CN106546579A

CN106546579A - 一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法

Info

Publication number: CN106546579A
Application number: CN201610968482.9A
Authority: CN
Inventors: 林炜铁; 吴晓壬; 罗剑飞
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法，其作用原理在于有机溶剂二甲基亚砜作为一种极性表面活性剂，能够破坏革兰氏阴性菌发光细菌的磷脂分子层，改变发光细菌细胞膜的通透性，加速毒性物质进入细胞内，从而促进在单位时间内毒性物质对发光细菌细胞作用效果，进而提高发光细菌对待测毒性物质的检测敏感度。本发明显著提高了发光细菌对毒性物质的检出限水平，大大缩短了生物毒性检测方法所需要的时间，为生物检测平台的构建提供了另一个途径。

Description

一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法

技术领域

本发明涉及毒性物质的检测方法，具体涉及一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法。

背景技术

发光细菌由于其独特的生理特性，在正常的生理条件下能发出波长在450~490nm的蓝绿色可见光，在一定的试验条件下发光强度是恒定的。与外来受试物接触后，由于毒物具有抑制发光的作用，发光细菌的发光强度即有所改变，变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。外来受试物主要通过下面两个途径抑制细菌发光：① 直接抑制参与发光反应的酶类活性；②抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定。利用发光细菌来检测有毒物质，由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统，发光强度的变化可以用发光光度计测出，费时较少且灵敏度高，操作简便，结果准确，所以利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质，在国内外越来越受到重视，在环境监测中的应用也越来越广泛。

由于食品中需要检测的种类和组分很多,分子结构复杂,往往难以下手.生物检测法由于能同时对多种毒物产生发光受抑反应,且前处理简单,成本低廉,在定性、半定量的现场快速检测中逐渐显现出了其优势.随着食品工业的发展,采用发光细菌法检测食品安全性作为一种快速的初筛方法。

在实际应用过程中，由于发光细菌针对不同的毒性物质的反应敏感度不同，且当待测物质的浓度过低时，由于细胞膜的阻隔作用，毒性物质进入到细菌体内作用时间过长，无法短时间内呈现出抑制效果。由于发光细菌冻干粉复苏过程中保持自身发光强度不变时间约为1-2小时，要保证在发光细菌正常的生理活动情况下尽可能缩短检测所需要的时间，提高检测效率，扩大生物毒性检测的可适用范围。因此，寻求一种提高发光细菌敏感度的办法，缩短检测所需要的时间，对解决发光细菌快速检测的局限性具有重要意义。

发明内容

针对发光细菌在毒性物质浓度较低的情况下，响应时间比较长的特征，无法达到快速检测毒性物质的要求，本发明利用一种添加二甲基亚砜作为辅助剂，短时间内提高发光细菌的敏感度，达到检测目标要求的技术。二甲基亚砜作用一种低毒的双亲性质子型溶剂，可以轻松的通过细胞膜双层，同时破坏细胞膜的结构，从而增强膜对其他物质的通透性，加入毒性物质进入细胞对发光细菌的荧光蛋白催化酶的催化反应进行抑制，从而达到缩短检测所需要时间的目的，同时二甲基亚砜也是一些难溶物质的助溶剂，可以增加水相中可溶毒性物质的量，达到增强抑制发光细菌发光的效果。本方法提高发光细菌对多种毒性物质（重金属、抗生素、农药等）的敏感度，同时也缩短了检测达到国标技术要求的检出时间，为生物毒性检测的扩大应用范围提供了另一种方法。

本发明提供了一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法，该方法是在发光细菌冻干粉的复苏液和待测样品渗透压缓冲液中添加一定浓度的二甲基亚砜，在复苏与作用的过程中，提高发光细菌细胞膜的通透性，加速毒性物质进入细胞内发生抑制正常的生理活动，缩短检测所需要的时间，从而达到提高敏感度的方法。

本发明的目的具体通过以下技术方案实现。

一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法，包括以下步骤：

（1）在发光细菌冻干粉中加入复苏液复苏；

（2）在渗透压缓冲液中加入二甲基亚砜；

（3）向步骤（2）所得溶液中加入待测样品；

（4）将步骤（1）所得溶液加入到步骤（3）所得溶液中，混合均匀，检测发光细菌的发光值。

优选的，步骤（1）所述发光细菌冻干粉的菌种为青海弧菌Q67，被命名为Vibrio qinghaiensis sp.-Q67，购自北京滨松光子技术股份有限公司，型号为CS235，专利号为ZL97106203.X。青海弧菌Q67自身正常生理可发生氧化反应过程中，在波长为450-490nm之间产生的蓝绿可见光，通过多功能酶标仪或者荧光分光光度计检测得发光强度。

优选的，步骤（1）所述发光细菌冻干粉的制备方法如下：

1）配制溶液；每1L培养基中添加酵母膏5g、胰蛋白胨5g、NaCl 8.5g、甘油3ml、MgCl₂3.2g、CaSO₄0.1g，调节pH=9.0；

2）接入青海弧菌Q67的甘油保种液，置于20℃，120rpm的摇床中过夜；所述青海弧菌Q67的甘油保种液中甘油浓度为25 vol%，青海弧菌OD₆₀₀=1.7-1.8；

3）离心去上清液，得原菌液；再按原菌液与冻干粉保护剂的质量比为1：1制成冻干粉，并在-20℃储存待用；所述冻干粉保护剂由10wt%脱脂乳、6wt%蔗糖和84 wt%水组成。

优选的，，步骤（1）所述复苏液的用量与发光细菌冻干粉的关系为：1ml复苏液中加入50mg冻干粉。

进一步优选的，所述复苏液和渗透压缓冲液的配方均为:每1L去离子水中添加KH₂PO₄ 0.27g、Na₂HPO₄ 1.42g、KCl 0.2g、NaCl 8.5g、MgSO₄ 0.5g，调节pH=7.0。

优选的，步骤（1）所述复苏的时间为15min-30min。

优选的，步骤（2）所述二甲基亚砜（DMSO）在渗透压缓冲液中的浓度为0.05wt%-0.80wt%。

优选的，步骤（3）所述待测样品为重金属、抗生素或农药溶液，用量为1ml。

优选的，步骤（4）所述检测的过程中需要的温度为20-25℃，检测方法用多功能酶标仪或者荧光分光光度计。

优选的，步骤（4）所述混合均匀后10-30min检测发光细菌的发光值。

与现有技术相比，本发明具有如下优点与技术效果：

1、本发明显著提高了发光细菌对毒性物质的检出限水平，大大缩短了生物毒性检测方法所需要的时间。

2、本发明适用于多种不同的检测物质，检测范围广，并且效果稳定。

附图说明

图1为实施例1中不同DMSO添加浓度下重金属汞对发光细菌相对发光值变化曲线图。

图2为实施例2中不同DMSO浓度添加量下对发光细菌相对发光值影响时间变化曲线图。

图3为实施例3中不同重金属在DMSO胁迫下EC₅₀的变化趋势图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步的说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

以下实施例所用发光细菌冻干粉的制备方法如下：

1）配制溶液；在1L培养基中添加酵母膏5g、胰蛋白胨5g、NaCl 8.5g、甘油3ml、MgCl₂3.2g、CaSO₄0.1g，调节pH=9.0；

2）接入含有15vol%青海弧菌Q67的甘油保种液1ml，置于20℃，120rpm的摇床中过夜；所述青海弧菌Q67，被命名为Vibrio qinghaiensis sp.-Q67，购自北京滨松光子技术股份有限公司，型号为CS235；

以下实施例所用复苏液和渗透压缓冲液的配方如下：在1L去离子水中添加KH₂PO₄0.27g、Na₂HPO₄ 1.42g、KCl 0.2g、NaCl 8.5g、MgSO₄ 0.5g，调节pH=7.0。

实施例1

在发光细菌冻干粉50mg中加入复苏液1ml，用移液枪混匀，复苏15待用，配制一系列添加梯度浓度为0 wt%（空白对照）、0.10 wt%、0.20 wt%、0.30wt%、0.40 wt%、0.50 wt%的二甲基亚砜渗透压缓冲液，并且用二甲基亚砜渗透压缓冲液配制一系列浓度梯度的重金属Hg²⁺溶液（浓度分别为0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0,150mg/L），再将复苏好的发光细菌菌液加入到1ml重金属离子溶液中，30min后20℃下测定发光值，结果如图1所示，随着DMSO的添加量增加，发光细菌的相对发光值成逐渐递减，Hg²⁺浓度为0.15mg/L时，空白组的相对发光值还在1.0左右，DMSO添加量分为0.10 wt %、0.20 wt %、0.30 wt %的实验组相对发光值为0.58、0.43、0.24，添加量在0.40 wt %和0.50 wt %的实验组都到达致死水平（相对发光值接近0），可以看出不同DMSO的添加量对发光细菌的敏感程度有不同的提升。

实施例2

在50mg发光细菌冻干粉中加入复苏液1ml，用移液枪混匀，复苏30min待用，配置浓度梯度为0 wt%（空白对照）、0.10 wt%、0.20 wt%、0.30 wt%、0.40 wt%、0.50 wt%的DMSO渗透压缓冲液，并且用DMSO渗透压缓冲液配置浓度0.12mg/L重金属Hg²⁺溶液，将复苏好的发光细菌菌液取100ul分别加入到1ml重金属Hg²⁺溶液中，每隔10min后23℃测定发光值，结果如图2所示，添加了一定量的DMSO的实验组中，10min后发光值对比空白组，DMSO添加量为0.10 wt%、0.20 wt%、0.30wt%、0.40wt%、0.50wt%的实验组发光值分别为0.75、0.58、0.31、0.22、0.17，随着DMSO添加量的提高相对发光值降低明显，促进作用时间小于10min；从图中可以得出，相比低浓度添加量0.10wt%%和0.20 wt%，较高浓度的添加量（超过0.30 wt %）对检测的结果的稳定性有明显的维持作用。

实施例3

在50mg发光细菌冻干粉中加入复苏液1ml，用移液枪混匀，复苏17.5min待用，配置浓度梯度为0 wt%（空白对照）、0.10 wt%、0.20 wt%、0.30 wt%、0.40 wt%、0.50 wt%的DMSO渗透压缓冲液，用DMSO渗透压缓冲液分别配置不同梯度浓度的Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺（四种离子的溶液浓度如表1）四种重金属离子溶液，将复苏好的发光细菌菌液100ul分别加入到1ml重金属离子溶液中，30min后25℃测量其发光值，并且计算EC50(半数致死浓度)。

表1

Hg²⁺（HgCl₂）/mg·L^-1	0.00	0.08	0.1	0.12	0.14	0.16	0.18
								Cd²⁺（CdCl₂）/mg·L^-1	0.00	1.0	3.0	4.0	5.0	7.0	9.0
Cu²⁺（CuSO₄）mg·L^-1	0.00	1.0	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0
								Zn²⁺（ZnCl₂）/mg·L^-1	0.00	0.5	1.0	1.5	2.0	3.0	5.0

结果如图3所示,四种重金属离子在DMSO的作用下，半数致死量EC50呈不同程度的下降趋势，其中Hg²⁺从0.3546mg/L下降到0.0843mg/L，Cu²⁺从9.0052mg/L下降到3.7366mg/L，Cd²⁺从3.2729mg/L下降到1.5422mg/L，Zn²⁺从3.2071mg/L下降到1.8753mg/L，达到相同程度的毒性所需要的剂量都不同程度减少，敏感度分别提高76.22 wt %、58.50 wt %、52.90 wt %、43.28 wt %，说明发光细菌对在DMSO胁迫下的重金属离子敏感程度更高。

Claims

1.一种有机溶剂提高发光细菌检测毒性物质敏感度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在发光细菌冻干粉中加入复苏液复苏；

（2）在渗透压缓冲液中加入二甲基亚砜；

（3）向步骤（2）所得溶液中加入待测样品；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发光细菌冻干粉的菌种为青海弧菌Q67，被命名为Vibrio qinghaiensis sp.-Q67。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发光细菌冻干粉的制备方法如下：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中每50mg发光细菌冻干粉中加入1ml复苏液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复苏液和渗透压缓冲液的配方均为:每1L去离子水中添加KH₂PO₄ 0.27g、Na₂HPO₄ 1.42g、KCl 0.2g、NaCl 8.5g、MgSO₄ 0.5g，调节pH=7.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述复苏的时间为15-30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述二甲基亚砜在渗透压缓冲液中的浓度为0.05wt%-0.80wt%。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述待测样品为重金属、抗生素或农药，所配置的待检测样品溶液用量为1ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述检测的过程中需要的温度为20-25℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述混合均匀后10-30min检测发光细菌的发光值。