之间的相对位置关系;结合样本采集参数及相对位置关系,进行样本点的图像连续采集。通过该技术方案解决了如何高效地完成感兴趣样本区域图像的自动采集的技术问题,实现了大规模序列样本在带有自动控制接口的显微镜(电子或光学)下连续区域的自动化成像。
Description
技术领域
本发明实施例涉及成像技术领域,具体涉及一种基于序列切片的显微镜图像采集方法。
背景技术
超薄序列切片三维成像技术,是指将生物组织切分成超薄序列断面或切片,并使用电子显微镜对其逐一成像的技术;按照不同的切分技术主要分为序列断面成像和序列切片成像两种:(1)序列断面成像方式是切片和成像结合在电镜样品腔内完成,该类方法在横向和纵向上分辨率接近,具备各向同性,而缺点在于损毁性切片方式,一旦发现数据出现缺陷,将无法修复,不利于大规模重建工作的开展;(2)序列切片成像方式将样品使用超薄切片装置切分成序列切片,用亲疏水性适合的基片收集后放入电镜内对序列切片成像。
序列切片可以通过自动收片机自动收集或者是人工手动收集;自动收集技术正在不断发展,自动收片具有收片密度均匀、节省人力等优点;但存在收片质量不稳定、样本切片空间利用率低等缺点。目前,绝大多数的切片是靠手动收取并放置在载物座上的,手工收片具有速度快、方案灵活且收片技术成熟的优点;但手工收片也有切片分布密度大、收片方位角度不一致的缺点,如图1所示。目前针对序列切片的显微镜图像自动采集是一项需要解决的难题。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明实施例提供一种基于序列切片的显微镜图像采集方法,以解决如何高效地完成感兴趣样本区域图像的自动采集的技术问题。
为了实现上述目的,提供了以下技术方案:
一种基于序列切片的显微镜图像采集方法,其特征在于,所述方法包括:
获取序列切片样本及其导航图;
采用图像处理与机器学习的方法对所述导航图中的所述序列切片样本进行识别标记;
将所述序列切片样本置于所述显微镜中,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵,将所述导航图中任一像素点导航定位至显微镜视场中心;
在低分辨率视场下定位所述序列切片样本,进行样本采集参数的装订;
基于所述样本采集参数的装订,记录高分辨率采集区域的中心点与样本模板匹配后的中心点之间的相对位置关系;
结合所述样本采集参数及所述相对位置关系,进行样本点的图像连续采集。
优选地,所述采用图像处理与机器学习的方法对所述导航图中的所述序列切片样本进行识别标记,具体包括:
采用Mean-Shift算法对所述导航图进行分割,得到前景样本目标区域与背景区域;
计算所述前景样本目标区域与所述背景区域边缘轮廓的最小外接矩形;
将所述前景样本目标区域与所述背景区域边缘轮廓的所述最小外接矩形与样本模板的最小外接矩形进行比对,剔除宽长比和面积大小相差过大的前景样本目标区域与背景区域;
确定如下激励函数:
其中,所述y表示所述激励函数;所述Si表示滑动窗口区域特征值的欧式距离,所述Si=‖(μi,σi)-(μ1,σ1)‖;所述Bi表示样本特征值的欧式距离,所述Bi=‖(μi,σi)-(μ2,σ2)‖;所述μ1表示样本目标区域的均值;所述σ1表示所述样本目标区域的方差;所述μ2表示非样本背景区域的均值;所述σ2表示非样本背景区域的方差;所述μi表示滑动窗口区域内的均值;所述σi表示所述滑动窗口区域内的方差;W表示权值;
对所述激励函数的结果进行阈值分割,确定所述导航图中正样本的位置;
以所述导航图中正样本的位置为中心点对所述导航图进行截取,得到训练集正样本,并且采集所述导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像,得到训练集负样本;
归一化所述训练集正样本和所述训练集负样本,并提取HOG特征;
利用SVM分类器对所述导航图进行检测,得到样本切片位置;
将剔除操作得到的最小外接矩形与所述样本切片位置进行融合,实现对所述序列切片样本的识别标记。
优选地,所述采集所述导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像,得到训练集负样本,具体包括:
对所述导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像进行旋转、叠加随机噪声、模糊及伽马变换,得到训练集负样本。
优选地,所述将所述序列切片样本置于所述显微镜中,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵,将所述导航图中任一像素点导航定位至显微镜视场中心,具体包括:
选取所述导航图中任意不在同一直线上的三个点,并记录所述三个点在所述导航图中的像素坐标位置;
确定所述三个点在成像中心时的显微镜载物台的位置;
基于所述三个点在所述导航图中的所述像素坐标位置和所述三个点在成像中心时的显微镜载物台的所述位置,根据空间坐标仿射变换方法,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵;
利用坐标转换矩阵,将所述导航图中任一像素点投影至显微镜视场中的对应位置,从而将所述导航图任一像素点导航定位至所述显微镜视场中心。
优选地,所述在低分辨率视场下定位所述序列切片样本,进行样本采集参数的装订,具体包括:
设置高分辨率下清晰成像参数,并将低分辨率下清晰成像图像经高斯模糊之后,作为样本模板,并基于低分辨率下清晰成像参数和所述样本模板建立样本数据库;
依次将所述显微镜导航对应于样本点上,并结合所述样本数据库,进行样本采集参数的装订。
优选地,所述依次将所述显微镜导航对应于样本点上,并结合所述样本数据库,进行样本采集参数的装订,具体包括:
确定多尺度多角度模板匹配中心点位置,并将其存入样本数据库;
将所述显微镜视场中心移动至所述序列切片样本在显微镜坐标系的位置,并快速扫描成像图像,并对所述扫描成像图像使用三分点的牛顿二插法逼近图像质量的局部最优值,得到当前参数附近的清晰成像参数;
基于所述样本数据库,对所述清晰成像参数进行参数装订。
优选地,所述确定多尺度多角度模板匹配中心点位置具体包括:
计算所述样本模板和待搜索扫描图像的图像金字塔;
设定旋转角度范围、粗略角度及其区间和精细角度及其区间;
将所述待搜索扫描图像旋转所述粗略角度和所述精细角度,并针对图像金字塔顶层,对旋转后的图像与所述样本模板进行归一化互相关运算,确定匹配最佳点;
以上一层的匹配最佳点对应的本层的点为中心的一子区域,对旋转后的图像与样本模板进行归一化互相关运算,将图像金字塔最底层的匹配最佳点确定为所述多尺度多角度模板匹配中心点位置。
优选地,所述得到当前参数附近的清晰成像参数具体包括:
采用离散化高斯卷积核对所述扫描成像图像进行卷积,得到输出图像;
对所述输出图像进行高斯差分运算;
将均值卷积核与高斯差分运算结果进行卷积,得到卷积结果;
对所述卷积结果进行阈值截断,得到截断结果;
基于所述截断结果根据以下公式计算图像质量的评估值:
其中,所述Value表示所述图像质量的评估值;所述Imgth表示所述截断结果;所述Sum(Imgth)表示截断结果像素总和;所述W(Imgth)表示所述截断结果的宽度;所述H(Imgth)表示所述截断结果的高度;
将所述图像质量的评估值作为当前扫描参数下的清晰度相对计算值,并采用局部最优化算法逐步逼近局部最优值,得到当前参数附近的所述清晰成像参数。
优选地,所述结合所述样本采集参数及所述相对位置关系,进行样本点的图像连续采集,具体包括:
读取样本采集参数;
将所述显微镜视场中心移动到需要进行高分辨率成像的位置,并设置扫描偏转角;
调整成像参数;
通过仿射变换矩阵将多区域采集点反算至显微镜实际坐标系;
将所述显微镜视场中心移动至所述显微镜实际坐标系逐点扫描预设的高分辨率图像,完成样本点多区域的图像采集;
基于各所述样本点多区域的图像采集,输出连续样本图像。
与现有技术相比,上述技术方案可以具有以下有益效果:
本发明实施例提供一种基于序列切片的显微镜图像采集方法。该方法包括获取序列切片样本及其导航图;采用图像处理与机器学习的方法对导航图中的序列切片样本进行识别标记;将序列切片样本置于显微镜中,将导航图中任一像素点导航定位至显微镜视场中心;在低分辨率视场下定位序列切片样本,进行样本采集参数的装订;基于样本采集参数的装订,记录高分辨率采集区域的中心点与样本模板匹配后的中心点之间的相对位置关系;结合样本采集参数及相对位置关系,进行样本点的图像连续采集。通过该技术方案解决了如何高效地完成感兴趣样本区域图像的自动采集的技术问题,实现了在完整导航图中自动化地识别出每个切片样本的像素坐标,利用完整导航图将显微镜的视场中心定位到每一个样本切片位置并计算出该样本收片时的旋转角度,快速地判别显微镜扫描图像的清晰度,还实现了大规模序列样本在带有自动控制接口的显微镜(电子或光学)下连续区域的自动化成像,适用于立体切割后的大范围序列样本(断层)显微镜三维成像;特别适合收集在大面积平面载体(半导体晶圆)上的序列样本,比如超薄序列切片三维成像技术。
附图说明
图1为根据本发明实施例的基于序列切片的显微镜图像采集方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来详细地说明本发明。
针对序列切片的显微镜图像自动采集,本发明实施例提出一种基于序列切片的显微镜图像采集方法,如图1所示,该方法可以包括:步骤S100至步骤S150。其中:
S100:获取序列切片样本及其导航图。
其中,导航图的获取可以通过光学相机完整拍摄,也可以通过高分辨率显微镜拍摄局部图像,然后再拼接成完整的导航图来获得。
S110:采用图像处理与机器学习的方法对导航图中的序列切片样本进行识别标记。
本步骤记录每一个序列切片样本在导航图中的坐标点位置,进而能够确定每一个序列切片样本在导航图中的确切位置。
具体地,本步骤可以包括:
S111:采用Mean-Shift算法对导航图进行分割,得到前景样本目标区域与背景区域。
例如,可以利用N×N的滑动窗口依次滑过整幅导航图,来对图像进行分割,分割出前景样本目标区域与背景区域。其中,N表示像素单位;步进可根据实际样本灵活设置,优选地,步进为N/9(取整)。
S112:计算前景样本目标区域与背景区域边缘轮廓的最小外接矩形。
计算轮廓的最小外接矩形的方法例如可以先对区域进行二值化,然后对二值化后的图像进行拉普拉斯算子运算,最后依次连接最大值点,从而得到最小外接矩形。
S113:将前景样本目标区域与背景区域边缘轮廓的最小外接矩形与样本模板的最小外接矩形进行比对,剔除宽长比和面积大小相差过大的前景样本目标区域与背景区域。
本步骤中误差允许范围为10%。
S114:确定如下激励函数:
其中,y表示激励函数;Si表示滑动窗口区域特征值的欧式距离,Si=‖(μi,σi)-(μ1,σ1)‖;Bi表示样本特征值的欧式距离,Bi=‖(μi,σi)-(μ2,σ2)‖;μ1表示样本目标区域的均值;σ1表示样本目标区域的方差;μ2表示非样本背景区域的均值;σ2表示非样本背景区域的方差;μi表示滑动窗口区域内的均值;σi表示滑动窗口区域内的方差;W表示权值,用来调节求和式的两项的权值,优选地,W为500。
样本目标区域与非样本背景区域的均值与方差(样本特征值)可以通过输入导航图,选取样本模板,然后对选取的样本模板切片进行采样和统计而得到。
S115:对激励函数的结果进行阈值分割,确定导航图中正样本的位置。
其中,示例性地,阈值分割可以按照以下方式进行:根据激励函数的结果,设定阈值,然后进行阈值二值化,以实现阈值分割。其中,二值化阈值可以通过诸如k-means聚类方法等来获得。
在确定导航图中正样本的位置时,例如,可以根据二值化的结果,选择高于阈值的位置(图像区域)为正样本的位置。
本步骤通过导航图中正样本的位置,截取图像区域,从而构成训练集。
S116:以导航图中正样本的位置为中心点对导航图进行截取,得到训练集正样本,并且采集导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像,得到训练集负样本。
进一步地,得到训练集负样本的步骤具体可以包括:对导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像进行旋转、叠加随机噪声、模糊及伽马变换,来得到训练集负样本。
本步骤对通过导航图中正样本的位置得到的训练集进行样本更新。
其中,例如可以截取N×N(像素单位)的图像,作为训练集正样本。
旋转、叠加随机噪声、模糊(例如:高斯模糊)及伽马变换为样本增益的过程,这是为了防止训练带来过拟合的问题。
S117:归一化训练集正样本和训练集负样本,并提取HOG特征。
在实际应用中,可以使用Nv维度的HOG特征向量,较佳地,Nv=8100。
本步骤可以利用HOG特征进行SVM分类器训练。
S118:利用SVM分类器对导航图进行检测,得到样本切片位置。
例如,可以使用训练好的SVM分类器,采取N×N(像素单位)的滑动窗口对完整的导航图进行自动检测,从而得到样本切片位置。
S119:将步骤S113得到的最小外接矩形与样本切片位置进行融合,实现对序列切片样本的识别标记。
在实际应用中,会存在漏检的情况,但是,漏检的切片不会完全一致,因此,采用融合的办法可提高检测准确率。
优选地,在步骤S119之后还可以包括步骤S119a。
S119a:通过手工方式确认融合结果的正确性,并输出导航图自动识别检测结果。
S120:将序列切片样本置于显微镜中,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵,将导航图中任意像素点导航定位至显微镜视场中心。
具体地,本步骤可以进一步包括:
S121:选取导航图中任意不在同一直线上的三个点,并记录该三个点在导航图中的像素坐标位置。
S122:确定该三个点在成像中心时的显微镜载物台的位置。
本步骤可以通过在显微镜下观察来确定。
S123:基于步骤S121和步骤S122的结果,根据空间坐标仿射变换方法,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵。
S124:利用坐标转换矩阵,将导航图中任一像素点投影至显微镜视场中的对应位置,从而将导航图任一像素点导航定位至显微镜视场中心。
作为示例,假设:取导航图中任意不在同一直线上的三个点为:P1、P2和P3,三个点在导航图中的像素坐标位置,以向量表示为A(a1,a2,a3),其中a1(w1,h1)。三个点在成像中心时的显微镜载物台的位置,记为B(b1,b2,b3),其中b1(x1,y1)。
步骤A:利用以下公式求解坐标转换矩阵:
B=M·A
其中,M表示坐标转换矩阵。
步骤B:求解如下公式:
b=M·a
其中,a表示导航图中任意像素点;b表示显微镜视场中与a对应的位置。
上述公式通过下式来求解:
Si=‖(μi,σi)-(μ1,σ1)‖
由于Si=‖(μi,σi)-(μ1,σ1)‖为一个三元一次方程组,因此最少需要三个不在同一直线上的坐标点,才能求解出M中的系数。
步骤C:使用显微镜的自动控制接口中的位移指令,完成导航图点击定位每一个样本切片。
S130:在低分辨率视场下定位序列切片样本,进行样本采集参数的装订。
为了保证图像自动采集的顺序,可以建立每一批次样本的数据库表格,按照收片顺序依次存储相关参数。通过较低分辨率下的快速扫描,对全部样本按顺序完整地扫描一遍,完成样本采集参数的装订,并将采集的参数保存起来,从而装订完成每一个样本的位置、方位角以及清晰化成像参数。
具体地,本步骤可以进一步包括:
S131:设置高分辨率下清晰成像参数,并将低分辨率下清晰成像图像经高斯模糊之后,作为样本模板,并基于低分辨率下清晰成像参数和样本模板建立样本数据库。
连续切片的自动采集是一个长时间的采集过程,持续数间可能长至数天或几周;以第一个样本作为基本初始化样本,记录拍摄高分辨率图像,由于连续切片之间切片的状态有连续性,状态改变不大;但还是存在微小的差别,鉴于此,当采集后续样本时,需要在前一个样本的电镜状态参数上进行微调。
在具体实施过程中,可以将连续序列样本第一个点作为基本初始化点,调试并设置高分辨率下清晰成像参数,并将该清晰成像参数存储至样本数据库表格。这里,高分辨率可以根据成像需求设置,一般设置在2000倍以上。清晰是指图像中的边缘清晰。
任意选取一块完整的样本作为匹配模板,将低分辨率下清晰成像图像经高斯模糊之后,保存为样本模板(即切片样本模板)并连同成像参数一同保存至样本数据库表格。
这里,低分辨率下可以为放大倍数在70至150倍的情况。样本模板可以视为低分辨率下样本的缩略照。
因为此前记录的样本位置是在导航图中识别出来的,但是在电子显微镜中,该样本位置还是会存在偏差,使得样本不会位于显微镜视场的正中心位置,所以,需要采用旋转模板匹配的方法将样本移动到同样本模板成像一致的位置上去。其中样本模板的分辨率可为设置为512、1024或2048。扫描分辨率可以设置为两倍的样本模板的分辨率。
在具体实施过程中,可以对下式进行离散化,以实现高斯模糊:
其中,σ表示高斯分布参数;x、y表示像素的横纵坐标。
优选地,高斯卷积核(各向同性)的宽度为27。
S132:依次将显微镜导航对应于样本点上,并结合样本数据库,进行样本采集参数的装订。
本步骤可以按照样本数据库表格的顺序依次将显微镜导航对应样本点上,并进行参数装订。
具体地,本步骤可以进一步包括:
S1321:确定多尺度多角度模板匹配中心点位置,并将其存入样本数据库。
具体地,本步骤可以进一步包括:
S13211:计算样本模板和待搜索扫描图像的图像金字塔。
其中,待搜索扫描图像为导航图上的其他包含切片的图像区域。
由于显微镜的图像很大,如果直接计算多角度的匹配最佳点(即最佳匹配点),这是很耗费时间的,所以,本发明实施例采取图像金字塔的策略。在图像金字塔中,每一层都是下面一层的下采样(优选地,长宽各为一半)。
本发明实施例可以利用递归下采样的方法建立模板图像和待搜索扫描图像的图像金字塔。
在具体实施过程中,可以根据下式进行递归的下采样,计算模板图像和待搜索扫描图像的图像金字塔,直到图像的最小边小于64为止:
Imgn+1=fdownsample(Imgn),n>0
l=Min(m,n)|Max(W(ImgModm),H(ImgModm))
≤64,Max(W(ImgObsn),H(ImgObsn))≤64)
其中,fdownsample(Imgn)表示递归的下采样;ImgMod表示样本模板;ImgObs表示待搜索扫描图像;W(ImgModm)表示样本模板的宽度;H(ImgModm)表示样本模板的高度;W(ImgObsn)表示待搜索扫描图像的宽度;H(ImgObsn)表示待搜索扫描图像的高度;m表示样本模板的金字塔层级;n表示待搜索扫描图像的金字塔层级;l表示最终对样本模板和待搜索扫描图像两幅图像生成图像金字塔的层数。n=0表示金字塔最底层的原始图像。
S13212:设定旋转角度范围、粗略角度及其区间和精细角度及其区间。
本步骤初始化旋转角度范围Aglt、粗略角度区间AglC和精细角度区AglF。其中,Aglt代表跟切片样本模板匹配角度范围预设值的绝对值,优选地,Aglt为90°。粗略角度区间可以划定180度的角度范围,优选地,AglC为10°。对粗略角度区间进行划分的结果为粗略角度θi,i=1,2…N,N取正整数。精细角度区间优选地为1°。对精细角度区间进行划分的结果为精细角度αj,j=1,2…M,M取正整数。对旋转角度范围的划分结果为θi±αj。
S13213:将待搜索扫描图像旋转粗略角度和精细角度,并针对图像金字塔顶层,对旋转后的图像与样本模板进行归一化互相关运算,确定匹配最佳点。
本步骤自图像金字塔顶层开始进行模板匹配,进行归一化互相关运算,可以得到本层的最佳匹配位置(最佳匹配点)。
具体地,本步骤可以包括:
SA1:将待搜索扫描图像ImgObs依次旋转粗略角度θi,得到
SA2:按照下式,对和样本模板进行归一化互相关运算,得到匹配度概率图:
式中,x、y表示搜索图像中像素坐标;R(x,y)表示矩阵R在(x,y)点的值,也即模板图像坐标位置;x′、y′表示样本模板中像素的坐标;ImgT表示样本模板ImgMod;ImgI表示
SA3:选取匹配度概率图中最大值所在旋转角度θc图像的匹配点为匹配最佳点(也可以称之为最佳匹配点)。其中,θc表示粗略角度,1≤c≤N,N取正整数。
下面以一优选实施例来详细说明得到匹配最佳点的过程。
SB1:根据下式确定粗略匹配位置结果:
式中,表示金字塔最顶层中的匹配最佳点;R(p(i,j))表示匹配点p(i,j)的R矩阵;R(xi,yj)表示像素点(xi,yj)的R矩阵;0≤i≤W(R),0≤j≤H(R),1≤c≤N。其中,W(R)表示R矩阵的宽度;H(R)表示R矩阵的高度,N取正整数。
SB2:将待搜索扫描图像依次旋转θc±αj,j=1,2…M角度。
SB3:对待搜索扫描图像和样本模板进行归一化互相关运算。
SB4:取所有单幅匹配值最佳结果中的最大值所在旋转角度θc+αF图像的匹配点作为匹配最佳点
其中,αF表示精细角度,1<F<M。
S13214:以上一层的匹配最佳点对应的本层的点为中心的一子区域,对旋转后的图像与样本模板进行归一化互相关运算,将图像金字塔最底层的匹配最佳点确定为多尺度多角度模板匹配中心点位置。
在进行模板匹配的时候,从顶层开始,以上一层的匹配最佳点对应的本层的点为中心的一个子区域(其可以为矩形子图,其长度length=2×Max(W(ImgModlp),H(ImgModlp),W(ImgModlp)表示模板图像的宽度,H(ImgModlp)表示模板图像的高度,l-1≥lp≥0,如边界超出,则将滑动窗口自动平移至边界内部),进行归一化互相关运算,得到本层的最佳匹配位置。以此类推,最终得到图像金字塔最底层的最佳匹配位置。通过建立图像金字塔,可以加速模板匹配操作,效率可以提高1到2个数量级。
S1322:将显微镜视场中心移动至序列切片样本在显微镜坐标系的位置,并快速扫描成像图像,并对扫描成像图像使用三分点的牛顿二插法逼近图像质量的局部最优值,得到当前参数附近的清晰成像参数。
具体地,本步骤可以进一步包括:
S13221:采用离散化高斯卷积核对扫描成像图像进行卷积,得到输出图像。
扫描成像图像可以是导航图上任意一个需要采集的区域,其可以实时获取。
可以根据下式的离散化高斯卷积核对待检测图像进行卷积计算:
其中,ln表示双向同性边长,ln取奇数,优选地,ln为3;x、y表示像素坐标;σ表示高斯分布参数。
S13222:对输出图像进行高斯差分运算。
具体地,本步骤可以根据以下高斯差分算子进行高斯差分运算:
DoGln,dln(Img)=ABS(Gln(Img)-Gln+dln(Img))
其中,ln取奇数,优选地,ln为3;dln为大于0的偶数,优选地,dln取64;DoGln,dln(Img)表示进行高斯差分运算;ABS(·)表示对图像取绝对值;Gln+dln(Img)表示模糊程度不同的高斯图像;Gln(Img)表示步骤S13221得到的输出图像。
S13223:将均值卷积核与高斯差分运算结果进行卷积,得到卷积结果。
例如:可以采用nc×nc,(优选地,nc取5)的均值卷积核Enc同ImgDoG进行卷积。其中,ImgDoG表示高斯差分运算结果。
S13224:对卷积结果进行阈值截断,得到截断结果。
作为示例,可以根据下式进行截断:
Imgconv(i,j)=0|Imgconv(i,j)<Ththresh
其中,Imgconv(i,j)表示卷积结果(卷积图像)上的某一像素的位置;Ththresh表示截断阈值。
根据以下公式求取截断阈值:
Ththresh=Sum(Imgconv)/num
其中,Sum(Imgconv)表示图像像素值总和;num表示非零点统计数;Imgconv表示均值卷积核与高斯差分运算结果进行卷积的卷积结果;Ththresh表示截断阈值。
S13225:基于截断结果根据以下公式计算图像质量的评估值:
其中,Value表示图像质量的评估值;Imgth表示截断结果;Sum(Imgth)表示截断结果像素总和;W(Imgth)表示截断结果的宽度;H(Imgth)表示截断结果的高度。
S13226:将图像质量的评估值作为当前扫描参数下的清晰度相对计算值,并采用局部最优化算法逐步逼近局部最优值,得到当前参数附近的清晰成像参数。
其中,本步骤可以采用牛顿二分法来做逐步逼近。例如:假定当前显微镜在状态S的情况下采集到图像的评估值为Value,那么调节显微镜的相关参数使得显微镜处于状态Si+中。这里,正号+表示参数的调节方向。所调节的显微镜的相关参数例如可以为调焦参数,在具体实施过程中,该参数可以根据不同的显微镜来定,可根据显微镜的型号、厂商的不同而有所不同。调节之后,获得Valuei+,若Valuei+>Value,则将Valuei+设置为Value并重复直到小于Value后,取(Value+Valuei+)/2作为新的Value,直到新的Value和上次的Value之间的间隔小于一个阈值θ,该θ也是需要根据显微镜的具体型号来确定。
S1323:基于多尺度多角度模板匹配中心点位置,对清晰成像参数进行参数装订。
将清晰成像参数(样本采集参数)保存至样本数据库表格,并进行样本数据库中所有样本的参数装订。
S140:基于样本采集参数的装订,记录高分辨率采集区域的中心点与样本模板匹配后的中心点之间的相对位置关系。
在进行本步骤之前可以初始化高分辨率的采集区域。在进行采集时,首先找到样本模板中心,再根据上述相对位置关系移动到感兴趣的区域。
S150:结合样本采集参数及相对位置关系,进行样本点的图像连续采集。
本步骤结合样本采集参数,进行样本点的导航定位、目标区域精细定位、采集图像清晰度实时调整、大区域子图像连续采集。
具体地,本步骤可以进一步包括:
S151:读取样本采集参数。
本步骤可以从装订好的样本数据库表格中读取该样本点装订的样本采集参数。
S152:将显微镜视场中心移动到需要进行高分辨率成像的位置,并设置扫描偏转角。
具体地,本步骤可以包括:基于样本模板,使用多尺度多角度归一化互相关算法进行样本模板匹配,定位样本在显微镜坐标系的位置以及样本和模板之间的扫描偏转角。扫描偏转角可以为电子束或光源的扫描偏转角。
S153:调整成像参数。
在实际应用中,可以按照工作焦距、双向相散、工作焦距的顺序调整成像参数。
S154:通过仿射变换矩阵将多区域采集点反算至显微镜实际坐标系。
其中,多区域采集点为每块切片对应的感兴趣区域。
在具体实施过程中,可以建立位移为0,扫描偏转角为θc0+αF0的仿射变换矩阵Mr,将多区域采集点pi通过Mr反算至显微镜实际坐标系pi′。其中,θc0表示粗略角度,1<c0<N,N取正整数;αF0表示精细角度,1<F0<M,M取正整数。
S155:将显微镜视场中心移动至显微镜实际坐标系逐点扫描预设的高分辨率图像,完成样本点多区域的图像采集。
例如:移动显微镜视场中心点至pi′,设置扫描偏转角为θc0+αF0;逐点扫描预设的高分辨率图像。
为了采集出高质量的图像,在采集之后还需要进行图像质量评估,对于图像质量过差的情况需要重新采集。
S156:基于各样本点多区域的图像采集,输出连续样本图像。
上述实施例中虽然将各个步骤按照上述先后次序的方式进行了描述,但是本领域技术人员可以理解,为了实现本实施例的效果,不同的步骤之间不必按照这样的次序执行,其可以同时(并行)执行或以颠倒的次序执行,这些简单的变化都在本发明的保护范围之内。
还应当注意,本说明书中使用的语言主要是为了可读性和教导的目的而选择的,而不是为了解释或者限定本发明的主题而选择的。
本发明并不限于上述实施方式,在不背离本发明实质内容的情况下,本领域普通技术人员可以想到的任何变形、改进或替换均落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于序列切片的显微镜图像采集方法,其特征在于,所述方法包括:
获取序列切片样本及其导航图;
采用图像处理与机器学习的方法对所述导航图中的所述序列切片样本进行识别标记;
将所述序列切片样本置于所述显微镜中,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵,将所述导航图中任一像素点导航定位至显微镜视场中心;
在低分辨率视场下定位所述序列切片样本,进行样本采集参数的装订;
基于所述样本采集参数的装订,记录高分辨率采集区域的中心点与样本模板匹配后的中心点之间的相对位置关系;
结合所述样本采集参数及所述相对位置关系,进行样本点的图像连续采集;
其中,所述采用图像处理与机器学习的方法对所述导航图中的所述序列切片样本进行识别标记,具体包括:
采用Mean-Shift算法对所述导航图进行分割,得到前景样本目标区域与背景区域;
计算所述前景样本目标区域与所述背景区域边缘轮廓的最小外接矩形;
将所述前景样本目标区域与所述背景区域边缘轮廓的所述最小外接矩形与样本模板的最小外接矩形进行比对,剔除宽长比和面积大小相差过大的前景样本目标区域与背景区域;
确定如下激励函数:
其中,所述y表示所述激励函数;所述Si表示滑动窗口区域特征值的欧式距离,所述Si=‖(μi,σi)-(μ1,σ1)‖;所述Bi表示样本特征值的欧式距离,所述Bi=‖(μi,σi)-(μ2,σ2)‖;所述μ1表示样本目标区域的均值;所述σ1表示所述样本目标区域的方差;所述μ2表示非样本背景区域的均值;所述σ2表示非样本背景区域的方差;所述μi表示滑动窗口区域内的均值;所述σi表示所述滑动窗口区域内的方差;W表示权值;
对所述激励函数的结果进行阈值分割,确定所述导航图中正样本的位置;
以所述导航图中正样本的位置为中心点对所述导航图进行截取,得到训练集正样本,并且采集所述导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像,得到训练集负样本;
归一化所述训练集正样本和所述训练集负样本,并提取HOG特征;
利用SVM分类器对所述导航图进行检测,得到样本切片位置;
将剔除操作得到的最小外接矩形与所述样本切片位置进行融合,实现对所述序列切片样本的识别标记。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述采集所述导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像,得到训练集负样本,具体包括:
对所述导航图中正样本位置周围不包含切片的区域的图像进行旋转、叠加随机噪声、模糊及伽马变换,得到训练集负样本。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述将所述序列切片样本置于所述显微镜中,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵,将所述导航图中任一像素点导航定位至显微镜视场中心,具体包括:
选取所述导航图中任意不在同一直线上的三个点,并记录所述三个点在所述导航图中的像素坐标位置;
确定所述三个点在成像中心时的显微镜载物台的位置;
基于所述三个点在所述导航图中的所述像素坐标位置和所述三个点在成像中心时的显微镜载物台的所述位置,根据空间坐标仿射变换方法,建立导航图-显微镜实际采样空间坐标的坐标转换矩阵;
利用所述坐标转换矩阵,将所述导航图中任一像素点投影至显微镜视场中的对应位置,从而将所述导航图任一像素点导航定位至所述显微镜视场中心。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述在低分辨率视场下定位所述序列切片样本,进行样本采集参数的装订,具体包括:
设置高分辨率下清晰成像参数,并将低分辨率下清晰成像图像经高斯模糊之后,作为样本模板,并基于低分辨率下清晰成像参数和所述样本模板建立样本数据库;
依次将所述显微镜导航对应于样本点上,并结合所述样本数据库,进行样本采集参数的装订。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述依次将所述显微镜导航对应于样本点上,并结合所述样本数据库,进行样本采集参数的装订,具体包括:
确定多尺度多角度模板匹配中心点位置,并将其存入样本数据库;
将所述显微镜视场中心移动至所述序列切片样本在显微镜坐标系的位置,并快速扫描成像图像,并对所述扫描成像图像使用三分点的牛顿二插法逼近图像质量的局部最优值,得到当前参数附近的清晰成像参数;
基于所述样本数据库,对所述清晰成像参数进行参数装订。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述确定多尺度多角度模板匹配中心点位置具体包括:
计算所述样本模板和待搜索扫描图像的图像金字塔;
设定旋转角度范围、粗略角度及其区间和精细角度及其区间;
将所述待搜索扫描图像旋转所述粗略角度和所述精细角度,并针对所述图像金字塔顶层,对旋转后的图像与所述样本模板进行归一化互相关运算,确定匹配最佳点;
以上一层的匹配最佳点对应的本层的点为中心的一子区域,对所述旋转后的图像与所述样本模板进行归一化互相关运算,将所述图像金字塔最底层的匹配最佳点确定为所述多尺度多角度模板匹配中心点位置。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述得到当前参数附近的清晰成像参数具体包括:
采用离散化高斯卷积核对所述扫描成像图像进行卷积,得到输出图像;
对所述输出图像进行高斯差分运算;
将均值卷积核与高斯差分运算结果进行卷积,得到卷积结果;
对所述卷积结果进行阈值截断,得到截断结果;
基于所述截断结果根据以下公式计算图像质量的评估值:
其中,所述Value表示所述图像质量的评估值;所述Imgth表示所述截断结果;所述Sum(Imgth)表示截断结果像素总和;所述W(Imgth)表示所述截断结果的宽度;所述H(Imgth)表示所述截断结果的高度;
将所述图像质量的评估值作为当前扫描参数下的清晰度相对计算值,并采用局部最优化算法逐步逼近局部最优值,得到当前参数附近的所述清晰成像参数。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述结合所述样本采集参数及所述相对位置关系,进行样本点的图像连续采集,具体包括:
读取样本采集参数;
将所述显微镜视场中心移动到需要进行高分辨率成像的位置,并设置扫描偏转角;
调整成像参数;
通过仿射变换矩阵将多区域采集点反算至显微镜实际坐标系;
将所述显微镜视场中心移动至所述显微镜实际坐标系逐点扫描预设的高分辨率图像,完成样本点多区域的图像采集;
基于各所述样本点多区域的图像采集,输出连续样本图像。
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