CN106535937A - 用于治疗血管畸形的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
一种用于治疗和/或预防由血管畸形表征的病变的Wnt/β‑联蛋白信号转导的抑制剂。该抑制剂可以是小分子、蛋白质、肽或反义核酸。本发明还涉及药物组合物和治疗方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于治疗特征为血管畸形,具体特征为内皮-间充质转化,尤其是脑海绵状畸形的病变的Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂。该抑制剂可以是小分子、蛋白质、肽或反义核酸。本发明还涉及药物组合物和治疗方法。
发明背景
作为称为脑海绵状畸形(CCM)的疾病的特征的血管畸形主要集中在中枢神经系统,并且它们一般显示出多内腔和血管泄漏(Clatterbuck,2001#17;Wong,2000#18)。病理性血管的这种器官定位可能导致多种神经症状,包括出血性中风3。在人类中,称为CCM1、CCM2和CCM3的三种独立基因中任一种的突变已经与CCM的家族变体关联5。在鼠模型中,在新生儿中任意CCM基因的内皮特异性功能丧失突变6,7可重现脑血管表型。另外,对CCM3的组成型内皮选择性灭活是胚胎致死性的,由于血管发育的一般性问题8。虽然,CCM3的神经特异性突变在少数情况中可能诱导脑血管表型9,这些数据强烈地表明内皮细胞中CCM基因的突变导致CCM病理性表型。然而,这些基因在内皮细胞中的作用基质很大程度上仍然是未知的。迄今为止,CCM疾病的唯一疗法是手术4。
已经报道了在培养的主动脉内皮细胞中敲减CCM1蛋白质促进Wnt/b-联蛋白信号转导10。然而,迄今为止,还没有显示b-联蛋白途径在体内血管病灶形成中的相关性。一些研究已经显示在胚胎发育期间脑血管发生和血脑屏障微血管的正确分化需要规范Wnt/b-联蛋白信号转导的活化11-13。需要在成人中紧密调节这些效果以避免不受控制的血管增殖。事实上,在生理条件中,b-联蛋白信号转导在产后剧烈降低,并且在成人中是基本上不可检测的13。
WO2009148709公开了用于在血管中降低血管透过性并且治疗或预防与血管内皮的缺陷或损伤相关的病症的组合物和方法。例如,可使用本发明的组合物和方法来治疗血管发育异常,如脑海绵状畸形(CCM)。这些方法一般与抑制RhoA GTP酶水平或活性的组合物,如3-羟基-3甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂的使用相关。该应用提供,例如,RhoA GTP酶抑制剂、他汀分子如辛伐他汀、或含氮二膦酸酯如帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿伦膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐。
在WO2012135650中,缺少环加氧酶抑制活性的舒林酸衍生物与含有衍生物的药物组合物一起提供并用于治疗或预防癌症。舒林酸衍生物也适于治疗慢性炎性病症。还提供了用于制备衍生物的方法。还要求其在阿尔茨海默病中的用途。
Kundu JK等[“β-联蛋白-介导的信号转导:用抗炎物质进行化学预防的新分子靶标(Beta-catenin-mediated signaling:a novel molecular target forchemoprevention with anti-inflammatory substances)”Biochimica et BiophysicaActa 1765(2006):14-24]聚焦于β-联蛋白-介导的信号转导途径,尤其是涉及其对癌发生的贡献,以及由非甾族抗炎药物和具有抗炎性质的化学预防光化学物对不当实现的β-联蛋白-介导的信号转导的调节。在表1和2中,Kundu等列出了所有能够调节β-联蛋白-介导的信号转导途径的物质,其是非甾族抗炎药物(NSAID)和抗炎光化学物。以下描述了其他β-联蛋白抑制剂及其作用机制:Anastas和Moon,2013,Nature Rev-Cancer,13,11-26;Rosenbluh等,2014,Trends Pharmac.Sci 35,103-109;Takahashi-Yanaga和Kahn,2010,Clin CancerRes 16.3153-3162。
在McDonald DA等(“法舒地尔减少脑海绵状畸形的鼠模型中的病灶负荷(Fasudildecreases lesion burden in murine model of cerebral cavernous malformation)”,Stroke 43,571-574.2012)中,用Rho激酶抑制剂法舒地尔(Fasudil)来治疗CCM1疾病模型。
然而,仍然需要针对CCM的药物治疗,因为目前该疾病仅可通过手术治疗。
发明内容
在本发明中,发明人已经发现在内皮细胞中β-联蛋白(b-联蛋白或β-联蛋白)的转录活性改变导致体内CCM的病变表型。在此,报告了CCM3事实上在体外和体内均为一种内皮细胞b-联蛋白转录活性的调节剂。
此外,发明人已惊讶地发现能够降低b-联蛋白-介导的转录活性的试剂能够降低脑或视网膜血管畸形的数量和程度并且防止出现新的血管病灶。
在本发明中,令人惊讶地发现能够降低β-联蛋白-介导的活性的化合物,如NSAID舒林酸硫化物和舒林砜,显著降低在内皮-细胞-特异性CCM3敲除基因的小鼠的中枢神经系统中血管病灶的数量和尺寸,该小鼠是脑海绵状畸形(CCM)模型。CCM是一种影响中枢神经系统血管的疾病,其逐渐畸形,漏损并且易于出血。器官位置对于神经学影响和治疗性介入而言都是关键的,其迄今为止只有手术。因此,能够降低β-联蛋白-介导的活性的化合物代表了用于抑制血管病灶形成的药物工具,尤其是对于受到CCM的家族变体影响的患者,他们随时间持续发生新畸变。
本发明所示的结果可应用于以血管畸变为特征的任何病理学。这种病理学显示了内皮细胞中细胞与细胞连接的拆散以及EndMT(内皮-间充质转化)、标志物(如Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-钙粘蛋白、Zeb2,Fadini等,2012;Margariti等,2012;Li等,2012;Liang等,2011;Stein等,2006;Medici等,2012)的表达。
本发明还基于以下惊人惊讶的发现,使用例如NSAID、舒林砜(依昔舒林)对Wnt/β-联蛋白途径,尤其是β-联蛋白信号转导的抑制,抑制了EndMT标志物的表达。这种标志物存在于以血管畸形,如CCM为特征的病变中。
在第一方面中,本发明提供了用于治疗和/或预防以血管畸形为特征的病变的Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制剂。
优选地,该抑制剂是β-联蛋白抑制剂,尤其是β-联蛋白转录信号转导的抑制剂和/或β-联蛋白核易位的抑制剂。
该抑制剂更优选是小分子抑制剂。在一个优选实施方式中,该抑制剂选自下组:槲皮素、ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、N′-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、N′-[(E)-1-(5-甲基-2-噻吩基)亚乙基]-2-苯氧基乙酰肼、5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-2-(2-噻吩基)-1H-吲哚、2-(2-呋喃基)-5-[(E)-2-(5-甲基-2-呋喃基)乙烯基]-1H-吲哚、N-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]-4-(4-吡啶基)-8-喹啉-胺、2-(2-呋喃基)-5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-1H-吲哚、7-{(2E)-2-[(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]肼基}-N-(2-苯基乙基)-5,6-二氢苯并[h]异喹啉-9-羧酰胺、1-{[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]氨基}-3-(4-吡啶基)-2,4-(1H,3H)-喹唑啉二酮、N-(5-甲基-2-呋喃基)-N-(2′-苯氧基[1,1′-二苯基]-3-基)胺、4-{[7-(5-甲基-2-呋喃基)-2-萘基]氧基}吡啶、N-(5-溴-1,3,4-噁二唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、4-羟基-N-(5-甲基-2-呋喃基)-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、3-[(E)-2-(5-溴-1,3,4-噻二唑-2-基)乙烯基]-4-羟基-6-苯基-2H-吡喃-2-酮、N-(5-溴-1,3,4噻二唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、5-[(3-氨基-1H-1,2,4-三唑-5-基)甲基]-3-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-1,3-噁唑烷-2-酮、4-[(3-氨基-1H-1,2,4-三唑-5-基)甲基]-1-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-2-咪唑烷酮、1-二苯甲基-4-(5-溴-2-糠酰)哌嗪、1-二苯甲基-4-[(5-甲基-2-噻吩基)羰基]哌嗪、(2E)-2-[1-(4-甲基-2-噻吩基)亚乙基]肼羧酸苄酯、2-(4-氯苯基)-6-甲基-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)[1,3]噻唑并[3,2-b][1,2,4]三唑、N-(5-甲基-3-异噁唑基)-N′-[(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)羰基]脲、N-[3-(2-{[(5-氯-2-噻吩基)甲基]磺酰基}肼基)-3-氧代丙基]苯磺酰胺-5-[3-(4-苯氧基苯基)丙基]-1,3,4-噁二唑-2-醇、N-(3-甲基-5-异噁唑基)-4-苯氧基苯甲酰胺、4-羟基-N-(3-甲基-5-异噁唑基)-2-氧代-6-苯氧基-2H-吡喃-3-羧酰胺、2-苯氧基-N′-[(Z)-苯基(2-噻吩基)亚甲基]苯甲酰肼、2-苯胺基-N′-[(Z)-2-呋喃基(苯基)亚甲基]苯甲酰肼、4-[(Z)-1-(3-甲基-5-异噁唑基)-2-苯基乙烯基]苯基2-(1-吡咯烷基)乙基醚、5-甲基-2-糠醛[(3Z)-2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]腙、(2Z)-N-[(5-甲基-2-呋喃基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]乙酰胺、(2Z)-N-[(3-甲基-5-异噁唑基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]乙酰胺、(2-氯-1,3-噻唑-5-基)甲基4-(4-吗啉基磺酰基)苯基醚、N-(4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-(4-苯氧基丁基)甲磺酰胺、N-(6-甲氧基-4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-[2-(1-甲基-3-苯基丙氧基)乙基]乙酰胺、4-{2-[(5-甲基-2-呋喃基)甲氧基]亚苄基}-1-(4-吡啶基磺酰基)哌啶、4-{2-[(5-溴-2-呋喃基)甲氧基]亚苄基}-1-异烟碱基哌啶、N-(4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-(4-苯基戊基)乙酰胺、N-(4,5-二氢-3H-萘并[1,2-d]咪唑-2-基)-N-[2-(2-苯基乙氧基)乙基]甲磺酰胺、N′-[(Z)-(5-甲基-2-呋喃基)(2-吡啶基)亚甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、舒林酸硫化物、舒林砜及其药学上可接受的盐,羟基罗汉松树脂、六氯酚、PPARγ激动剂、或PPARγ-无活性类似物、水飞蓟宾、奶蓟草提取物(cardio mariano)、EGCG(表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)、白茶/绿茶、萝卜硫素、白藜芦醇、姜黄素、吲哚-3-甲醇、乌索酸、二十二碳六烯酸、染料木黄酮、β-拉帕醌和表I所列化合物[http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/]。
已经报告表I所列化合物通过靶向途径的各种组分来抑制Wnt信号转导,导致其抑制。参见Dodge,Annu Rev Pharmacol Toxicol.2011;51:289-310,Chen,Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol.2010年8月;299(2):G293-300,Barker Nat Rev DrugDiscov.2006年12月;5(12):997-1014,综述。这些抑制剂全部构成本发明的一部分。
表I:Wnt/b-联蛋白信号转导抑制剂
抑制剂优选是舒林酸或舒林酸硫化物或舒林砜或其类似物或衍生物。
舒林砜也称为依昔舒林、fgn1或
抑制剂可以是PDE5(磷酸二酯酶5)的抑制剂或PKG(蛋白激酶G或环状GMP-依赖性蛋白激酶)的激活剂。PDE5和PKG分别是舒林酸硫化物和依昔舒林的直接和间接靶标(通过调节环状GMP水平)并且调节β-联蛋白的磷酸化并抑制β-联蛋白-驱动的信号转导途径(Tinsley等,2011;Thompson等,2000;Li等,2001)。
更优选的,抑制剂选自下组:水飞蓟宾、EGCG(表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)、白茶/绿茶、萝卜硫素、白藜芦醇、姜黄素、吲哚-3-甲醇、乌索酸、二十二碳六烯酸、染料木黄酮和β-拉帕醌。
在一个优选的实施方式中,Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂是蛋白质或肽。
优选地,直接给予蛋白质或肽,或通过给予的表达系统表达。
蛋白质或肽优选是Chibby、轴蛋白、HDPR1、ICAT、或包含LXXLL肽(SEQ ID NO:19)的融合蛋白、DKK1、针对卷曲蛋白的抗体如OMP-18R5。
DKK1(Dickkopf,Dkk)是Wnt信号转导的负调节剂(Glinka,1998;Niehrs,1999)。分泌Dkk蛋白并富含半胱氨酸。Dkk并不结合Wnt但与Wnt共受体LRP相互作用。可在治疗上并在实验室中使用针对卷曲蛋白的抗体如OMP-18R5。其与多种卷曲蛋白受体相互作用(Gurney等,Proc Natl Acad Sci USA.2012年7月17日;109(29):11717-22)。
更优选地,Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂是反义核酸分子。更优选全长反义β-联蛋白构建体、β-联蛋白siRNA,或β-联蛋白shRNA。
在一个优选的实施方式中,由适于给予对象的重组表达系统来表达抑制剂。
在一个优选的实施方式中,重组表达系统包含内皮或大脑内皮特异性启动子元件,并且任选地包含诱导物/抑制物元件。
在一个优选的实施方式中,抑制物包封在纳米颗粒中,优选该纳米颗粒经工程改造以靶向病理性内皮细胞。
在另一个优选的实施方式中,血管畸形的特征在于内皮-间充质转化或与内皮-间充质转化相关的血管畸形(Medici等,2012;Fadini等,2012)。在本发明的血管畸形中,存在内皮-间充质转化。
优选地,血管畸形在中枢神经系统和/或视网膜血管系统内。
更优选,该病变选自:骨化进行性纤维发育不良(Medici D等,Nature Medicine16:1400,2010)、心脏纤维化、肾纤维化、肺纤维化(Medici D和Kalluri R Semin CancerBiol 22:379,2012)和脑海绵状畸形。
病变更优选是脑海绵状畸形。
在一个优选的实施方式中,脑海绵状畸形是由选自以下的基因中的至少一个中的功能丧失突变所导致:CCM1(KRITl)、CCM2(OSM)或CCM3(PDCD10)。
脑海绵状畸形更优选是偶发性的或家族性的。
本发明的另一个目的是用于治疗和/或预防特征为血管畸形的病变的包含有效量的至少一种上述定义的抑制剂和药学上可接受的载剂的药物组合物。
该药物组合物优选还包含有效量的至少另一种治疗剂。
在一个优选的实施方式中,其他治疗剂选自下组:抗氧化剂、TGF-β信号转导途径抑制剂、BMP信号转导途径抑制剂、VEGF信号转导途径抑制剂、Yap信号转导途径抑制剂、他汀(参见例如Hwang等,2013,Int J.Oncol 43,261-270)以及RhoA GTP酶水平和/或活性的抑制剂。
在一个优选的实施方式中,药学上可接受的载剂是纳米颗粒,优选该纳米颗粒经工程改造以靶向病理性内皮细胞。
本发明的另一个目的是治疗和/或预防以血管畸形为特征病变的方法,包括给予有此需要的对象有效量的wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂。
可通过不同途径,包括口服来给予这些化合物,并且可以安全并在CCM(偶发性或家族性的脑海绵状畸形)患者中减少血管畸形并防止新血管病灶出现上有效的剂量给予。
在本发明中,Wnt/β-联蛋白信号转导是化学工具,其作用的最后结果是抑制由β-联蛋白驱动的转录应答。这些抑制剂的靶标可以是Wnt/β-联蛋白信号转导途径的任何步骤和分子组分。
具体地,Wnt/β-联蛋白信号转导的抑制剂是β-联蛋白抑制剂。β-联蛋白抑制剂是β-联蛋白活性和/或信号转导的抑制剂。该抑制剂可直接或间接通过a)对β-联蛋白的作用,b)促进β-联蛋白降解,c)干扰β-联蛋白的表达,d)与其他试剂竞争结合β-联蛋白来抑制β-联蛋白活性。该抑制剂可以是β-联蛋白介导的转录和/或β-联蛋白活性的其他水平的抑制剂。该抑制剂是β-联蛋白转录信号转导的抑制剂。该抑制剂也可抑制或防止活性β-联蛋白的核积聚。
在本发明中,存在特异性抑制细胞培养物和/或对象的Wnt信号转导的多种方式。a)使用靶向途径的各种组分的RNAi,如LRP/Arrow、蓬乱蛋白(Dishevelled),这已经显示在果蝇S2细胞中(Matsubayashi 2004,Cong等,2004)和哺乳动物细胞(Lu等,2004)都有非常好的效果。b)存在已经显示出不同程度抑制Wnt信号转导的多种小分子。参见表I及其靶标。在这些中,IWP已经显示出在通过抑制porcupine来阻断Wnt分泌中有效(Chen等,2009)。c)(分泌的)Wnt信号可被过量的结合其受体结构域的配体卷曲蛋白(Frizzled)阻断。该结构域最佳呈现为其在FRP/Frz形式中的天然融合。或者,其可使用GPI锚在靶细胞表面上表达,这效果良好(Cadigan,1998)。d)另一种抑制Wnt的方式是添加过量的Dickkopf(Dkk)蛋白质(Glinka,1998)。这在细胞培养和体内效果良好。Dkk结合至Wnt的LRP共受体。e)为了封闭细胞内的信号转导,多个工作人员已经使用显性阴性蓬乱蛋白(Wallingford,2000)。f)过表达完整轴蛋白,一种Wnt途径的负调节剂,效果良好(Zeng,1997,Itoh 1998;Willert,1999)。g)过表达全长GSK也可有效阻断Wnt信号转导(He,1995)。h)存在可用于阻断核中Wnt信号转导的TCF的多种显性阴性形式(Molenaar,1996)。i)可在治疗上并在实验室中使用针对卷曲蛋白的抗体OMP-18R5。其与多种卷曲蛋白受体相互作用(Gurney等,2012)。
在本发明中,以血管畸形为特征的病变呈现任意类型的血管并且分布于局部异常组织,其中内皮细胞显示紊乱的细胞与细胞连接和/或内皮-间充质转化(EndMT)标志物(如Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-钙粘蛋白、Zeb2,Fadini等,2012;Margariti等,2012;Li等,2012;Liang等,2011;Stein等,2006;Medici等,2012)的表达和/或屏障功能损伤。壁细胞,如周细胞的结合也可能收到损伤。在脑海马状畸形(CCM)病变中发现这种畸形的示例。
在本发明中,特征为EndMT的血管畸形是血管的局部失常,其中内皮细胞已经丧失内皮分化。结果,内皮层的功能收到损伤并且受到这种异常影响的血管区域在结构上异常、高度渗透性、发炎并且易于出血。
根据本发明的方面,特征为血管畸形的病变的治疗和/或预防可有效减轻血管畸形的至少一种症状,尤其是特征为EndMT的血管畸形,尤其是CCM。
当治疗特征为血管畸形的病变的背后原因时,认为可类似地实现对症状的控制。通过对症状的控制,应该能够维持症状的严重性(即,控制症状的恶化或进展),或者更优选地,可整体或部分降低症状的严重性。
症状包括扩张血管的异常簇、癫痫发作、中风症状、出血和头痛、病灶。症状一般取决于畸形的位置并且可包括:癫痫发作的严重性、持续时间和强度,神经缺陷如手臂和大腿虚弱无力以及与视觉、平衡、记忆和注意力相关的问题,头痛的严重性、持续时间和强度,大脑中称为出血(hemorrhage)的流血,其可破坏周围的脑组织。
可使用β-联蛋白的一种或多种不同抑制剂中的任意一种,及其组合。这些可包括,但不限于,小分子抑制剂、蛋白质和肽抑制剂、以及反义(RNAi)抑制剂。
示例性的小分子抑制剂包括但不限于,NSAID如吲哚美辛、舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、阿司匹林、罗非考昔、双氯芬酸、塞来昔布、美洛昔康、依托度酸、萘丁美酮。
示例性的小分子抑制剂包括槲皮素(Park等,″槲皮素,针对SW480结肠癌细胞中β-联蛋白/Tcf的强效抑制剂(Quercetin,a potent inhibitor against beta-catenin/Tcfsignaling in SW480colon cancer cells)″,Biochem Biophys Res Commun.328(1):227-34(2005),其通过引用全文纳入本文);化合物如ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、和以下中公开的其他化合物:Trosset et al.,″抑制蛋白质-蛋白质相互作用:通过病毒和生物物理筛选发现药物状β-联蛋白抑制剂(Inhibition of protein-protein interactions:The discoveryof druglike beta-catenin inhibitors by combining virtual and biophysicalscreening)″,In Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics 64(1):60-67(2006)和Barker等,″挖掘用于癌症治疗的Wnt途径(Mining the Wnt Pathway for CancerTherapeutics)″,Nature Reviews Drug Discovery 5:997-1014(2006),其各自通过引用全文纳入本文;LC-363(马里兰州日耳曼敦的阿瓦隆制药公司(Avalon Pharmaceuticals,Germantown,Md.));化合物如N′-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、N′-[(E)-1-(5-甲基-2-噻吩基)亚乙基]-2-苯氧基乙酰肼、5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-2-(2-噻吩基)-1H-吲哚、2-(2-呋喃基)-5-[(E)-2-(5-甲基-2-呋喃基)乙烯基]-1H-吲哚、N-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]-4-(4-吡啶基)-8-喹啉-胺、2-(2-呋喃基)-5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-1H-吲哚、7-{(2E)-2-[(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]肼基}-N-(2-苯基乙基)-5,6-二氢苯并[h]异喹啉-9-羧酰胺、1-{[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]氨基}-3-(4-吡啶基)-2,4-(1H,3H)-喹唑啉二酮、N-(5-甲基-2-呋喃基)-N-(2′-苯氧基[1,1′-二苯基]-3-基)胺、4-{[7-(5-甲基-2-呋喃基)-2-萘基]氧基}吡啶、N-(5-溴-1,3,4-噁二唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、4-羟基-N-(5-甲基-2-呋喃基)-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、3-[(E)-2-(5-溴-1,3,4-噻二唑-2-基)乙烯基]-4-羟基-6-苯基-2H-吡喃-2-酮、N-(5-溴-1,3,4噻二唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、5-[(3-氨基-1H-1,2,4-三唑-5-基)甲基]-3-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-1,3-噁唑烷-2-酮、4-[(3-氨基-1H-1,2,4-三唑-5-基)甲基]-1-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-2-咪唑烷酮、1-二苯甲基-4-(5-溴-2-糠酰)哌嗪、1-二苯甲基-4-[(5-甲基-2-噻吩基)羰基]哌嗪、(2E)-2-[1-(4-甲基-2-噻吩基)亚乙基]肼羧酸苄酯、2-(4-氯苯基)-6-甲基-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)[1,3]噻唑并[3,2-b][1,2,4]三唑、N-(5-甲基-3-异噁唑基)-N′-[(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)羰基]脲、N-[3-(2-{[(5-氯-2-噻吩基)甲基]磺酰基}肼基)-3-氧代丙基]苯磺酰胺-5-[3-(4-苯氧基苯基)丙基]-1,3,4-噁二唑-2-醇、N-(3-甲基-5-异噁唑基)-4-苯氧基苯甲酰胺、4-羟基-N-(3-甲基-5-异噁唑基)-2-氧代-6-苯氧基-2H-吡喃-3-羧酰胺、2-苯氧基-N′-[(Z)-苯基(2-噻吩基)亚甲基]苯甲酰肼、2-苯胺基-N′-[(Z)-2-呋喃基(苯基)亚甲基]苯甲酰肼、4-[(Z)-1-(3-甲基-5-异噁唑基)-2-苯基乙烯基]苯基2-(1-吡咯烷基)乙基醚、5-甲基-2-糠醛[(3Z)-2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]腙、(2Z)-N-[(5-甲基-2-呋喃基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]乙酰胺、(2Z)-N-[(3-甲基-5-异噁唑基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]乙酰胺、(2-氯-1,3-噻唑-5-基)甲基4-(4-吗啉基磺酰基)苯基醚、N-(4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-(4-苯氧基丁基)甲磺酰胺、N-(6-甲氧基-4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-[2-(1-甲基-3-苯基丙氧基)乙基]乙酰胺、4-{2-[(5-甲基-2-呋喃基)甲氧基]亚苄基}-1-(4-吡啶基磺酰基)哌啶、4-{2-[(5-溴-2-呋喃基)甲氧基]亚苄基}-1-异烟碱基哌啶、N-(4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-(4-苯基戊基)乙酰胺、N-(4,5-二氢-3H-萘并[1,2-d]咪唑-2-基)-N-[2-(2-苯基乙氧基)乙基]甲磺酰胺、N′-[(Z)-(5-甲基-2-呋喃基)(2-吡啶基)亚甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼,及其在Moll等的美国专利申请公开号20040204477中公开的药学上可接受的盐,其通过引用全文纳入本文;羟基罗汉松树脂(Mutanen的美国专利号6,271,257,其通过引用全文纳入本文);六氯酚(Park等,″六氯酚通过促进Siah-介导的β-联蛋白降解来抑制Wnt/β-联蛋白途径(Hexachlorophene Inhibits Wnt/[beta]-Catenin Pathway byPromoting Siah-Mediated[beta]-Catenin Degradation)″,Molecular PharmacologyFast Forward(2006年5月30日),其通过引用全文纳入本文);和PPAR[γ]激动剂(例如,曲格列酮)和PPAR[γ]-无活性类似物(例如,[Δ]2TG和STG28)(Wei等,″噻唑烷二酮类通过靶向Skpl-Cull-F-盒蛋白质E3泛素连接酶的F-盒蛋白质独立于过氧化物酶增殖物活化的受体[γ]调节β-联蛋白和其他细胞周期调节蛋白质的表达(Thiazolidinediones Modulatethe Expression of[beta]-Catenin and Other Cell-Cycle Regulatory Proteins byTargeting the F-Box Proteins of Skp1-Cull-F-box Protein E3Ubiquitin LigaseIndependently of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor[gamma])″,Molecular Pharmacology Fast Forward(2007年6月14日),其通过引用全文纳入本文)。
示例性的小分子抑制剂包括光化学物水飞蓟宾、奶蓟草提取物(cardiomariano)、EGCG(表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)、白茶/绿茶、萝卜硫素、白藜芦醇、姜黄素、吲哚-3-甲醇、乌索酸、二十二碳六烯酸、染料木黄酮、β-拉帕醌。
示例性的蛋白质和肽抑制剂包括,但不限于,chibby过表达(Schuierer等,″在结肠癌细胞系中β-联蛋白抑制剂Chibby的降低表达(Reduced expression of beta-catenininhibitor Chibby in colon carcinoma cell lines)″,World J Gastroenterol 12(10):1529-1535(2006),其通过引用全文纳入本文);轴蛋白过表达(Nakamura等,″轴蛋白,Wnt信号转导途径的抑制剂,与β-联蛋白、GSK-3β和APC相互作用并且降低β-联蛋白水平(Axin,an inhibitor of the Wnt signalling pathway,interacts with beta-catenin,GSK-3beta and APC and reduces the beta-catenin level)″,Genes Cells 3:395-403(1998),其通过引用全文纳入本文);HDPR1过表达(Yao等,″HDPR1,一种WNT/β-联蛋白信号转导的新抑制剂,通常在肝细胞癌中下调:涉及甲基化介导的基因沉默(HDPR1,a novelinhibitor of the WNT/beta-catenin signaling,is frequently downregulated inhepatocellular carcinoma:involvement of methylation-mediated genesilencing)″,Oncogene24:1607-1614(2005),其通过引用全文纳入本文);ICAT过表达(Tago等,″通过ICTA,一种新β-联蛋白相互作用蛋白质来抑制Wnt信号转导(Inhibition ofWnt signaling by ICAT,a novel beta-catenin-interacting protein)″,GenesDev.14:1741-1749(2000);Genbank登录号BAB03458,其各自通过引用全文纳入本文);和LXXLL(SEQ ID NO:19)Blaschuk等的美国专利号6,677,116中公开的肽类型,其通过引用全文纳入本文。这些蛋白质或多肽抑制剂可直接给予或通过基因治疗方法体内表达,如下所述。
示例性的反义β-联蛋白构建体包括以下中报告的那些:Green等,″β-联蛋白反义治疗降低结肠癌异种移植物的β-联蛋白表达和肿瘤生长速率(Beta-catenin AntisenseTreatment Decreases Beta-catenin Expression and Tumor Growth Rate in ColonCarcinoma Xenografts)″,J Surg.Res.101(1):16-20(2001);Veeramachaneni,″β-联蛋白下调抑制食道癌细胞生长(Down-regulation of Beta Catenin Inhibits the Growth ofEsophageal Carcinoma Cells)″,J.Thoracic Cardiovasc.Surg.127(1):92-98(2004);Bennett等的美国专利号6,066,500,其各自通过引用全文纳入本文。
示例性的siRNA构建体描述于Verma等,″针对β-联蛋白的小干扰RNA抑制体外和体内结肠癌细胞生长(Small Interfering RNAs Directed Against Beta-catenin Inhibitthe in vitro and in vivo Growth of Colon Cancer Cells)″,Clin.Cancer Res.9(4):1291-300(2003),其通过引用全文纳入本文;并且其他针对β-联蛋白的siRNA可购自圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc)。
示例性的shRNA构建体描述于Gadue等,″诱导使用胚胎干细胞的原始条痕板形成体外模型需要Wnt和TGF-β信号转导(Wnt and TGF-[beta]Signaling are Required forthe Induction of an in vitro Model of Primitive Streak Formation usingEmbryonic Stem Cells)″,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(45):16806-16811,其通过引用全文纳入本文;并且其他针对β-联蛋白的shRNA可购自超级阵列生物科学公司(Super ArrayBioscience Corporation)、OG技术公司(OriGene)、和奥本生物系统公司(OpenBiosystems)。
RNAi试剂可直接给予或通过基因治疗方法给予。因此,也可给予编码这些RNAi试剂的DNA分子(表达载体)。
对于基因治疗方法,多肽或RNA分子的治疗剂可以表达治疗剂的DNA分子的形式给予患者。在体内,在给予DNA分子之后,治疗剂经表达并且对患者发挥其作用用于治疗和/或预防以血管畸形为特征的病变。
用于本发明的方法的核酸试剂(包括RNA和DNA)可以多种本领域已知的方式递送至对象,包括通过使用基因治疗载体和上述方法。可用于基因治疗的载体,例如,可转染到对象细胞中的载体内可含有核酸并在其中提供治疗性核酸试剂的表达。这类载体包括染色体载体(例如,人工染色体)、非染色体载体,和合成核酸。载体也包括质粒、病毒和噬菌体,如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关载体。
可使用离体或体内方法将核酸试剂转入对象。离体方法包括将核酸体外转入细胞(例如,通过转染、感染或注射),该细胞然后转入或给予对象。该细胞可以是,例如,衍生自对象的细胞(例如,淋巴细胞)或同种异体细胞。例如,可将细胞直接植入对象的特定组织中或在包封在人工聚合物基质内之后植入。核酸也可被体外递送到对象中。例如,可在有效运载体,例如,能够在体内有效递送核酸至细胞的任意制剂或组合物中给予核酸。病毒载体内含有的核酸可通过使用病毒转导或感染在体内递送至细胞。也可通过物理手段,例如,通过电穿孔、脂质、阳离子脂质、脂质体、DNA枪、磷酸钙沉淀、注射、或递送裸核酸将核酸和载体递送至细胞。
作为上述核酸非感染递送的替代,裸DNA或感染性转化载体可用于递送,从而裸DNA或感染性转化载体含有编码例如,β-联蛋白的多肽或核酸抑制剂的重组基因。然后在转化的细胞中表达核酸分子。
重组基因包括,可操作地互相偶联的,在哺乳动物细胞中可操作的上游启动子和任选的其他合适的调节元件(即,增强子或诱导元件),编码治疗性核酸(上述)或多肽的编码序列,和下游转录终止区。任意合适的组成型启动子或诱导性启动子可用于调节重组基因的转录,并且本领域技术人员易于选择和利用这类启动子,无论是现在已知的或以后开发的。启动子也可对于血管内皮中的表达有特异性,如Tie-2启动子或VE-钙粘蛋白启动子(Corada M等,Nature Comm 4:2609,2013);也可使用其他脑内皮特异性启动子,如Slco1c1(D.A.Ridder等,J Exp Med 208(13):2615,2011)。
组织特异性启动子也可使用例如TetO应答元件变成诱导性/抑制性。也可使用其他诱导性元件。可采用已知的重组技术来制备重组基因,将其转入表达载体中(如果使用),并将该载体或裸DNA给予患者。示例性的过程描述于Sambrook等,1-3《分子克隆:实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)(第2版,1989),其通过引用全文纳入本文。本领域技术人员易于根据需要使用本文所述的过程的已知变体修改这些过程。
可使用任意合适的病毒或感染性转化。示例性的病毒载体包括,但不限于,腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒(包括慢病毒)。
优选治疗剂以包含药学上可接受的运载体和一种或多种活性试剂的药物组合物的形式给予患者,该活性试剂通过作用于β-联蛋白、通过促进β-联蛋白降解、与其他试剂间接竞争结合β-联蛋白、或通过干扰β-联蛋白表达直接抑制β-联蛋白活性。
本发明的药物组合物优选是单一单位剂型的形式,其含有一定量的有效治疗和/或预防以本文所述类型的血管畸形为特征的病变的治疗剂。该药物组合物也可包含合适的赋形剂,或稳定剂,并且可以是固体或液体形式,如片剂、囊剂、粉末、溶液、悬液或乳液。一般而言,该组合物将含有约0.01至99%,约5至95%的活性化合物和运载体。当与合适的运载体和任意赋形剂或稳定剂组合时,单独或以组合物形式给予的治疗剂可通过以下给予:口服、胃肠外、皮下、透皮、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内滴注、植入、腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、损伤内、施用于粘膜例如鼻腔、咽喉和支气管的粘膜(即,吸入)、或大脑内给予。
对于大多数治疗性目的,可以固体或液体形式的溶液或悬液口服,通过液体形式的溶液或悬液注射,或通过雾化溶液或悬液的吸入给予。
含有治疗剂的固体单位剂型可以是常规类型。固体形式可以是囊剂,如含有治疗剂和运载体的普通明胶类型,例如,润滑剂和惰性填料,如乳糖、蔗糖或玉米淀粉。在另一实施方式中,用常规片剂基料如乳糖、蔗糖或玉米淀粉,粘合剂如阿拉伯胶或明胶,崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸以及润滑剂如硬脂酸或硬脂酸镁,将治疗剂制成片剂。
对于注射剂量,可在作为运载体的生理上或药学上可接受的稀释剂中制备治疗剂的溶液或悬液。这类运载体包括无菌液体,如水和油,添加或不添加表面活性剂和其他药学上和上例上可接受的组分,包括佐剂、赋形剂或稳定剂。油的例子是石油、动物、植物或合成来源的油,例如花生油、大豆油或矿物油。通常,水、盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体运载体,尤其对于注射溶液。
用作气雾剂时,可将溶液或混悬液形式的治疗剂与合适的推进剂,例如烃推进剂如丙烷、丁烷或异丁烷以及常规辅料一起包装到加压的气雾剂容器中。治疗剂也可以非加压形式,例如用喷雾器或雾化器给药。
除了旨在立即将治疗剂递送至患者的上述制剂以外,也可考虑缓释制剂。优选地,缓释制剂是包括其中捕获治疗剂的基质的可植入装置。可通过选择加载到载剂中的药物的量和材料来控制试剂的释放。本领域已知多种合适的可植入递送系统,如Ishikawa等的美国专利号6,464,687,Guillen的美国专利号6,074,673,其各自通过引用全文纳入本文。
可使用任意合适的生物相容基质配制可植入缓释药物递送系统,该基质中可加载试剂用于缓释递送。这些包括但不限于微球、水凝胶、聚合储器、胆固醇基质、聚合系统和非聚合系统等。示例性的聚合基质包括,但不限于,聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、聚乙交酯、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、聚酐、聚原酸酯、聚己内酯、聚磷(polyphospagene)、蛋白性聚合物、聚醚、硅酮、及其组合。
或者,对于DNA基治疗剂,递送治疗剂的合适载剂包括溶解的胆固醇作为添加剂用于与阳离子脂质、阳离子聚合物或枝状聚合物络合的DNA。优选地,使用环糊精,优选甲基-[β]-环糊精使胆固醇溶解。Esuvaranathan等的美国专利公开号20020146830中描述了这种类型的制剂,其通过引用全文纳入本文。
也考虑Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂与一种或多种其他治疗剂联用。例如,为了治疗以血管畸形为特征的病变,用上述Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂之一的治疗与另一种对以由血管畸形为特征的病变的已知治疗联用,包括但不限于,抗氧化剂、TGF-β信号转导抑制剂、BMP信号转导途径抑制剂、VEGF信号转导途径抑制剂、Yap信号转导途径抑制剂、他汀(参见例如,Hwang等,2013,Int J.Oncol 43,261-270)和RhoA GTP酶水平和/或活性的其他抑制剂及其组合。
因此,本发明还涉及包含2种或更多种活性剂的制剂或治疗系统,其中之一是β-联蛋白的抑制剂。
本发明的优选抑制剂进一步列于以下,选自:
舒林酸,也称为(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲基亚磺酰基)亚苄基]茚-3-乙酸或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基亚磺酰基苯基)亚甲基]茚-1-基]乙酸;舒林酸硫化物,也称为(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲硫基)亚苄基]茚-3-乙酸或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基亚磺酰基苯基)亚甲基]茚-1-基]乙酸;舒林砜,也称为(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲基磺酰基)亚苄基]茚-3-乙酸或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基磺酰基苯基)亚甲基]茚-1-基]乙酸;磷酸-舒林酸,也称为(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲基亚磺酰基)亚苄基]茚-3-乙酸4-二乙氧基磷酰氧基丁酯或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基亚磺酰基苯基)亚甲基]茚-1-基]乙酸4-二乙氧基磷酰氧基丁酯;磷酸-舒林酸硫化物,也称为2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基硫烷基苯基)亚甲基]茚-1-基]乙酸酯;磷酸-舒林砜,称为2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基磺酰基苯基)亚甲基]茚-1-基]乙酸4-二乙氧基磷酰氧基丁酯;水飞蓟宾,也称为2,3-二氢-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-(羟基甲基)-6-(3,5,7-三羟基-4-氧代苯并吡喃-2-基)苯并二氧芑;姜黄素,也称为(E,E)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;白藜芦醇,也称为3,4’,5-三羟基-反式芪;盐霉素,及其药学上可接受的盐或类似物。类似物是在结构上相似但在元素组成上不同的化合物。结构研究对于产生类似物,尤其是舒林酸代谢物的类似物以鉴定可能增强其化学活性同时降低其毒性的化学修饰而言有非常积极的作用(例如,磷酸化57或苄基酰胺衍生化,Whitt等,2012,CancerPrev.Res.5,822-833)。
“药学上可接受的盐”包含通过用有机或无机碱成盐获得的常规无毒盐。无机盐是,例如,金属盐,尤其是碱金属盐,碱土金属盐和过渡金属盐(如,钠、钾、钙、镁、铝)。也可用碱,如氨或仲胺或叔胺(如二乙基胺、三乙基胺、哌啶、哌嗪、吗啉),或用碱性氨基酸,或用糖胺(如葡甲胺),或用氨基醇(如3-氨基丁醇或2-氨基乙醇)来获得盐。
此外,本发明的化合物可以是非溶剂合物或者是与药学上可接受的溶剂如水,乙醇等形成溶剂合物。
本发明还包括药物组合物,其特征为含有选自以下的一种或多种活性成分:舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、磷酸-舒林酸、磷酸-舒林酸硫化物、磷酸-舒林砜、水飞蓟宾、姜黄素、白藜芦醇、和盐霉素,与药学上可接受的运载体、赋形剂和稀释剂,所述药物组合物用于治疗以血管畸形为特征的病变,尤其是脑海绵状畸形(CCM)。
本发明的组合物可通过任意接受的给药模式或用于相似应用的试剂给予。因此,给药可以是,例如,口服、鼻内、胃肠外(静脉内、皮下、肌内)、口颊、舌下、直肠、局部、透皮、膀胱内,或使用任何其他给药途径。
可按照已知方法在药学上配制化合物。药物组合物可以基于治疗需要进行选择。这些组合物可以通过掺混制备并且适当地调配成口服或胃肠外给药,这样,可以片剂、胶囊、口服制剂、粉末剂、颗粒剂、丸剂、注射剂或可滴注的液体溶液、混悬剂或栓剂。
用于口服给药的片剂和囊剂一般以单位剂型呈现并且含有常规赋形剂如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、去污剂、崩解剂、着色剂、风味剂和湿润剂。可使用本领域熟知方法对片剂进行包衣。
合适的填充剂包括纤维素、甘露醇、乳糖和其他类似试剂。合适的崩解剂包括聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物,如淀粉乙醇酸钠。合适的润滑剂包括,例如,硬脂酸镁。合适的湿润剂包括月桂基硫酸钠。
口服固体组合物可以通过掺混、填充或压片的常规方法制备。掺混操作可以重复进行,从而将有效成分分布到含有大量填充剂的组合物中。这些操作是常规的。
口服液体制剂可以是例如水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆或酏剂的形式,或者可以是临用前用水或合适载剂重建的干燥产品。这类液体制剂可含有常规的添加剂,例如助悬剂,如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、或氢化食用脂;乳化剂,如卵磷脂、去水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶;非水性载剂(可包括食用油),如杏仁油、分馏椰子油,油酯(如甘油、丙二醇或乙醇的酯);防腐剂,如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或者山梨酸,需要时还可含有常规的调味剂或着色剂。
口服制剂也包括常规缓释制剂,例如肠溶包衣片或颗粒。
对于胃肠外给药(例如,推注或连续输注),可制备含有化合物和无菌载剂的流体单位剂型(例如,在安瓿中或在多剂容器中)。化合物可以悬浮或溶解,取决于载剂和浓度。通常通过将化合物溶解在运载体中,过滤消毒,装入合适的药瓶并密封来制备胃肠道外给药溶液。有利的是,可将佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解于载剂中。为了增加稳定性,组合物可以在填充小瓶并且真空下除水后进行冷冻。胃肠外混悬剂可以以基本上相同的方式进行制备,只是化合物悬浮在载剂中而非溶解在其中,在悬浮于无菌载剂中之前暴露于环氧乙烷进行灭菌。有利的是,组合物可以包含表面活性剂或湿润剂以便于本发明化合物的均匀分布。
对于含服或舌下给药,组合物可以是片剂、锭剂、软锭剂或凝胶。
化合物可以被药学配制成栓剂或保留灌肠剂,例如含有常规栓剂基质如可可豆脂、聚乙二醇或其他甘油酯,用于直肠给药。
另一种给予本发明化合物的方式涉及局部治疗。局部制剂可以包括例如:软膏剂,乳膏剂,洗剂,凝胶,溶液剂,糊剂和/或并且包含脂质体,胶束和/或微球。软膏剂的例子包括:油脂性软膏,例如植物油,动物脂肪,半固体烃,可乳化的软膏,例如硫酸羟基硬脂精,无水羊毛脂,十六醇,甘油单硬脂酸酯,硬脂酸,水溶性软膏,含有各种分子量的聚乙二醇。如制剂专家所知,乳膏剂是粘稠液体或半固体乳剂,含有油相、乳化剂和水相。油相通常含有凡士林油和醇如十六或十八醇。乳膏制剂中的乳化剂选自非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。可加入分散剂如醇或甘油用于制备凝胶。可通过精细粉碎和/或混合来分散胶凝剂。
给予本发明化合物的另一种方法涉及透皮递送。常见的透皮制剂包括传统的水性和非水性载剂(vector),例如乳膏、油、洗剂或糊剂或者可以以膜或者加药贴剂的形式提供。
制剂参考参见雷明顿的书(《雷明顿:药物科学与实践》“Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy”,LWW出版社(Lippincott Williams&Wilkins),2000)。
本发明还包括通过经工程改造以靶向例如,如CCM病灶中那样表达EndMT标志物(如Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-钙粘蛋白、Zeb2,其他标志物示于Fadini等,2012;Margariti等,2012;Li等,2012;Liang等,2011;Stein等,2006;Medici等,2012)的病理性内皮细胞的合成纳米颗粒的给药(Davis等,2010,Nature 464,1067-1071;Dashi等,2012Adv Mater.,24,3864-3869)。可在这类纳米颗粒中包封小分子、蛋白质、肽、反义核酸。
上述用途和方法也包括相对于给予选自舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、磷酸-舒林酸、磷酸-舒林酸硫化物、磷酸-舒林砜、水飞蓟宾、姜黄素(参见例如Cheng等,2013,IntJ.of Oncology 43,895-902)、白藜芦醇、和盐霉素的化合物同时或延迟的共同给予其他治疗剂的可能性。
在前述用途和方法中,选自舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、磷酸-舒林酸、磷酸-舒林酸硫化物、磷酸-舒林砜、水飞蓟宾、姜黄素、白藜芦醇、和盐霉素的化合物的剂量可根据多种因素变化,包括患者类型和条件、疾病严重程度、给药模式和时间、饮食和药物组合。作为指示,它们可以0.001至1000mg/kg/天的剂量范围内给予。就具体患者确定最优剂量为本领域技术人员熟知。优选的剂量范围是1至10mg/kg/天,最优选的范围是10至100mg/kg/天。更优选的剂量范围是100至200mg/kg/天。更优选的剂量范围是200至500mg/kg/天。更优选的剂量范围是500至1,000mg/kg/天。优选地,本发明的抑制剂通过口服给予。
作为常规做法,组合物通常伴有书写或者印刷的针对治疗过程的使用说明。
通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。
图1.CCM3-ECKO(CCM3的内皮-细胞-特异性纯合缺失)小鼠脑和视网膜血管中的内皮细胞显示出强化的β-联蛋白转录活性。a-c.来自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠(具有CCM3基因的内皮-细胞-特异性-失活的小鼠)的脑切片(a,b)和视网膜(c,平面固定)(a,c,XY轴;b,沿着X轴的Z凸起)的b-gal代表性免疫染色,b-gal作为血小板-内皮细胞粘附分子阳性(内皮)细胞中β-联蛋白转录活性的基因报告物。用DAPI对核进行染色。箭,b-gal-阴性核;箭头,b-gal-阳性核。以63倍放大倍数在50个随机视场中对内皮细胞核进行计数。使用对于内皮细胞进行的血小板-内皮细胞粘附分子的标记对随机视场计数的定量(参见方法)发现来自野生型BAT-gel小鼠的对照脑内皮细胞的b-gal-阳性核(每个视场0.86±0.15个阳性核;阳性核占600个总内皮核的7.2%)在CCM3-ECKO脑内皮细胞中显著增加6倍(每个视场6.0±1.7个阳性核;阳性核占700个总内皮核的42.9%)(p<0.05;t-检验)。在这些CCM3-ECKO脑内皮细胞中,b-gal-阳性核在建立的海绵状和毛细血管扩张症中有类似的分布。
b-gal-阳性核在来自CCM3-ECKO小鼠的脑和视网膜内皮细胞中的丰度高于对照细胞。对于视网膜(c),显示了中间区域的两条静脉。a-c中的样品来自dpn 9同窝鼠仔。比例尺,20mm。
图2.培养中的CCM3-敲除内皮细胞显示出活性β-联蛋白离开细胞-细胞连接处并且其浓缩到核中,其中他们有转录活性。a,b.野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)内皮细胞的活性β-联蛋白的代表性免疫染色。原代培养物(a)和细胞系(b)。用DAPI对核进行染色。箭头,β-联蛋白-阳性核。在这些CCM3-敲除内皮细胞中,CCM3转录本减少70%~90%(原代培养物)并且无法通过rtPCR检测到(系)。比例尺,20mm。c.对野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)内皮细胞系的膜(M)、胞质(C)和核(N)隔室的代表性细胞分级分离和Western印迹。总计,膜和核活性β-联蛋白分别减少34%~42%,减少58%~75%,和增加51%~66%;与野生型内皮细胞相比,活性β-联蛋白在CCM3-敲除中的胞质中几乎无法检测到。在野生型中,CCM3在胞质中富集;在CCM3敲除中,Western印迹没有检测到CCM3。d,e.对野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)内皮细胞系中没有(-)和有(+)显性阴性Tcf4表达的内皮祖细胞表型/EndMT标志物(e)和典型β-联蛋白靶标(d)的定量。数据是来自三次独立实验的三次重复rtPCR试验的平均值(±SD)。微管蛋白转录本a和b,其不是CCM3敲除的靶标,没有受到显性阴性Tcf4的修饰(未公开结果)。**,p<0.01,CCM3敲除对比对照(WT)。^,p<0.05;^^,p<0.01,CCM3敲除加上显性阴性Tcf4(+)对比CCM3敲除加上GFP(-)(t-检验)。
图3.CCM3-敲除内皮细胞显示出舒林酸硫化物对β-联蛋白靶基因转录的抑制以及诱导活性β-联蛋白从核向粘着连接的再定位。a.通过rtPCR对原代培养物中野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)脑内皮细胞中β-联蛋白靶基因(参见b)Klf4、Ly6a、S100a4和Id1的转录的舒林酸硫化物抑制的定量。*,p<0.05;**,p<0.01(t-检验),比较基本条件下的CCM3-敲除对比WT。^^,p<0.01(t-检验),比较CCM3敲除加上舒林酸硫化物对比载剂处理的CCM3敲除。b.通过rtPCR对(a)中测试的基因的转录的显性阴性Tcf4抑制的定量。*,p<0.05;**,p<0.01(t-检验),比较基本条件下的CCM3-敲除对比WT。^,p<0.05;^^,p<0.01(t-检验),CCM3敲除加上显性阴性Tcf4(+)硫化物对比CCM3敲除加上GFP(-)。c.在舒林酸硫化物处理下的原代培养物中脑内皮细胞的代表性免疫染色。在这些CCM3-敲除内皮细胞中,舒林酸硫化物介导的活性β-联蛋白(载剂处理的KO中的箭头)从核(参见DAPI染色中的相应箭头)再分布到细胞-细胞连接。在KO中,舒林酸硫化物处理后观察到的活性β-联蛋白和VE-钙粘蛋白的共定位。比例尺,15mm。底部两排:在这些CCM3-敲除内皮细胞中,舒林酸硫化物抑制Klf4和S100a4(白色核箭头)的过表达。总核为DAPI-阳性或由白色线列出。在这些CCM3-敲除内皮细胞中,Klf4只在核并且S100a4同时在核和胞质中。比例尺,30mm。
图4.CCM3-ECKO小鼠脑血管中的内皮细胞显示舒林酸硫化物抑制β-联蛋白转录活性并且诱导VE-钙粘蛋白从扩散的分布向粘着连接的再定位。不用(载剂)和用舒林酸硫化物处理的CCM3-ECKO小鼠的脑切片的代表性免疫染色。a.舒林酸硫化物-介导的核中b-gal反应性消除(顶部,箭,对比底部,箭头),b-gal作为血小板-内皮细胞粘附分子阳性(内皮)细胞中β-联蛋白转录活性的基因报告物。各组图显示XY轴(主图),和沿着X轴的Z凸起(下图)。用DAPI对核进行染色。比例尺,25mm。b.这些血管CCM3-ECKO内皮细胞中舒林酸硫化物-介导的VE-钙粘蛋白从扩散分布向细胞-细胞连接的再分布(中间组图,箭头),分布类似于匹配的野生型(WT)小鼠(右组图,箭头)。a和b中的切片来自dpn 9同窝鼠仔。比例尺,30mm。
图5.CCM3-ECKO小鼠的脑血管中的内皮细胞显示舒林酸硫化物对祖细胞和EndMT标志物的过表达的抑制。代表性的免疫染色显示在这些血管CCM3-ECKO内皮细胞(血小板-内皮细胞粘附分子阳性;同工凝集素B4阳性)的核中浓缩的Klf4(顶部,箭头)、S100a4(中间,箭头)、和Id1(底部,箭头)。舒林酸硫化物强力降低了Klf4、S100a4和Id1(箭)的这种核反应性,分布类似于匹配的野生型(WT)小鼠(右组图,箭)。脑切片来自dpn9同窝鼠仔。比例尺,30mm。
图6.CCM3-ECKO小鼠中的脑和视网膜血管显示出舒林酸硫化物诱导的病灶减少。a.不用(载体)和用舒林酸硫化物处理CCM3-ECKO小鼠的脑切片的血管病灶的代表性免疫染色,如桑葚(多海绵状),单海绵状和毛细血管扩张症(Telang)。如63所述对病灶进行分类。b.上图:对(a)中所示的脑病灶的定量(具体参见方法)。来自5只独立幼崽的同窝鼠仔(dpn 9鼠仔):载剂处理(n=8)或舒林酸硫化物处理(n=7)。*,p<0.005,威尔科克森符号秩检验。下图:对脑病灶尺寸的定量(mm,参见方法)。*,p<0.05,t-检验。c.对不用(载剂)和用舒林酸硫化物处理的野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠(dpn 9同窝鼠仔)的视网膜中血管的血小板-内皮细胞粘附分子(内皮细胞)的代表性免疫染色。从静脉(箭)发展出多内腔血管病灶(箭头)。舒林酸硫化物(右下)减少了畸形(箭头)和静脉直径(箭),(也参见e)。d.对(c)中所示的视网膜血管病灶的定量,显示为受到血管病灶影响的视网膜周边的百分比(对于载剂和舒林酸硫化物n=14,参见方法)。*,p<0.05,t-检验。e.对(c)中所示的视网膜血管病灶的代表性免疫染色。以及外周血管畸形,舒林酸硫化物诱导的静脉直径减小(具体参见文本)。这些CCM3-ECKO小鼠的动脉没有显示出这种异常的表型(内皮细胞同工凝集素B4标记)。比例尺,100mm(a);700mm(c);60mm(e)。
图7.CCM3-ECKO小鼠中的脑内皮细胞显示出增强的β-联蛋白转录活性,其早于TGF-β/BMP信号转导活化。a.在CCM3重组(1dpn)后的早期(3dpn)和晚期(9dpn)时间点对来自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠的脑切片内皮细胞中β-gal(β-联蛋白转录活性的基因报告物)(红色,上图)和p-Smad1(TGF-β/BMP信号转导活化的标志物)(红色,下图)的代表性免疫染色。DAPI-染色的核是蓝色的。b.显示了β-gal(红色)、p-Smad1(绿色)和足糖萼蛋白(蓝色)的共染色。在(a)和(b)中,在3dpn鼠仔(a中海绵状和b中毛细血管扩张)中血管畸形的内皮细胞中,箭,β-gal-和p-Smad1-阳性核;空心箭,p-Smad1阴性核。插图,方框区域的放大。比例尺,50μm;a)中的插图,10μm。c.对3和9dpn时的WT和CCM3-ECKO鼠仔的脑切片中的β-gal-阳性和p-Smad1阳性内皮细胞进行定量。在来自三个独立实验中的匹配的同窝鼠仔的样品中各条件的63倍放大倍数的40个随机视场中计算至少450个核的总数。*,对比所示对照,p<0.01(t-检验)。
图8.CCM3-ECKO小鼠中的脑内皮细胞在任意尺寸的病灶中以及假性-正常化血管中显示出增强的β-联蛋白介导的转录,而仅在较大的病灶中可检测到TGF-β/BMP信号转导。a.在9dpn时来自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠的脑切片中内皮细胞(足糖萼蛋白阳性,绿色)中β-gal(红色,上图)和p-Smad1(phosphoSer463/465)(红色,下图)的代表性免疫染色。用DAPI对核进行染色(蓝色)。CCM3-ECKO中显示了假-正常血管以及增加尺寸的血管病灶。箭,p-Smad1-或β-gal-阳性核;空心箭,p-Smad1-阴性核。比例尺为50μm。使用p-Smad3抗体获得类似结果(未公开结果)。b.和c.各种条件计数的总共至少250个内皮核上β-gal-阳性或p-Smad1-阳性内皮核的百分比。在来自匹配的同窝CCM3-ECKO(5只)和WT(5只)小鼠的脑切片中63倍放大倍数的20个随机视场中计算的β-gal-和p-Smad1-阳性和内皮细胞核。*,p<0.05,t-检验。
图9.CCM3-ECKO小鼠中的脑内皮细胞表达与增强的β-联蛋白转录活性相关的干细胞/EndMT标志物。a,b,c,d.在1dpn的CCM3重组后的3dpn(出生后的天数)和9dpn时,对来自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠的脑切片的β-gal(红色)与足糖萼蛋白(蓝色,以鉴定内皮细胞)和不同干细胞/EndMT标志物(Klf4,Ly6a,S100a4,Id1,全部绿色)的代表性免疫染色。箭指向同时表达β-gal和干细胞/EndMT标志物(参见合并,各组图中的右列,黄色)的内皮核(足糖萼蛋白阳性细胞)。比例尺为40μm。e.对内皮核阳性β-gal,Klf4,S100a4和Id1(单阳性),及其在3和9dpn时的WT和CCM3-ECKO鼠仔的脑切片中共定位的定量。对于各干细胞/EndMT标志物与β-gal的共定位,发明人区分的2个内皮细胞群:β-gal阳性群,其中发明人计算EndMT阳性核的数量,和EndMT阳性群,其中发明人计算β-gal阳性核的数量。该分析显示Klf4、S100a4和Id1表达与3dpn鼠仔中的β-联蛋白转录活性高度关联,而其在9dpn鼠仔中部分非偶联。
在来自三个独立实验中的匹配的同窝鼠仔的样品中各条件的63倍放大倍数的50个随机视场中计算至少600个核的总数。*,p<0.05对比代表性WT值(t-检验);^,p<0.05对比3dpn CCM3-ECKO鼠仔中的值。
图10.在培养中的CCM缺陷型内皮细胞中诱导End-MT标志物和β-联蛋白靶基因。在培养的内皮中删除CCM1或CCM2或CCM3中的任一个诱导β-联蛋白驱动的转录活化,如与相应WT相比轴蛋白2的增强转录。EndMt标志物(Klf4,Cd44和S100a4)也上调,附图报告rtPCR。
图11.核β-联蛋白在CCM1-KO内皮细胞中有转录活性并且活化EndMT标志物的转录。a.活性β-联蛋白(在残基37/41上去磷酸)在培养中的CCM1-KO内皮细胞的核中浓缩(箭),而在野生型内皮细胞中,其不在核中且位于细胞-细胞接触处。b.核β-联蛋白在CCM1-KO内皮细胞中在转录上有效,如在Top-fop闪光试验中对比WT增强的转录响应所示。c.β-联蛋白导致CCM1-KO内皮细胞中EndMT标志物的表达,如依昔舒林所示。抑制*,p<0.05对比相应溶剂处理的值(t-检验)。
图12.CCM3-敲除内皮细胞显示β-联蛋白信号转导的细胞自主性Wnt-受体独立活化。a,b,c,d.在未刺激的CCM3-敲除(KO)内皮细胞中轴蛋白2和S100a4转录的β-联蛋白驱动的活化不受porcupine抑制剂IWP2或IWP12(a,b)或Lrp竞争物Dkk1(0.5uM)(c)的抑制,其在野生型和CCM3-敲除内皮细胞系中有效抑制轴蛋白的Wnt3a-诱导的刺激(d)。S100a4的转录既不受野生细胞中Wnt3a的诱导,也不受CCM3-敲除细胞中Dkk1的抑制。e,f.与野生型内皮细胞相比,在基础条件中和在CCM3-敲除中Wnt3a刺激之后,Wnt共受体Lrp6活化(磷酸化)程度都较低。显示了(f)中定量的代表三个独立试验的Western印迹。*,p<0.05对比WT(t-检验)。g,h.用Wnt3a急性刺激(48小时)不能在野生型内皮细胞中诱导干细胞/EndMT标志物的表达,而用β-联蛋白Lef-ΔβCTA的活化形式持续刺激(7天)旁路Wnt受体则可以(Vleminckx等,1999)。*,p<0.05对比WT(t-检验)。i.典型β-联蛋白靶基因(轴蛋白2,Ccnd1,Nkd1)和干细胞/EndMT标志物(S100a4,Id1)的活化是野生型内皮细胞中对siRNA沉默VE-钙粘蛋白的早期响应(48小时)。对于siRNA敲减CCM3的类似急性响应,参见图17。*,p<0.05对比阴性对照siRNA-处理的细胞(t-检验)。
图13.VE-钙粘蛋白沉默后的连接拆散诱导了内皮细胞中活性β-联蛋白的核积聚。然而,没有强化Smad1磷酸化。a.野生型内皮细胞系中通过siRNA的VE-钙粘蛋白急性下调后(48小时)活性β-联蛋白(红色)和VE-钙粘蛋白(绿色)的代表性免疫染色。连接拆散和VE-钙粘蛋白下调(箭)伴随活性β-联蛋白的核积聚(箭头)。DAPI显示的核是蓝色的。用阴性(非靶向)siRNA处理对照(Ctr siRNA)。比例尺为30μm。b.在相同细胞中,VE-钙粘蛋白敲减并不刺激Smad1磷酸化,如Western印迹中测量。
图14.CCM1、2和3删除的常见特征是连接解散。海绵状血管瘤的内皮细胞系(病灶)显示紊乱的粘着连接(VE-钙粘蛋白染色,红色)。显示了CCM1-ECKO,CCM2-ECKO和CCM3-ECKO鼠仔(7dpn并且在1dpn时融除CCM基因)的脑切片。相比之下,VE-钙粘蛋白在野生型(WT)同窝鼠仔的脑内皮细胞中规律地分布于细胞-细胞接触处。核由DAPI染色成蓝色。在下图中放大来自CCM-ECKO脑的切片的黄色方框区域。
图15.在CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠中CRE重组酶的内皮选择性表达之后(他莫昔芬诱导的CRE重组酶内皮细胞特异性表达和CCM3基因重组),该小鼠模型的脑和视网膜显示形成血管病灶。这些畸形从静脉血管中发展,即使CRE重组酶也在动脉中有活性。a.在dpn1时用他莫昔芬处理CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠(10mg/kg体重,如方法中所述)以诱导CRE重组酶的内皮细胞特异性表达和floxed/floxed CCM3基因重组(CCM3-ECKO小鼠)。解剖后肉眼观察形貌显示小脑和视网膜中的明显病灶(箭头)。在脑中,也可观察到一些表面血管畸形(小箭头),但大部分病灶仅可在切片和免疫染色之后检测到,如正文所示。在用他莫昔芬处理3-4天后开始出现这些病灶,并且它们的尺寸逐渐增大。在他莫昔芬处理后10天,这些CCM3-ECKO小鼠开始死亡,有明显出血性小脑。他莫昔芬在不表达CRE重组酶的CreERT2阴性的CCM3-floxed/floxed-Cdh5(PAC)小鼠和在杂合CCM3-floxed/+-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠中都不诱导任何表型。野生型(WT)小鼠是用他莫昔芬处理的CCM3+/+-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠。用于溶解他莫昔芬的载剂处理的CCM3-floxed/floxed-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠也显示出WT表型。比例尺,1cm。b.CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠与Rosa 26-增强绿色荧光蛋白(EYFP)小鼠(Srinivas等,2001)杂交以通过EYFP的表达监测CRE重组酶的表达。在来自CCM3+/+-Cdh5(PAC)-CreERT2-R26-EYFP小鼠和CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-R26-EYFP(CCM3-ECKO)小鼠的视网膜的血管中,由报告基因EYFP的表达来显示Cre-诱导的重组(通过他莫昔芬处理,如上所述)。这频繁发生在这两种小鼠模型的动脉(箭头)、静脉(箭)和毛细血管中,并且由EYFP和血小板-内皮细胞粘附分子(内皮细胞标记物)标记的广泛共定位显示。与载剂处理的野生型小鼠相比,在CCM3-ECKO鼠仔的新鲜分离的脑毛细血管中通过rtPCR评价的CCM3转录本减少超过80%。比例尺,200mm。c.在CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2(CCM3-ECKO)小鼠的视网膜中,畸形仅发生在血管网络的静脉侧,其可以在视网膜中在形态上(如b中)并通过内皮粘蛋白阳性染色(箭)区分。箭头显示动脉血管,其是内皮粘蛋白阴性且同工凝集素B4阳性。发明人还观察到在内皮特异性消融CCM1(Maddaluno等,2013)和CCM2(Boulday等,2011)之后类似的静脉特异性缺陷。比例尺,700mm。在b和c中,显示了来自dpn9同窝鼠仔的视网膜。
图16.CCM3-敲除内皮细胞系显示出对β-联蛋白靶基因和祖细胞/EndMT标志物转录的抑制(a),对活性β-联蛋白定位至核的抑制和对与VE-钙粘蛋白一起结合粘着连接的诱导(b),对β-联蛋白和VE-钙粘蛋白复合物免疫共沉淀损失的抑制(c),和Top/Fop闪光试验中对荧光素酶报告基因的β-联蛋白/Tcf4-依赖性转录的抑制(d)。a.对舒林酸硫化物、舒林砜、和已经报告靶向β-联蛋白信号转导途径的不同步骤的其他药物在这些野生型(WT)和CCM3-敲除上皮细胞系中对β-联蛋白靶基因(轴蛋白2)和内皮祖细胞/EndMT标志物(Klf4,S100a4)的影响的定量。舒林酸硫化物和舒林砜在这些CCM3-敲除内皮细胞中显示出对轴蛋白2、Klf4和S100a4转录强诱导的最大抑制。在本文测试的其他药物中,水飞蓟宾有效针对这三种转录本,而盐霉素仅显著降低轴蛋白2和S100a4。数据是至少三次独立实验的平均rtPCR值,各自一式三份进行。*,p<0.05,**,p<0.01对比载剂处理的CCM3-敲除内皮细胞中的相应转录本(t-检验)。其他详细内容参见方法。在CCM3敲除之后5-25代的细胞获得相当的结果。b.在这些野生型(WT)和CCM3-敲除内皮细胞系中,舒林酸硫化物对从粘着连接重定位至核中的活性β-联蛋白的影响的代表性免疫染色。在这些CCM3-敲除内皮细胞中,活性β-联蛋白和VE-钙粘蛋白从细胞-细胞接触处(粘着连接)丢失(顶部主图,XY轴;小下图,沿X轴的Z凸起)。活性β-联蛋白(KO载剂,箭头)在核中浓缩(参见DAPO染色中的相应箭头)(右图)。用舒林酸硫化物处理使活性β-联蛋白恢复分布至粘着连接(右图,舒林酸硫化物,箭头,和小右下图,舒林酸硫化物,小箭头,沿Z轴分布)并且观察到活性β-联蛋白和VE-钙粘蛋白的共定位(箭头)。沿X轴的Z凸起的下图:内皮细胞顶侧极性标志物足糖萼蛋白,显示在这些CCM3-敲除内皮细胞中的极性标志物损失。足糖萼蛋白从顶侧表面(左图,WT,箭)重定位以异位分布到CCM3敲除的基侧(右图,载剂,箭头),如CCM1敲除所报告46。由白线显示核(DAPI)。舒林酸硫化物重新建立足糖萼蛋白的正确顶侧分布(右图,舒林酸硫化物,箭)。比例尺,30mm。c.对舒林酸硫化物对β-联蛋白和VE-钙粘蛋白复合物的免疫共沉淀的影响的代表性Western印迹(上)和定量(下)。上图:用VE-钙粘蛋白抗体(IP:VE)对野生型(WT)和CCM3-敲除内皮细胞的总提取物和免疫沉淀物的Western印迹。通过舒林酸硫化物处理,恢复了CCM3敲除中VE-钙粘蛋白的水平降低(与总舒林酸硫化物-KO和载剂-WT相比)。下图:通过测量为β-联蛋白/VE-钙粘蛋白比例的共沉淀复合物,通过舒林酸硫化物处理,CCM3敲除中β-联蛋白和VE-钙粘蛋白之间显著减少的结合(35%±0.32SD,*,p<0.05,载剂-KO对比载剂-WT)恢复到野生型细胞(WT)中观察到的水平(^,p<0.05,舒林酸硫化物-KO对比载剂-KO,t-检验)。使用ImageJ,以三次独立实验的方式,对来自Western印迹的条带的定量。d.在Top/Fop闪光试验中(详细内容参见方法),舒林酸硫化物抑制(^,p<0.05,舒林酸硫化物-KO对比载剂-KO,t-检验)荧光素酶报告基因的β-联蛋白/Tcf4-依赖性转录的显著增加(**,p<0.01,载剂-KO对比载剂-WT,t-检验)。转染效率(β-半乳糖苷酶活性)标准化的Top-闪光和Fop-闪光值之间的比例显示为与载剂-WT的比例(相对Top/Fop-闪光值)相比的倍数变化。
图17.CCM3-敲除内皮细胞系显示舒林酸硫化物对内皮祖细胞/EndMT20标志物过表达的抑制。相应的免疫染色显示,与野生型(WT)相比,在这些CCM3-敲除(KO)内皮细胞中Klf4、S100a4、Id1和CD44的表达增加。用DAPI对核染色(由白线显示)。CCM3-敲除中Klf4(顶排)和Id1(第三排)的过表达局限于核中(箭头指向KO,载剂中的白色核)。类似地,S100a4(第二排)同时是核(KO,载剂,白色核,箭头)和胞质的(KO,载剂),而CD44(底排)大多数是胞质的(KO,载剂)。用舒林酸硫化物处理(右图)在这些CCM3-敲除(KO)内皮细胞中强力减少了这些蛋白质的过表达。在CCM3-敲除脑内皮细胞的原代培养物中观察到相当的结果,如图3所示。比例尺,30mm。
图18.如方法中所述,用载剂或舒林酸硫化物处理(从dpn2开始)的CCM3-ECKO鼠仔(dpn9时)显示舒林酸硫化剂减少了脑血管中的畸形。用血小板-内皮细胞粘附分子(内皮细胞)对脑切片的代表性免疫染色。a.从背侧表面进入脑的上矢状窦血管。对于CCM3敲除(载剂),具有大直径的直血管似乎在形成海绵状的出芽分支处终止。在相当的血管中,该CCM3敲除中舒林酸硫化物处理极大地降低了这些血管的直径并且促进表观正常的末端支化。组图显示了20倍放大获得的样品共聚焦光学切片的最大突出。比例尺,100mm。如a中那样处理CCM3-ECKO鼠仔的内矢状切片中的病灶。对于CCM3敲除(载剂),盖仑(Galean)大脑大静脉的末端区显示桑葚状的病灶,其显示在分支血管的末端处形成(箭头)。该CCM3敲除中舒林酸硫化物治疗极大地减少了桑葚状芽末端。比例尺,100mm。
图19.与舒林酸硫化物的效果相似,CCM3-敲除内皮细胞系显示出对活性β-联蛋白和VE-钙粘蛋白从细胞-细胞接触处(粘着连接)损失,活性β-联蛋白在核中积聚,和祖细胞/EndMT标志物过表达的抑制。代表性的免疫染色显示,这些CCM3-敲除内皮细胞(KO,载剂,箭头)中,活性β-联蛋白从细胞-细胞接触处损失(上排)及其重定位至核(第二排)被舒林砜处理抑制。用DAPI对核进行染色。类似地,VE-钙粘蛋白从细胞-细胞接触处损失被舒林砜处理抑制(第三排)。舒林砜处理也强力降低了这些CCM3-敲除(KO)内皮细胞中Klf4(核,载剂,箭头)和S100a4(胞质和核)的过表达(下排)。在VE-钙粘蛋白、Klf4和S100a4染色中,用白线表示核(DAPI)。比例尺,30mm。
图20.与舒林酸硫化物的效果相似,CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal(CCM3-ECKO)小鼠显示舒林砜减少脑血管中的畸形。在dpn1时用他莫昔芬处理这些小鼠(10mg/kg体重,如方法中所述)以诱导CRE重组酶的内皮细胞特异性表达和floxed/floxedCCM3基因重组(CCM3-ECKO小鼠)。从dpn2开始,也每天用载剂或用舒林砜(30mg/kg)处理它们。a.解剖后的dpn9鼠仔的肉眼观察形貌显示在CCM3-ECKO小鼠小脑中的明显病灶(箭头)。比例尺,0.65cm。下图:对小脑的进一步放大。比例尺,0.3cm。b.对来自3个载剂处理和3个舒林砜处理的CCM3-敲除小鼠的全脑中桑葚状(多内腔)、单海绵状、或毛细血管扩张病灶的主要脑病灶的情况的定量(如62中所述,参见方法)。沿矢状轴对脑进行切片(150mm切片,冠状切片),用血小板-内皮细胞粘附分子(内皮细胞)染色并且通过宽视野荧光显微镜(10倍和20倍放大)检验。*,p=0.0053,0.006,0.004,分别针对桑葚状、单海绵状和毛细血管扩张病灶(威尔科克森检验)。c.对VE-钙粘蛋白、Klf4和S100a4定位的代表性免疫染色。左图:舒林砜使载剂处理的CCM3-ECKO小鼠中VE-钙粘蛋白从扩散状态恢复至定位于细胞-细胞连接处(箭头)。中图,右图:从载剂处理的CCM3-ECKO小鼠中Klf4(中图)和S100a4(右图)的表达的核心染色中,舒林砜使针对Klf4和S100a4的这种核反应性降低。用同工凝集素B4或血小板-内皮细胞粘附分子对内皮细胞进行染色。比例尺,15mm。
发明详述
方法
CCM3-flox/flox小鼠中内皮细胞特异性重组以生成CCM3-ECKO小鼠
在TaconicArtemis(德国科隆)生成CCM3-flox/flox小鼠。插入2个P-lox序列,其侧接鼠CCM3基因的外显子4和5,在CRE重组酶切割后产生功能丧失突变。这些CCM3-flox/flox小鼠与Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠(Wang等,2010)杂交,针对CRE重组酶的他莫昔芬诱导性内皮细胞特异性表达和CCM3基因重组。CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠进一步与BAT-gal小鼠杂交(Maretto等,2003)以监测β-联蛋白转录信号转导的活化,并且与Rosa26-增强绿色荧光蛋白(EYFP)(Rosa26EYFP)小鼠杂交(Srinivas等,2001)以通过EYFP的表达监测CRE重组酶的表达。他莫昔芬(西格玛公司(Sigma))溶于玉米油和10%乙醇中(10mg/ml),然后在单次胃内给予dpn 1-2鼠仔之前在玉米油中1∶5稀释(35mg/kg体重),如14中所述。对照(野生型)小鼠包括用用于溶解他莫昔芬的载剂(玉米油加2%乙醇)处理的CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal小鼠,和用他莫昔芬处理的CCM3+/+--Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal小鼠。
如上述针对CCM3-ECKO小鼠所详述,已经从CCM1-flox/flox和CCM2-flox/flox小鼠中获得了CCM1-ECKO和CCM2-ECKO,参见Maddaluno等,2013和Boulday等,2011。
小鼠基因分型
以下探针用于小鼠基因分型:野生型CCM3等位基因:5’GAT AGG AATTAT TAC TGCCCT TCC 3’(SEQ ID No.1),5’GAC AAG AAA GCA CTG TTG ACC 3’(SEQ ID No.2);CRE重组酶诱导的重组之后删除的CCM3基因:5’GAT AGG AAT TAT TAC TGC CCT TCC 3’(SEQ IDNo.3),5’GCT ACC AAT CAG CTT CTT AGC CC 3’(SEQ ID No.4),Cdh5(PAC)-CreERT2基因:5′CCA AAA TTT GCC TGC ATT ACC GGT CGA TGC 3′(SEQ ID No.5),5′ATC CAG GTT ACGGAT ATA GT 3′(SEQ ID No.6);BAT-gal基因:5′CGG TGA TGG TGC TGC GTT GGA 3′(SEQID No.7),5′ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC 3′(SEQ ID No.8);Rosa 26EYFP基因:5′GCGAAG AGT TTG TCC TCA ACC 3′(SEQ ID No.9),5′GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3’(SEQID No.10),5′AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3′(SEQ ID No.11)。
用舒林酸硫化物和舒林砜处理
舒林酸硫化物(西格玛公司)和舒林砜(西格玛公司)都溶解于DMSO中并在玉米油中进一步1∶50稀释。从诱导重组后的一天开始,每天胃内给予它们(30mg/kg体重)。仅用载剂(玉米油加2%DMSO)平行处理对照小鼠。发明人没有观察到与载剂处理的小鼠相比,药物处理的CCM3-ECKO小鼠中出现增加的来自血管病灶的出血或死亡率。
用IWP2、IWP12、DKK1和Wnt3a处理
在所示试验之前,向融合细胞中加入药物持续48小时。同时来自西格玛-奥德里奇公司的IWP2和IWP12的终浓度为0.5,2,5μM。药物溶于DMSO,对照处理(载剂)为0.1%DMSO终浓度,如用于药物处理那样。鼠重组Dkk1(R&D公司)为细胞上0.5μM。附图说明中所示时间的鼠重组Wnt3a(R&D公司)为5ng/ml。
在体外分离中,培养和重组来自CCM3-flox/flox小鼠的内皮细胞。
如前所述13,从脑中分离来自CCM3-flox/flox小鼠(8-10周龄)的内皮细胞。如前所述59,通过在培养第1天用AdenoCre病毒载体处理细胞来诱导floxed CCM3基因的重组。对照内皮细胞是用AdenoGFP代替AdenoCre处理的相同内皮细胞制备物的等份。如正文所述,在分析之前,细胞维持在培养中持续另外7天。在处理细胞之前,进行48小时的药物处理。
在一些实验中,来自CCM3-flox/flox小鼠(8-10周龄)的肺的内皮细胞系通过表达多瘤中间T基因在培养物中永生化60。用AdenoCre病毒载体(对照细胞中用AdenoGFP)来实现CCM3基因的融除。这些细胞然后在培养物中保持至25代,而在这种CCM3融除效果中没有可检测的变化。这些内皮细胞系以与体外脑内皮细胞的原代培养物和体内脑内皮细胞相当的方式对CCM3的缺失作出响应。
对培养中的细胞的药物处理
在所示试验之前,向融合细胞中加入药物持续48小时。使用的终浓度为:135mM舒林酸硫化物,125mM舒林砜,200mM水飞蓟宾,40mM姜黄素,40mM白藜芦醇,和250mM盐霉素(全部来自西格玛-奥德里奇公司)。所有这些药物溶于DMSO,对照处理(载剂)为0.1%DMSO终浓度,如用于药物处理那样。
对培养中的脑切片、视网膜和细胞的用于荧光显微术的免疫染色
来自鼠仔的脑和眼在解剖后立即固定在3%多聚甲醛中,并且这种固定在4℃下持续过夜。在即将染色之前将视网膜从眼上整体切下。固定的脑包埋在4%低熔点琼脂糖中使用切片机(1000Plus,美国密苏里州圣路易斯的切片机公司(The Vibratome Company))并沿矢状轴(150mm)切片。
分别在12孔和96孔板中对悬浮样品的脑切片和视网膜进行染色。它们在4℃下在含有1%鱼皮明胶和0.5%曲通X100和5%驴血清的含0.01%硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中过夜封闭。样品在4℃下用在含有1%鱼皮明胶和0.25%曲通X100的含0.01%硫柳汞的PBS中稀释的一抗过夜孵育。在用含0.1%曲通X100的PBS洗涤之后,在室温下加入在含有1%鱼皮明胶和0.25%曲通X100的含0.01%硫柳汞的PBS中的二抗持续4小时。用DAPI的孵育在PBS中持续4小时,然后在PBS中多次洗涤,用3%多聚甲醛在室温下后固定5分钟,并且在PBS中另外洗涤。脑切片固定在含DAPI的Vectashield中,并且用指甲油固定盖玻片,视网膜固定在含DAPI的Prolong金中。
如前所述对体外培养的细胞进行固定和染色46。
抗体
使用以下抗体:抗-血小板-内皮细胞粘附分子(仓鼠;MAB1398Z,密理博公司(Millipore));抗-β-半乳糖苷酶(鸡;ab9361,阿柏堪穆公司(Abcam));抗-VE-钙粘蛋白(大鼠单克隆;550548,BD生命科学公司);抗-VE-钙粘蛋白(山羊;sc-6458,圣克鲁兹公司(Santa Cruz));抗-活性-β-联蛋白(小鼠单克隆克隆8E7),在Ser37和Thr41上去磷酸化,密理博公司);抗-总-β-联蛋白(小鼠单克隆;细胞信号公司(Cell Signaling));抗-S100a4(兔;07-2274,密理博公司);抗-Klf4(山羊;AF3158,R&D公司);抗-CD44(大鼠;553131,BD生命科学公司);抗-ID1(兔;sc-488,圣克鲁兹公司);抗-aSMA(小鼠单克隆;F3777,西格玛公司);抗-GFP(兔;A-6455,英杰公司);抗-足糖萼蛋白(山羊;AF1556,R&D公司);抗-磷酸-组蛋白H3(兔;ab51776,密理博公司);抗-CCM3(兔;欧基公司(Eurogentec));抗-p-Smad1(兔;9516,细胞信号公司);抗-内皮粘蛋白(兔;sc-65495,圣克鲁兹公司);抗-β-微管蛋白(小鼠单克隆;T9026,西格玛公司)。由Alexa555-偶联的链霉素(分子探针公司(MolecularProbes))显示了生物素-偶联的同工凝集素B4(载体实验室公司(Vector Lab))也用于鉴定视为网膜和脑切片中的内皮细胞。
用于免疫荧光的二抗是-Alexa448和抗-Alexa555,以及Cy3-偶联的抗体,其在驴中针对合适动物物种的免疫球蛋白产生(分子探针公司或杰克逊实验室公司(JacksonLaboratories))。
用于Western印迹的二抗是HRP-连接的抗-小鼠、抗-大鼠和抗-兔抗体(细胞信号公司),和HRP-连接的抗-山羊抗体(普洛麦格公司(Promega))。
rtPCR
用RNeasy试剂盒(74106;普洛麦格公司)来进行RNA提取。RNA(1μg)用随机六聚物(高能cDNA库试剂盒;应用生物系统公司)逆转录。使用7900HT热循环仪(ABI/Prism)用TaqMan基因表达试验(应用生物系统公司)来扩增cDNA。对于各样品,用比较阈值循环(Ct)方法来确定表达水平,并标准化至编码18S和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的管家基因。对于扩增,使用已经验证识别rtPCR中的小鼠转录本的以下探针(应用生物系统公司):轴蛋白2、Nkd1、Lef1、ccnd1、cMyc、Klf4、Ly6a、S100a4、Id1、Cdh2、Acta2、CD44。
如下定制设计鉴定CCM3mRNA转录本的探针:正向,CGAGTCCCTCCTTCGTATGG(SEQ IDNo.12);反向,GCTCTGGCCGCTCAATCA(SEQ ID No.13);报告序列,CTGATGACGTAGAAGAGTACA(SEQ ID No.14)。
Top/Fop-闪光试验
为了监测报告靶标的β-联蛋白依赖性转录,使用Top-Flash质粒(0.3mg/cm2细胞培养面积),其含有7个控制萤火虫荧光素酶转录的Tcf/Lef结合位点(Lluis等,2008)。按照生产商的说明(英杰公司),使用Lipofectamine2000将其转染到来自肺的内皮细胞中。共转染用于b-gal的组成型表达的pCMV质粒(0.1mg/cm2),用于将荧光素酶表达标准化至转染效率。作为阴性对照,使用Fop-Flash质粒,其含有6个小启动子上游的突变的(即,无活性)Tcf/Lef位点和萤火虫荧光素酶基因(0.3mg/cm2)。其与b-gal质粒共转染,用于标准化,如上所述。使用用于联合检测萤火虫荧光素酶和b-gal的双光报告基因试验系统(应用生物系统公司)。按照生产商说明进行细胞提取和化学发光检测(Glomax 96微孔板光度计;普洛麦格公司)。
Western印迹和免疫沉淀
使用标准流程通过Western印迹和免疫沉淀来提取并分析蛋白质内容物46。核分级分离如前所述62。
评价病灶负荷
对于病灶的分类和计数,来自dpn9同窝鼠仔的全脑进行切片并针对血小板-内皮细胞粘附分子免疫染色,如之前和方法中所述。然后在宽视野荧光显微镜(10倍和20倍)下检查切片。如63中所述,病灶分类为桑葚状(多海绵状,超过2个连续海绵状的组)、单海绵状(单根扩张血管,最大直径容纳超过25个红细胞)、或毛细血管扩张症(具有异常扩张的内腔的曲折小血管)。通过将全部类型的病灶加和来计算病灶总数。
由于切片为150mm厚,对可跨2个切片的桑葚状病灶的数量进行校正。因此,桑葚状病灶的数量除以2.5。由2名未知治疗的观察者独立对病灶进行计数和分类。
桑葚状病灶和单海绵状的最大直径用于统计学比较。
siRNA实验
分别使用针对鼠VE-钙粘蛋白的siRNA寡聚体来沉默VE-钙粘蛋白表达(Smartpool,热科学公司(Thermo Scientific);靶序列:AGACAGACCCCAAACGUAA(SEQ ID No.15),GAAAAUGGCUUGUCGAAUU(SEQ ID No.16);AGGGAAACAUCUAUAACGA(SEQ ID No.17):CCGCCAACAUCACGGUCAA(SEQ ID No.18)),并且Lipofectamine 2000用于如Lampugnani等,2010所述进行转导。
统计学分析
使用非参数威尔科克森符号秩检验来确定体内药物治疗后病灶负荷的统计学显著性。使用斯氏双尾未配对t-检验来确定体内和体外分析中的统计学显著性。显著水平设为p<0.05。
结果
在内皮细胞-特异性CCM3-敲除小鼠的内皮细胞中,体内增强β-联蛋白的转录活性。
通过CCM3-floxed/floxed小鼠与Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠的杂交14来生成本文所述的体内小鼠系统,针对他莫昔芬诱导的CRE重组酶内皮细胞特异性表达和CCM3基因重组。这些小鼠然后进一步与BAT-gal小鼠杂交15,其显示核β-半乳糖苷酶(b-gal)报告基因的β-联蛋白活化表达。如CCM2的之前报告6,这些具有产后诱导的CCM3基因的内皮特异性失活的小鼠(CCM3-ECKO)在脑和视网膜血管中呈现与患者中CCM血管病灶相当的显著畸形和出血。对此之前已就相同鼠模型6中的CCM2和不同鼠系统7中的CCM2和CCM3报告。由于CCM3ECKO小鼠在中枢神经系统中发生血管畸形,该模型提供了测试下述药物治疗的工具。该实验模型的详细内容参见方法和图15。
在此,与匹配的对照动物相比,核b-gal报告基因的β-联蛋白-依赖性转录在新生CCM3-ECKO的脑血管的内皮细胞中体内增加。如图1a和1b中的免疫染色所示,通过使用PECAM标记内皮细胞的随机视场计数的定量观察到来自野生型BAT-gal小鼠的对照脑内皮细胞的b-gal-阳性核(0.86±0.15阳性核/视场;总共600个评分的内皮核中7.2%阳性核)在CCM3-ECKO脑内皮细胞中显著增加4倍(5.0±1.7阳性核/视场;总共700个评分的内皮核中36%阳性核,p<0.05;t-检验)(dpn 9同窝鼠仔)。在这些CCM3-ECKO脑内皮细胞中,b-gal-阳性核分布在建立的海绵状和毛细血管扩张症中(血管病灶中67%b-gal-阳性内皮核)以及假-正常血管中(假性-正常化血管中15%b-gal-阳性内皮核)。
与来自对照野生型BAT-gal小鼠的那些相比,也在CCM3-ECKO小鼠的视网膜的内皮细胞中观察到b-gal表达(图1c)。
从CCM3-floxed/floxed小鼠的脑中分离的内皮细胞(图2a,WT,原代培养)与体外CCM3基因重组之后的那些(CCM3-敲除脑内皮细胞;参见方法)(图2a,KO,原代培养)比较,其显示核中的活性β-联蛋白(即,Ser37和Thr41上去磷酸16)。这种效果与粘着连接组织的强烈改变平行,其可被视作活性β-联蛋白(图2a)和VE-钙粘蛋白(图3c,载剂)从连接处重定位。对于VE-钙粘蛋白在体内从内皮连接处的类似解体,参见图4b,载剂。
由于对从脑新鲜分离的内皮细胞的供应及其在首次体外传代后非常有限的有丝分裂指数的限制,对其β-联蛋白核分布和信号转导的详细分析是不可能的。发明人因此建立了培养的内皮细胞系,其中CCM3在体外如上所述重组17(CCM3-敲除内皮细胞系)(参见方法)。在这些CCM3-敲除内皮细胞系中,发明人通过免疫荧光(图2b)和细胞分级分离(图2c)确认β-联蛋白的增强核定位。
另外,在Top/FopFlash报告试验中测量外源性荧光素酶基因的β-联蛋白和Tcf/Lef-依赖性转录。在这些CCM3-敲除内皮细胞系中,与对照野生型细胞相比,β-联蛋白的转录活性显著增加2.7倍(±0.2SD;p<0.01)(图16d)。此外,β-联蛋白转录活性的一些典型内皮靶标的表达在这些CCM3-敲除内皮细胞系中增加(即,轴蛋白2,Lef1,Ccnd118)并且受到编码显性阴性Tcf417的腺病毒载体的体外感染的抑制(图2d)。
发明人也分析了与内皮祖细胞表型19和内皮-间充质转化(EndMT)20,21的获得/维持都相关的基因的表达,因为已经显示β-联蛋白转录信号转导调节其他细胞类型中的分化和内皮-间充质转化(EMT)的过程22,23,24。另外,发现EndMT在内皮特异性CCM1敲除鼠模型中的血管病灶发展中起到关键作用(Maddaluno,L.等,Nature 498(7455):492,2013)。发现与对照细胞相比,Klf425,26,Ly6a27,28和S100a429,20,Id130,31,Cdh220,Acta220的转录在CCM3-敲除内皮细胞中显著增强(图2e,内皮细胞系和图3b,原代培养)。另外,这些增加取决于β-联蛋白转录活性,因为它们受到显性阴性Tcf417的抑制,如上所述(图2e)。这些基因的增强转录也对应于其增加的蛋白质表达(参见图17和19中载剂处理的CCM3-敲除,内皮细胞系,和图3c,原代内皮细胞系,及其在图5和图20中的载剂处理的CCM3-ECKO脑内皮细胞中的体内上调)。
因此,内皮细胞中CCM3表达的消除导致体内和体外β-联蛋白转录活性和靶基因表达增加。根据这些数据,发明人研究了体内抗-β-联蛋白试剂对这些CCM3-ECKO小鼠的脑血管病灶的影响。
舒林酸硫化物降低了来自CCM3-ECKO小鼠的内皮细胞中内皮祖细胞和EndMT标志物的表达和β-联蛋白转录活性。
然后,发明人在其实验模型中初步体外测试了一定范围的已经描述为影响β-联蛋白信号转导32并且最重要的是已经在临床中使用的试剂:舒林酸硫化物、舒林砜33,34、水飞蓟宾35、姜黄素36和白藜芦醇37,38。也包括盐霉素39,一种报道的Wnt受体信号转导的抑制剂,虽然其使用迄今为止局限于实验模型。
在这些中,舒林酸硫化物和舒林砜在CCM3-敲除内皮细胞系中抑制β-联蛋白转录活性的内源性靶标的表达(参见上述)上是最有效的(图16a)。另外,舒林酸硫化物降低了β-联蛋白转录活性,如Top/FopFlash报告试验所测量(图16d)。
因此,发明人进一步分析了舒林酸硫化物对CCM3无效表型的影响。在CCM3-敲除脑内皮细胞的原代培养物中,发明人发现舒林酸硫化物有效抑制内源性β-联蛋白靶基因的表达(图3a并且观察到显性阴性Tcf4的抑制,如上所述,图3b)。同样,舒林酸硫化物强烈抑制活性β-联蛋白的核定位,同时增加其在细胞-细胞连接处的浓度(图3c)。同样,VE-钙粘蛋白在这些细胞(图3c)和CCM3-敲除内皮细胞系(图16b)中也更多定位于细胞-细胞接触处。
一致地,通过免疫共沉淀和Western印迹分析,舒林酸硫化物在CCM3-敲除内皮细胞系中恢复了β-联蛋白和VE-钙粘蛋白之间减少的结合(减少35%±0.32SD,p<0.05)(图16c)。
除了抑制β-联蛋白靶基因的转录以外,舒林酸硫化物还抑制相应蛋白质在CCM3-敲除内皮细胞中的过表达(图3c,原代培养,和图17,内皮细胞系)。
然后在诱导CCM3-ECKO后的新生小鼠中体内研究舒林酸硫化物。发明人发现用舒林酸硫化物治疗也抑制了脑血管内皮细胞中核报告基因b-gal(图4a)和β-联蛋白靶基因(图5)的表达。VE-钙粘蛋白也似乎更好地体内定位于用舒林酸硫化物治疗的新生CCM3-ECKO小鼠的脑血管中的内皮细胞-细胞连接处(图4b)。
舒林酸硫化物降低了CCM3-ECKO小鼠中脑和视网膜中血管病灶的发展。
本发明研究的一个重要方面是舒林酸硫化物对β-联蛋白信号转导的抑制是否也可减少CCM3-ECKO鼠仔中的血管病灶。发明人发现,事实上,舒林酸硫化物治疗减少了血管病灶的平均数和尺寸。如图6a中的免疫染色和图6b中的定量所示,载剂处理的CCM3-ECKO鼠仔中每个脑的血管病灶的平均数(±SD)为166.8±22,舒林酸硫化物治疗的血管病灶为72.6±9(p<0.005;非参数威尔科克森符号秩检验),并且载剂处理的CCM3-ECKO鼠仔中桑葚状病灶的平均最大直径(±SD)为386±56mm而舒林酸硫化物的为244±38mm(p<0.05;t-检验)。舒林酸硫化物治疗并不显著降低单海绵状的最大直径。
舒林酸硫化物治疗还抑制CCM3-ECKO小鼠的视网膜中的血管畸形。在这些小鼠中,视网膜显示在血管网络周围特定浓缩的多内腔血管病灶。这类病灶从静脉发展,其扩大,虽然笔直(比较图6c和6e中WT和CCM3-ECKO的载剂和图15的静脉标记物内皮粘蛋白)。舒林酸硫化物部分校正了CCM3-ECKO小鼠中的这种异常血管网络(图6c和6d)。另外,在舒林酸硫化物之后抑制了表征这些CCM3-ECKO小鼠视网膜的静脉最内通道的放大(载剂-ECKO中89.5±7.1mm对比舒林酸硫化物-ECKO中35±7.8mm,WT和KO各自的14个视网膜的30次测量的平均±SD)(图6e和图18a和18b,舒林酸硫化物对CCM3-ECKO鼠仔的脑中静脉和血管直径的影响)。不同的是,动脉并没有显示出这种异常表型(图6c和6e)。
上述报告的数据强力表明舒林酸硫化物可能在CCM患者中有治疗活性。然而,已经报道这种药物抑制血小板中的环氧合酶,可能增加了出血的风险。因此,发明人测试了舒林砜,其没有抗-环氧合酶活性33并且对凝血响应没有影响。如舒林酸硫化物治疗后所观察到的那样,舒林砜也减少了培养的CCM3-敲除内皮细胞系中活性β-联蛋白的核积聚并恢复细胞-细胞连接(图19)。另外,舒林砜抑制了β-联蛋白靶基因的表达(参见,例如,图19中的Klf4和S100a4),如舒林酸硫化物那样(参见上文)。当在体内测试时,舒林砜将CCM3-ECKO小鼠的脑中的病灶数降低至与舒林酸硫化物相当的水平(未治疗对照中每个小鼠脑的平均病灶数(±SD)为153.5±28并且通过舒林砜治疗降低至68.6±10,p<0.01;非参数威尔科克森符号秩检验;图20a和20b)。另外,在体内,在CCM3-ECKO小鼠的脑血管内皮中,舒林砜抑制Klf4和S100a4的表达(图20c)。
也获得了表示舒林砜(依昔舒林)抑制CCM1-ECKO小鼠脑中海绵状病灶形成的类似结果。
CCM3-ECKO小鼠的脑海绵状血管瘤中视网膜细胞的β-联蛋白信号转导的活化动力学。
在原理试验,尤其是测试药物的抑制活性中,CCM3ECKO鼠模型是首选,因为其发展出最严重的也在患者中观察到的表型。
如图7所示,β-联蛋白信号转导早期在病灶中强化并且这种活化推动了TGF-β/BMP途径的活化,发明人已经报道该途径导致CCM表型的维持(Maddaluno等,2013)。
通过CCM3-floxed/floxed小鼠与Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠的杂交来生成使用的体内小鼠系统,以获得他莫昔芬诱导的CRE重组酶内皮细胞特异性表达和CCM3基因重组(CCM3-ECKO小鼠)。这些小鼠然后与BAT-gal报告小鼠(16)杂交,其显示β-联蛋白-活化的核β-半乳糖苷酶(β-gal)表达。
如图7a(上图)所示,发明人可观察到与匹配的对照相比,CCM3-ECKO小鼠中内皮细胞的核中明显更高的β-联蛋白转录信号。从诱导CCM3重组(1dpn时)后的早期阶段(3dpn)开始,可检测到这种差异。在CCM3-ECKO小鼠的脑切片中,可在假-正常血管和在任意尺寸的海绵状中发现具有β-半乳糖苷酶阳性核的内皮细胞(图8)。相反,在分离切片(图7a,下图)和β-gal的共染色(图7b)中,磷酸-Smad1(p-Smad1)染色并没有在3dpn鼠仔中的CCM3消除之后增强,但其在9dpn鼠仔中增强(图7c)。p-Smad3观察到类似的结果(未显示)。P-Smad1仅在中-大尺寸病灶中明显较高(9dpn鼠仔中最大直径≥50μm)(图8)。
这种结果强烈支持了药物靶向β-联蛋白信号转导抑制新病灶产生。从头产生的病灶的外观是患者中CCM的类似形式的特定特征。图4和图19中显示了使用舒林酸硫化物和舒林砜来抑制β-联蛋白信号转导使突变表型衰退的体外数据。
β-联蛋白信号转导与EndMT标志物之间相关性分析CCM3-ECKO小鼠的脑海绵状血管瘤的内皮细胞中两种过程的体内动力学
干细胞/EndMT标志物(Klf4,Ly6a,S100a4和Id1)在3dpn CCM3-ECKO鼠仔中高表达(图9a-d和e,单阳性)并且在具有β-gal阳性核的内皮细胞中浓缩(图9e,共定位)。在9dpn时,CCM3-ECKO鼠仔内皮细胞中的β-gal表达降低,同时干细胞/EndMT标志物仍然很高(图9e)。β-联蛋白在建立的病灶中的作用目前受到关注,如之前段落中所述。
活化的β-联蛋白驱动的转录的经典靶标,轴蛋白2,事实上在融除除CCM3以外的CCM1和CCM2基因之后的培养中的内皮细胞中强化(图10),EndMT标志物也是这样。
详细分析培养中的CCM1KO内皮细胞,发明人观察到活性β-联蛋白的核定位(在Ser37和Thr41上去磷酸,并且逃避蛋白体降解,图11a),如CCM3-KO内皮细胞中已经报道的那样(图2)。另外,这种核β-联蛋白有转录活性,如在Top/FopFlash报告试验中所测量的外源性荧光素酶的2倍增加的表达所示(对β-联蛋白/Tcf/Lef-转录活化的测量,图11b)。最重要的是,使用舒林砜(依昔舒林)对β-联蛋白信号转导的抑制抑制了培养的CCM1 KO内皮细胞中EndMT标志物的表达(图11c)。这些数据支持了任何CCM基因的突变诱导与获得去分化表型相关的β-联蛋白信号转导(表达EndMT标志物,图11)。
另外,舒林砜(依昔舒林)诱导培养中的CCM1 KO内皮细胞中内皮细胞-细胞接触处的重组织,如图3中的CCM3 KO内皮细胞所报告的那样。在CCM2 KO模型中也获得类似结果。
响应内皮细胞中CCM融除活化β-联蛋白信号转导的机制。
CCM3-敲除内皮细胞中β-联蛋白介导的转录的活化是细胞自主的,因为:a)其在没有外源性Wnt的情况下观察到;b)抑制配体产生的porcupine抑制剂IWP2和IWP12(26,27),以及Dkk1(一种配体-受体相互作用抑制剂,其是Wnt共受体Lrp5/6的竞争物)(26,27)没有抑制一般β-联蛋白的转录(图12a-d);c)Lrp6磷酸化没有增加(图12e和f);d)外源性Wnt3a的刺激没有诱导干细胞/EndMT标志物的表达,而β-联蛋白的组成型活性形式Lef-ΔβCTA(28)却诱导表达(图12g和h)。
总之,这些数据表示在CCM3-敲除内皮细胞中,增强的β-联蛋白的转录活性和核定位并不依赖于经典配体-受体相互作用。
发明人之前报道了从内皮连接拆散或沉默VE-钙粘蛋白可上调β-联蛋白信号转导(18)。一致地,发明人在此观察到通过siRNA沉默VE-钙粘蛋白除了一般β-联蛋白靶标(轴蛋白2,Ccnd1和Nkd1,图12i)以外,激活了EndMT标志物(S100a4和Id1)的表达,并且促进了活性β-联蛋白的核定位(图13)。相反,VE-钙粘蛋白没有增强Smad1的磷酸化(图13b)。
这些数据表明,在CCM中,β-联蛋白信号转导的第一触发是VE-钙粘蛋白连接的拆散,其进而导致β-联蛋白释放到胞质中和核易位。这种过程推进并可能导致了病灶发展的TGF-β/BMP信号转导的活化。
有趣的是,内皮细胞中细胞-细胞连接的拆散代表了由任意CCM基因,如CCM1-ECKO,CCM2-ECKO和CCM3-ECKO报道的融除诱导的脑海绵状血管瘤的共同特征(图14)。发明人之前报道了CCM1患者的脑海绵状血管瘤中VE-钙粘蛋白的解体(Lampugnani等,2010)。因此,连接的VE-钙粘蛋白的解体似乎是鼠模型和患者中血管海绵状畸形的内皮细胞系的典型特征。这可能在患者中也伴随着β-联蛋白与VE-钙粘蛋白的解离和增强的核易位以及增加的β-联蛋白驱动的转录,如实验鼠模型中的上述报道。由于检测人样品中这种活化的标志物中的技术限制,目前直接证明患者中脑海绵状血管瘤中β-联蛋白信号转导的活化非常难。总之,这些结果支持了抗-β-联蛋白化合物在治疗以血管畸形为特征的病理学中的用途,尤其是在CCM患者中。
在此,发明人报道对CCM3基因的内皮细胞选择性删除激活了脑内皮细胞中的体内β-联蛋白转录信号转导。用NSAID舒林酸硫化物和舒林砜对β-联蛋白转录活性的药物抑制降低了这种鼠模型中脑和视网膜血管畸形的数量和尺寸,表明内皮细胞中的β-联蛋白转录信号转导导致CCM3-介导的血管病灶的病变。
CCM畸形在患者和小鼠模型中的脑神经系统中大幅发展,虽然不是排他性的6,8。与CCM病变中内皮中下调的β-联蛋白信号转导的重要作用一致,经典Wnt途径是血脑屏障中内皮细胞表型说明的良好决定因素11-13。然而,必需在产后消除Wnt信号转导以避免中枢神经系统中的异常血管增殖和形态发生11-13。在内皮特异性β-联蛋白功能获得的鼠模型中,发明人观察到与在本文中CCM3-ECKO中观察到的相当的视网膜血管病灶40。在肿瘤细胞中,经典Wnt信号转导的持续诱导与增加的生长和入侵相关18,24。具体地,在β-联蛋白介导的转录活化后,癌细胞从内皮切换到间充质表型(EMT)18,24。发明人在此报道CCM3-敲除内皮细胞经过类似的表型变化,并且上调一系列的EMT/EndMT经典基因20。因此,合理的假设是,CCM病灶来自失控的动力学和β-联蛋白信号转导在脑血管的内皮细胞中的定位。
最近已经报道在视网膜和脑内皮细胞中,由Norrin/Frizzled4活化经典Wnt途径通过细胞自主和细胞非自主信号转导诱导了发育和维持程序41。这可解释中枢神经系统的不同区域中的局部血管表型41。CCM中下调的β-联蛋白信号转导可得到Wnt/β-联蛋白途径的内皮-自主活化或突变的内皮细胞对环境Wnt的异常响应,或通过两者的组合的支持。发明人的数据表明,这些机制中的至少一种似乎在融除CCM3基因后在培养中的内皮细胞中运行。事实上,一些β-联蛋白靶标和祖细胞/EndMT标志物在CCM3-敲除内皮细胞中在基础条件下通过β-联蛋白转录信号转导活化,因为它们的表达受到显性-阴性Tcf4的抑制。Glading和Ginsberg10报道了在使用RNA干扰消耗CCM1之后培养的牛主动脉内皮细胞和原代人动脉内皮细胞中β-联蛋白转录活性的类似活化。他们也报道了对体内和体外内皮细胞中CCM1的β-联蛋白信号转导的抑制。另外,他们报道了在ApcMin/+小鼠中β-联蛋白驱动的肠腺瘤的基因表型在CCM1+/-背景中加重。这暗示了CCM1和可能的CCM3在其他细胞以及内皮细胞中的β-联蛋白信号转导一般调节作用。由于在家族CCM患者中出现肠和其他瘤似乎没有增加,CCM病变的血管和器官定位特异性表明器官中的内皮分化和/或局部因素与Wnt/β-联蛋白共同作用来表达突变的表型42。具体地,就对CCM3所知,在神经细胞中该基因的突变活化了星形细胞并且产生了模拟该病变的血管病灶9。因此,强化了神经血管单元内细胞交互的重要性。
虽然,活性β-联蛋白的核积聚似乎是突变基因型的显著特征,发明人没有直接显示驱动β-联蛋白在CCM3-敲除内皮细胞的核中浓缩的过程。一般而言,调节β-联蛋白的核积聚的分子机制问题仍然位置(综述参见18)。然而,与在核中浓缩增加的同时,发明人在发明人的CCM内皮细胞特异性删除的体外和体内模型中都观察到β-联蛋白从细胞-细胞连接处解离。连接性β-联蛋白大部分与VE-钙粘蛋白(粘着连接的跨膜组分43)以及β-联蛋白破坏复合物44结合。在CCM3-敲除内皮细胞中,粘着连接解体,如融除CCM145,46和CCM26之后所观察到的那样。另外,本文中减少了与VE-钙粘蛋白结合的β-联蛋白如融除CCM110后观察到的那样。推测这种减少的β-联蛋白与VE-钙粘蛋白的结合伴随核中活性β-联蛋白的积聚。活性β-联蛋白在核中的浓缩表征以下情况:在内皮细胞连接稳定性降低,如在稀疏内皮细胞和VE-钙粘蛋白-敲除内皮细胞17中观察到的那样。在这两种情况中,β-联蛋白的总量降低,甚至降至非常低的水平,虽然残留的β-联蛋白在核中积聚。用活性β-联蛋白在核中“被动”重分布来抑制蛋白体降解似乎不太可能,因为活性β-联蛋白的总量实际上降低了。
特别感兴趣的是,发明人已经鉴定到了β-联蛋白转录信号转导的2种抑制剂,舒林酸硫化物和舒林砜,其也抑制CCM3-ECKO小鼠中血管病灶的发展。这些试剂都是NSAID的,其对人患者结肠癌有显著化学预防功效,并且他们正在其他类型癌症的实验模型中评价47-52。对于治疗特征为血管畸形如CCM的病变而言,舒林砜比舒林酸硫化物有更多潜在兴趣,因为其缺少抗血小板活性。舒林酸硫化物对比舒林砜的相对功效根据癌症类型变化33,53-56。因此,用特定药物工具靶向内皮细胞中的β-联蛋白信号转导代表了减少血管畸形和预防新血管病灶出现的有效策略,尤其是在CCM患者中。
参考文献
1.Clatterbuck,R.E.,等Journal of neurology,neurosurgery,and psychiatry71,188-192(2001).
2.Wong,J.H.,等,Neurosurgery 46,1454-1459(2000).
3.Rigamonti,D.,等The New England journal of medicine 319,343-347(1988).
4.Li,D.Y.和Whitehead,K.J.Stroke 41,S92-94(2010).
5.Plummer,N.W.,等,Current neurology and neuroscience reports 5,391-396(2005).
6.Boulday,G.,等The Journal of experimental medicine 208,1835-1847(2011).
7.Chan,A.C.,等J Clin Invest 121,1871-1881(2011).
8.He,Y.,等Science signaling 3,ra26(2010).
9.Louvi,A.,等Proc Natl Acad Sci U S A 108,3737-3742(2011).
10.Glading,A.J.和Ginsberg,M.H.Disease models&mechanisms 3,73-83(2010).
11.Stenman,J.M.,等Science 322,1247-1250(2008).
12.Daneman,R.,等Proc Natl Acad Sci U S A 106,641-646(2009).
13.Liebner,S.,等The Joumal ofcell biology 183,409-417(2008).
14.Wang,Y.,等Nature 465,483-486(2010).
15.Maretto,S.,等Proc Natl Acad Sci U S A 100,3299-3304(2003).
16.van Noort,M.,Meeldijk,J.,van der Zee,R.,Destree,O.和Clevers,H.JBiol Chem 277,17901-17905(2002).
17.Taddei,A.,等Nature cell biology 10,923-934(2008).
18.Clevers,H.和Nusse,R.Cell 149,1192-1205(2012).
19.Fadini,G.P.,Losordo,D.和Dimmeler,S.Circ Res 110,624-637(2012).
20.Medici,D.和Kalluri,Semin Cancer Biol22,379-384(2012).
21.Kovacic,J.C.,等,Circulation 125,1795-1808(2012).
22.Sanchez-Tillo,E.,等Proc Natl Acad Sci U S A 108,19204-19209(2011).
23.Li,J.和Zhou,B.P.BMC Cancer 11,49(2011).
24.Holland,J.D.,等,Curr Opin Cell Biol(2013).
25.Li,X.,等Microvasc Res 84,270-277(2012).
26.Margariti,A.,等Proc Natl Acad Sci USA 109,13793-13798(2012).
27.van Solingen,C.,等Cardiovasc Res 92,449-455(2011).
28.Liang,S.X.,等J Thromb Haemost 9,1628-1637(2011).
29.Stein,U.,等Gastroenterology 131,1486-1500(2006).
30.James,D.,等Nat Biotechnol28,161-166(2010).
31.Tobin,N.P.,等,BMC Cancer 11,417(2011).
32.Kundu,J.K.,等,Biochimica et biophysica acta 1765,14-24(2006).
33.Thompson,H.J.,等Cancer research 57,267-271(1997).
34.Boon,E.M.,等British journal of cancer 90,224-229(2004).
35.Rajamanickam,S.,等,Pharmaceutical research 26,2558-2567(2009).
36.Prasad,C.P.,等,Chemico-biological interactions 181,263-271(2009).
37.Hope,C.,等Molecular nutrition&food research 52增刊1,S52-61(2008).
38.Teiten,M.H.,等,Current pharmaceutical biotechnology 13,245-254(2012).
39.Lu,D.,等Proc Natl Acad Sci U S A 108,13253-13257(2011).
40.Corada,M.,等Dev Cell 18,938-949(2010).
41.Wang,Y.,等Cell 151,1332-1344(2012).
42.Wray,J.和Hartmann,C.Trends Cell Biol22,159-168(2012).
43.Lampugnani,M.G.,等The Journal of cell biology 118,1511-1522(1992).
44.Maher,M.T.,等,The Journal of cell biology 186,219-228(2009).
45.Glading,A.,等,The Journal of cell biology 179,247-254(2007).
46.Lampugnani,M.G.,等Journal of cell science 123,1073-1080(2010).
47.Meyskens,F.L.,Jr.,等Cancer prevention research 1,32-38(2008).
48.Huang,L.,等Cancer research 71,7617-7627(2011).
49.Takayama,T.,等Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association fbr Cancer Research 17,3803-3811(2011).
50.Steinert,G.,等PloS one 6,e22540(2011).
51.Giardiello,F.M.,等The New England journal of medicine 328,1313-1316(1993).
52.Smalley,W.,等,Archives of internal medicine 159,161-166(1999).
53.Chang,W.C.,等Annals of the New York Academy of Sciences 1059,41-55(2005).
54.Piazza,G.A.,等Cancer research 57,2909-2915(1997).
55.Mahmoud,N.N.,等Carcinogenesis 19,87-91(1998).
56.Beazer-Barclay,Y.,等Carcinogenesis 17,1757-1760(1996).
57.Mackenzie,G.G.,等Cancer prevention research 4,1052-1060(2011).
58.Srinivas,S.,等BMC developmental biology 1,4(2001).
59.Cattelino,A.,等The Journal of cell biology 162,1111-1122(2003).
60.Balconi,G.,Spagnuolo,R.和Dejana,E.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascular biology 20,1443-1451(2000).
61.Lluis,F.,等Cell Stem Cell 3,493-507(2008).
62.Zhang,N.,等Cancer Cell 20,427-442(2011).
63.McDonald,D.A.,等Stroke 43,571-574(2012).
Maddaluno L,等Nature 498,492-496(2013).
Vleminckx K,等Mechanisms of development 81:65-74(1999).
Kundu JK等Biochimica et Biophysica Acta 1765(2006):14-24.
Anastas和Moon,2013,Nature Rev-Cancer,13,11-26;
Rosenbluh等,2014,Trends Pharmac.Sci 35,103-109;
Takahashi-Yanaga和Kahn,2010,Clin Cancer Res 16,3153-3162.
McDonald DA等Stroke 43,571-574.2012.
Dodge,Annu Rev Pharmacol Toxicol.2011;51:289-310.
Chen,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2010年8月;299(2):G293-300.Barker Nat Rev Drug Discov.2006年12月;5(12):997-1014.
Chen等Nat Chem Biol2009;5(2):100-107.
Dodge等J Biol Chem 2012;287(27):23246
Wang等J Med Chem 2013年3月28日;56(6):2700-4.
Proffitt等Cancer Res 2013年1月15日;73(2):502-7
Morrell等PLoS One 2008年8月13日;3(8):e2930.
Cruciat等Science 2010年1月22日;327(5964):459-63.
Huang等Nature 2009年10月1日;461(7264):614-20.
Thorne等Nat Chem Biol2010年11月;6(11):829-36.
Shan等Biochemistry2005年11月29日;44(47):15495-503.
Park等Biochem Biophys Res Commun 2005年3月4日;328(1):227-34.
Emami等PNAS 2004年8月24日;101(34):12682-7.
Lepourcelet等Cancer Cell 2004年1月;5(1):91-102.
Gurney等,Proc Natl Acad Sci USA.2012年7月17日;109(29):11717-22
Medici D等Nature Medicine 16:1400,2010
Medici D和Kalluri R Semin Cancer Biol22:379,2012
Hwang等,2013,Int J.Oncol43,261-270
Matsubayashi等MolCell Biol2004年3月;24(5):2012-24.
Cong等MolCell Biol2004年3月;24(5):2000-11.
Lu等Cell 2004年10月1日;119(1):97-108.
Cadigan等Cell 1998年5月29日;93(5):767-777.
Glinka等Nature 1998年1月22日;391(6665):357-62.
Wallingford等Nature 2000年5月4日;405(6782):81-5.
Zeng等Cell 1997年7月11日;90(1):181-92.
Itoh等Curr Biol 1998年5月7日;8(10):591-4.
Willert等Development 1999年9月;126(18):4165-73.
He等Nature 1995年4月13日;374(6523):617-22
Molenaar等Cell 1996年8月9日;86(3):391-9.
Trosset等Proteins:structure,function and bioninformatics 64(1):60-67,2006
Barker等Nature Reviews Drug Discovery5:997-1014(2006).
Schuierer等World J Gastroenterol12(10):1529-1535(2006).
Nakamura等Genes Cells 3:395-403(1998).
Yao等Oncogene 24:1607-1614(2005).
Tago等Genes Dev.14:1741-1749(2000).
Green等J Surg.Res.101(1):16-20(2001)
Veeramachaneni等J.Thoracic Cardiovasc.Surg.127(1):92-98(2004).
Verma等Clin.Cancer Res.9(4):1291-300(2003)
Gadue等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(45):16806-16811
Corada M等Nature Comm 4:2609,2013
Ridder等J Exp Med 208(13):2615,2011
Whitt等,2012,Cancer Prev.Res.5,822-833
Davis等,2010,Nature 464,1067-1071
Dashi等,2012Adv Mater 24,3864-3869
Cheng等,2013,Int J.of Oncology 43,895-902
Fadini等,2012,Circ Res.110,624-637
Margariti A,等,2012,PNAS 109,13793-13798
Li等2012Microvascular Res.84,270-277
Liang等,2011Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 9,1628-1637
Stein等2006Gastroenterology,131,1486-1500
Medici D和Kalluri R,2012Seminars in cancer biology 22,379-384
Tinsley等,2011Cancer Prev Res 4,1275-1284
Thompson等,2000Cancer Res 60,3338-3342
Liu等,2001J Pharm Exp Ther 299,583-592
序列表
<110> 意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所(IFOM)(IFOM - FondazioneIstituto FIRC di Oncologia)
米兰大学(Universit?degli Studi di Milano)
<120> 用于治疗血管畸形的方法和组合物
<130> PCT 126319
<150> EP14164118.3
<151> 2014-04-10
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<220>
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gacaagaaag cactgttgac c 21
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gataggaatt attactgccc ttcc 24
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cggtgatggt gctgcgttgg a 21
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ggagcgggag aaatggatat g 21
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aaagtcgctc tgagttgtta t 21
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<212> RNA
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<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<400> 19
Leu Xaa Xaa Leu Leu
1 5
Claims (27)
1.一种用于治疗和/或预防以血管畸形为特征的病变的Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂。
2.如权利要求1所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂是β-联蛋白抑制剂,尤其是β-联蛋白转录信号转导抑制剂和/或β-联蛋白核易位抑制剂。
3.如权利要求1或3所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂是小分子抑制剂。
4.如权利要求3所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂是非甾族抗炎药(NSAID)。
5.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂选自下组:槲皮素、ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、N′-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、N′-[(E)-1-(5-甲基-2-噻吩基)亚乙基]-2-苯氧基乙酰肼、5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-2-(2-噻吩基)-1H-吲哚、2-(2-呋喃基)-5-[(E)-2-(5-甲基-2-呋喃基)乙烯基]-1H-吲哚、N-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]-4-(4-吡啶基)-8-喹啉-胺、2-(2-呋喃基)-5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-1H-吲哚、7-{(2E)-2-[(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]肼基}-N-(2-苯基乙基)-5,6-二氢苯并[h]异喹啉-9-羧酰胺、1-{[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]氨基}-3-(4-吡啶基)-2,4-(1H,3H)-喹唑啉二酮、N-(5-甲基-2-呋喃基)-N-(2′-苯氧基[1,1′-二苯基]-3-基)胺、4-{[7-(5-甲基-2-呋喃基)-2-萘基]氧基}吡啶、N-(5-溴-1,3,4-噁二唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、4-羟基-N-(5-甲基-2-呋喃基)-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、3-[(E)-2-(5-溴-1,3,4-噻二唑-2-基)乙烯基]-4-羟基-6-苯基-2H-吡喃-2-酮、N-(5-溴-1,3,4噻二唑-2-基)-4-羟基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、5-[(3-氨基-1H-1,2,4-三唑-5-基)甲基]-3-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-1,3-噁唑烷-2-酮、4-[(3-氨基-1H-1,2,4-三唑-5-基)甲基]-1-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-2-咪唑烷酮、1-二苯甲基-4-(5-溴-2-糠酰)哌嗪、1-二苯甲基-4-[(5-甲基-2-噻吩基)羰基]哌嗪、(2E)-2-[1-(4-甲基-2-噻吩基)亚乙基]肼羧酸苄酯、2-(4-氯苯基)-6-甲基-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)[1,3]噻唑并[3,2-b][1,2,4]三唑、N-(5-甲基-3-异噁唑基)-N′-[(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)羰基]脲、N-[3-(2-{[(5-氯-2-噻吩基)甲基]磺酰基}肼基)-3-氧代丙基]苯磺酰胺-5-[3-(4-苯氧基苯基)丙基]-1,3,4-噁二唑-2-醇、N-(3-甲基-5-异噁唑基)-4-苯氧基苯甲酰胺、4-羟基-N-(3-甲基-5-异噁唑基)-2-氧代-6-苯氧基-2H-吡喃-3-羧酰胺、2-苯氧基-N′-[(Z)-苯基(2-噻吩基)亚甲基]苯甲酰肼、2-苯胺基-N′-[(Z)-2-呋喃基(苯基)亚甲基]苯甲酰肼、4-[(Z)-1-(3-甲基-5-异噁唑基)-2-苯基乙烯基]苯基2-(1-吡咯烷基)乙基醚、5-甲基-2-糠醛[(3Z)-2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]腙、(2Z)-N-[(5-甲基-2-呋喃基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]乙酰胺、(2Z)-N-[(3-甲基-5-异噁唑基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1,2-二氢-3H-二氢亚吲哚-3-基]乙酰胺、(2-氯-1,3-噻唑-5-基)甲基4-(4-吗啉基磺酰基)苯基醚、N-(4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-(4-苯氧基丁基)甲磺酰胺、N-(6-甲氧基-4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-[2-(1-甲基-3-苯基丙氧基)乙基]乙酰胺、4-{2-[(5-甲基-2-呋喃基)甲氧基]亚苄基}-1-(4-吡啶基磺酰基)哌啶、4-{2-[(5-溴-2-呋喃基)甲氧基]亚苄基}-1-异烟碱基哌啶、N-(4,5-二氢萘并[1,2-d][1,3]噻唑-2-基)-N-(4-苯基戊基)乙酰胺、N-(4,5-二氢-3H-萘并[1,2-d]咪唑-2-基)-N-[2-(2-苯基乙氧基)乙基]甲磺酰胺、N′-[(Z)-(5-甲基-2-呋喃基)(2-吡啶基)亚甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜及其药学上可接受的盐,羟基罗汉松树脂素、六氯酚、PPARγ激动剂,或PPARγ-无活性类似物、水飞蓟宾、奶蓟草提取物(Cardio Mariano)、EGCG(表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)、白茶/绿茶、萝卜硫素、白藜芦醇、姜黄素、吲哚-3-甲醇、乌索酸、二十二碳六烯酸、染料木黄酮、β-拉帕醌、盐霉素和表I所列化合物。
6.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂是舒林砜或舒林酸硫化物或舒林酸或其类似物或衍生物。
7.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂选自下组:水飞蓟宾、盐霉素、EGCG(表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)、白茶/绿茶、萝卜硫素、白藜芦醇、姜黄素、吲哚-3-甲醇、乌索酸、二十二碳六烯酸、染料木黄酮和β-拉帕醌。
8.如权利要求1所述的抑制剂,其特征在于,所述Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂是蛋白质或肽。
9.如权利要求8所述的抑制剂,其特征在于,所述蛋白质或肽直接给予或通过给予的表达系统表达。
10.如权利要求8或9所述的抑制剂,其特征在于,所述蛋白质或肽是Chibby、轴蛋白、HDPR1、ICAT,或包含LXXLL肽的融合蛋白、针对卷曲蛋白的抗体如OMP-18R5。
11.如权利要求1所述的抑制剂,其特征在于,所述Wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂是反义核酸分子。
12.如权利要求11所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂是全长反义β-联蛋白构建体、β-联蛋白siRNA,或β-联蛋白shRNA。
13.如权利要求11-12所述的抑制剂,其特征在于,由适于给予对象的重组表达系统表达所述抑制剂。
14.如权利要求13所述的抑制剂,其特征在于,所述重组表达系统包含内皮或大脑内皮特异性启动子元件,并且任选地包含诱导物/抑制物元件。
15.如权利要求14所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂是选自Chibby、轴蛋白、HDPR1、ICAT,和包含LXXLL肽的融合蛋白的蛋白质或肽,或选自全长反义β-联蛋白构建体、β-联蛋白siRNA或β-联蛋白shRNA的反义核酸分子。
16.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述抑制剂包封在纳米颗粒中,优选所述纳米颗粒经工程改造以靶向病理性内皮细胞。
17.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述血管畸形与内皮-间充质转化相关联。
18.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述血管畸形位于中枢神经系统中和/或视网膜血管中。
19.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述病变选自下组:骨化进行性纤维发育不良、心脏纤维化、肾纤维化、肺纤维化和脑海绵状畸形。
20.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述病变是脑海绵状畸形。
21.如权利要求20所述的抑制剂,其特征在于,所述脑海绵状畸形是由选自下组的基因中的至少一种中的功能丧失突变所导致:CCM1(KRIT1)、CCM2(OSM)或CCM3(PDCD10)。
22.如权利要求20或21中任一项所述的抑制剂,其特征在于,所述脑海绵状畸形是偶发性的或家族性的。
23.一种用于治疗和/或预防以血管畸形为特征的病变的药物组合物,所述药物组合物包含有效量的权利要求1-16中任一项所述的抑制剂中的至少一种和药学上可接受的载剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物,其还包含有效量的至少一种其他治疗剂。
25.如权利要求24所述的药物组合物,其特征在于,所述其他治疗剂选自下组:抗氧化剂、TGF-β信号转导抑制剂、BMP信号转导通路抑制剂、VEGF信号转导通路抑制剂、Yap信号转导通路抑制剂、他汀,和RhoA GTP酶水平或活性的其他抑制剂。
26.如权利要求23-25所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的载剂是纳米颗粒,优选地,所述纳米颗粒经工程改造以靶向病理性内皮细胞。
27.一种治疗和/或预防以血管畸形为特征的病变的方法,其包括给予有此需要的对象有效量的wnt/β-联蛋白信号转导抑制剂。
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---|---|---|---|
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EP14164118 | 2014-04-10 | ||
PCT/EP2015/057854 WO2015155335A1 (en) | 2014-04-10 | 2015-04-10 | Methods and compositions for the treatment of vascular malformation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106535937A true CN106535937A (zh) | 2017-03-22 |
Family
ID=50478259
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
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Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017136515A1 (en) * | 2016-02-02 | 2017-08-10 | Cardelli James Allen | Chemicals and methods to prevent and treat tgf-beta mediated activation of fibroblasts to reduce and treat cancer and fibrosis |
JP2017214322A (ja) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | 森永製菓株式会社 | Gapdh遺伝子発現増強剤及びgapdh遺伝子発現増強用食品組成物 |
EP3703754A1 (en) * | 2017-10-31 | 2020-09-09 | Université de Bourgogne | Therapeutical compositions for use in the treatment of non- malignant conditions associated with phosphatidylinositol-3- kinase activation: overgrowth spectrum, cutaneous capillary malformations and seborrheic keratoses |
CN112980879B (zh) * | 2021-02-23 | 2023-01-24 | 四川省人民医院 | 一种视网膜血管病变模型的构建方法及其应用 |
CN114107386B (zh) * | 2021-11-29 | 2024-02-02 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种制备血脑屏障缺陷的小鼠模型的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6620853B1 (en) * | 1998-12-08 | 2003-09-16 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for prevention and treatment of restenosis with non-steroidal anti-inflammatory drugs |
US6677116B1 (en) * | 1999-04-21 | 2004-01-13 | Adherex Technologies, Inc. | Methods for treating cancer by modulating β-catenin mediated gene expression |
CN1468104A (zh) * | 2000-08-08 | 2004-01-14 | ����ŵ÷�¹�˾ | 嘌呤活性和ains活性的结合在制备抗血栓或抗炎药中的应用 |
WO2011127164A2 (en) * | 2010-04-08 | 2011-10-13 | Fate Therapeutics, Inc. | Pharmaceutical compositions to treat fibrosis |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6231888B1 (en) * | 1996-01-18 | 2001-05-15 | Perio Products Ltd. | Local delivery of non steroidal anti inflammatory drugs (NSAIDS) to the colon as a treatment for colonic polyps |
ES2253787T3 (es) * | 1996-11-05 | 2006-06-01 | The Children's Medical Center Corporation | Composiciones para inhibicion de la angiogenesis que comprenden talidomida y un nsaid. |
WO2009148709A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-12-10 | University Of Utah Research Foundation | Pharmacological targeting of vascular malformations |
US20110171193A1 (en) * | 2008-06-12 | 2011-07-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Compositions and methods for treating pulmonary hypertension |
WO2010033581A1 (en) * | 2008-09-16 | 2010-03-25 | University Of Washington | Molecular modulators of the wnt/beta-catenin pathway |
BR112013024525A2 (pt) | 2011-04-01 | 2017-04-18 | Southern Res Inst | compostos, composição farmacêutica e métodos para tratar condição pré-cancerosa ou câncer em mamífero, pacientes com doença inflamatória crônica ou doença neurodegenerativa e para preparar compostos e usos de compostos e de composição farmacêutica |
-
2015
- 2015-04-09 MA MA040687A patent/MA40687A/fr unknown
- 2015-04-10 KR KR1020167031538A patent/KR20160144459A/ko not_active Application Discontinuation
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6620853B1 (en) * | 1998-12-08 | 2003-09-16 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for prevention and treatment of restenosis with non-steroidal anti-inflammatory drugs |
US6677116B1 (en) * | 1999-04-21 | 2004-01-13 | Adherex Technologies, Inc. | Methods for treating cancer by modulating β-catenin mediated gene expression |
CN1468104A (zh) * | 2000-08-08 | 2004-01-14 | ����ŵ÷�¹�˾ | 嘌呤活性和ains活性的结合在制备抗血栓或抗炎药中的应用 |
WO2011127164A2 (en) * | 2010-04-08 | 2011-10-13 | Fate Therapeutics, Inc. | Pharmaceutical compositions to treat fibrosis |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
DOUGLAS W.等: "b-Catenin Antisense Treatment Decreases b-Catenin Expression and Tumor Growth Rate in Colon Carcinoma Xenografts", 《JOURNAL OF SURGICAL RESEARCH》 * |
LEE HJ,等: "Sulindac Inhibits Canonical Wnt Signaling by Blocking the PDZ Domain of Dishevelled", 《ANGEW CHEM INT ED ENGL》 * |
MARION M SCHUIERER,等: "Reduced expression of β-catenin inhibitor Chibby in colon carcinoma cell lines", 《WORLD J GASTROENTEROL》 * |
UDIT N. VERMA,等: "Small Interfering RNAs Directed against β-Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 * |
WENQING LIANG,等: "Effects of short-hairpin RNA-inhibited b-catenin expression on the growth of human multiple myeloma cells in vitro and in vivo", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
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