CN106526200A - 一种机体癌症倾向的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种机体癌症倾向的检测方法,通过如下步骤实现:检测机体8‑羟基脱氧鸟苷水平;检测机体丙二醛水平;检测机体高敏感C反应蛋白水平;检测机体线粒体伤害水平;检测机体细胞凋亡状况;检测机体上皮间质转化情况;本发明所筛选的指标,涵盖了全部癌前病变的可能指标,所以,能够全面防控癌症;现代医学对于上述指标已经有充分研究,包括人体正常值以及各种检测方法,所以进行组合性检测就非常方便,成本低廉,可靠性高。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测方法技术领域,具体地说是一种机体癌症倾向的检测方法。
背景技术
癌症早期检测一直是医界希望解决的难题。现有技术是利用各种造影技术和生化指标检测力求实现癌症的早期发现。造影技术包括超声波、CT、PET-CT等,生化指标则包括AFP,CEA等癌症特异性指标检测。
造影技术,就是通过癌变过程导致的组织病理改变特点,将癌变显影可视化。现代比较先进的是加强型正电子放射造影PET-CT,PET-CT对于各种癌变能够及时发现,确诊。
各种癌变,都伴随机体特异性指标的改变,这也是利用生化指标检测癌症的基本原理,包括的指标有AFP,CA199,CEA,P53等很多,这在早期诊断癌症中发挥了重要作用。
现有癌症诊断技术无法提前检测患者是否有癌变的可能。只要确诊,就是机体已经完成癌变,宿主已经是癌症患者。虽然可以采取相应治疗措施实现治愈,但是成功率非常低。因为癌变完成后基本是无法逆转的。就造影技术来说,解决的只是如何看见癌细胞、癌组织的问题。而生化指标检测,有些是只有癌变完成才能检测发现,有些则有很大不确定性。比如P53,只有57%左右癌患有该基因突变,利用此指标就有巨大局限。其他如各种癌基因、抑癌基因检测,更是参考价值较低,对于癌症防控实际指导意义不大。
解决癌症问题,最根本的是提前到一个适当的机体病变发现期,在这个时期,机体病况可以逆转而不发展为癌变。
机体在癌变之前,都会经历炎症伤害期,且是慢性非可控性炎症。当非可控炎症长期迁延不愈,发病部位就会按照适应代偿机制进入细胞癌变状态。在这个过程中,机体从一般炎症,到慢性炎症,到炎症非可控变化,到发生上皮间质转化,到癌变,是一个逐步演变的过程。因此,在癌变实质性实现之前的各个阶段,都可以划定为癌前病变期。在这个时期进行有效消除炎症,恢复机体健康干预,就实现了癌症的有效预防。
发明内容
针对上述存在的癌症防控技术问题,本发明提供了一种机体癌症倾向的检测方法。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:
一种机体癌症倾向的检测方法,通过如下步骤实现:
1)检测机体8-羟基脱氧鸟苷水平,酶联免疫吸附法测定尿样8-羟基脱氧鸟苷,与人体正常参考值对照,判定个体DNA受到伤害情况,在判定个体8-羟基脱氧鸟苷水平偏高后,通过询问等调查方法,确定个体导致该偏差的原因,然后进行伤害因素消除工作;
2)检测机体丙二醛水平,人体血清丙二醛水平采用硫代巴比妥酸比色法测定,与人体正常参考值对照,对于严重偏高个体进行原因调查,有效干预;
3)检测机体高敏感C反应蛋白水平,采用胶乳增强的免疫比浊法进行高敏感C反应蛋白检测,与人体正常参考值对照,个体高敏感C反应蛋白偏高,而并没有浅表性、侵袭性、败血症的细菌性感染发生,就提示机体正在遭受某种原因的炎症性伤害,必须查明具体伤害因素,进行有效干预;
4)检测机体线粒体伤害水平,采用线粒体形态学变化检测方法,电镜观察线粒体形态变化,分光光度法和钙离子荧光探针FLUO-2/AM及荧光分光光度法测定线粒体肿胀及游离钙离子的含量,以及线粒体渗透性转换孔检测方法:有膜片钳技术法、活性物质标记法、分光光度法;
5)检测机体细胞凋亡状况,用磷脂酰丝氨酸外翻检测法或线粒体膜电位势能检测法,检测机体细胞凋亡情况,在凋亡水平还处于比较高的炎症状态时,进行有效消除炎症干预;
6)检测机体上皮间质转化情况,检测细胞黏附分子表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白确定细胞的间充质细胞特征,从而确定上皮间质转化的发生。
步骤(1)中所述8-羟基脱氧鸟苷水平正常人群男性水平为11.85±5.72ng/mg Gr,女性为16.24±10.83ng/mg Gr。
步骤(2)中所述丙二醛水平正常男性丙二醛含量在4.21±0.57nmol/ml,女性为3.99±0.47nmol/ml。
步骤(3)中所述高敏感C反应蛋白水平儿童和成人≤10mg/L;10-99mg/L提示局灶性或浅表性感染,≥100mg/L提示败血症或侵袭性感染的严重感染。
对人体进行以上指标检测,只要各指标在正常范围,机体就是健康不会癌变的。只要有一项或者多项超出正常范围,表示机体处于受伤害的炎症状态,必须进行积极干预,将指标恢复到正常水平。该以消除炎症为主的恢复过程,就是人体从亚健康恢复到健康的过程,也是阻断有可能发生的癌变的过程。
进行检测后,对于超标者,虽然肯定不是癌症患者(检测之前,排除癌变),检测数据可足够引起个人注意,从而检讨个人受到何种伤害。在专门指导下,可以轻松进行伤害阻断,隔离,然后定期进行复检,观察指标恢复情况。只要恢复正常,就彻底避免了癌症发生。如果没有恢复,就要进一步进行更有效干预,直到指标逆转。
本发明与现有技术比较具有以下有益效果:
(1)由于本发明所筛选的指标,涵盖了全部癌前病变的可能指标,所以,能够全面防控癌症。
(2)由于现代医学对于上述指标已经有充分研究,包括部分指标的人体正常值以及各种检测方法,所以进行组合性检测就非常方便,成本低廉,可靠性高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释发明,并不用于限定本发明。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1,一种机体癌症倾向的检测方法,通过如下步骤实现:
1)检测机体8-羟基脱氧鸟苷水平;
标本的采集及保存
a.尿液:收集清晨第一次尿液(中段尿),或24小时尿液,2000xg离心15分钟后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。
b.其它生物标本:1000xg离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温,试剂不能直接在37℃溶解;试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
a.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔,空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
b.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液工作液100μl,在使用前一小时内配制,酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
c.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干,也可轻拍将孔内液体拍干。
d.每孔加检测溶液工作液100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
e.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干,也可轻拍将孔内液体拍干。
f.依序每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
g.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
h.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值。在加终止液后立即进行检测。
2)检测机体丙二醛水平;
试剂盒的准备工作:
a.TBA储存液的配制:称取适量TBA,用TBA配制液配制成浓度为0.37%的TBA储存液,TBA配制液需完全溶解后再使用,可以加热到70℃以促进溶解。TBA储存液较难溶解,需加热到70℃,并通过剧烈Vortex以促进溶解。配制好的TBA储存液室温避光保存,至少3个月内有效。
b.丙二醛检测工作液的配制:根据待测定的样品数(含对照),参考下表在临检测前新鲜配制适量的丙二醛检测工作液
检测次数 1次 10次 20次 50次
TBA稀释液 150μl 1500μl 3000μl 7500μl
TBA储存液 50μl 500μl 1000μl 2500μl
抗氧化剂 3μl 30μl 60μl 150μl
c.标准品的稀释:取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM,用于后续制作标准曲线。
样品测定:
a.在离心管或其它适当容器内加入0.1ml匀浆液、裂解液或PBS适当溶液作为空白对照,加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线,加入0.1ml样品用于测定;随后加入0.2ml丙二醛检测工作液。
b.混匀后,使用带有热盖并可以加热0.5ml PCR管的PCR仪100℃或沸水浴加热15分钟。
c.水浴冷却至室温,1000g室温离心10分钟,取200微升上清加入到96孔板中,随后用酶标仪在532nm测定吸光度。如果不方便测定532nm的吸光度,也可以测定530-540nm之间的吸光度。可以设定450nm为参考波长进行双波长测定。
d.丙二醛含量的计算:对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度,对于细胞、或组织样品,计算出样品溶液中的MDA含量后,可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量,例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。
3)检测机体高敏感C反应蛋白水平;
操作步骤:
a、准备:从冰箱取出人C-反应蛋白定量检测试剂盒,室温复温平衡30分钟。
b、配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
c、加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。
d、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
e、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
f、加酶标工作液:每孔加入酶标工作液50μL,空白对照孔不加。
g、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
h、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
i、显色:每孔先加入显色剂A液50μL,再加入显色剂B液50μL,平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s),37℃避光显色15min。
j、终止:取出酶标板,每孔加终止液50μL,终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。
k、测定:以空白孔调零,在终止后15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。
l、计算:根据标准品的浓度及对应的OD值,计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样本的OD值,在回归方程上计算出对应的样品浓度,也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
4)检测机体线粒体伤害水平,采用线粒体形态学变化检测方法,电镜观察线粒体形态变化,分光光度法和钙离子荧光探针FLUO-2/AM及荧光分光光度法测定线粒体肿胀及游离钙离子的含量,线粒体渗透性转换孔检测方法:有膜片钳技术法、活性物质标记法、分光光度法;
5)检测机体细胞凋亡状况,用磷脂酰丝氨酸外翻检测法或线粒体膜电位势能检测法,检测机体细胞凋亡情况。
6)检测机体上皮间质转化情况,检测细胞黏附分子表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白确定细胞的间充质细胞特征,从而确定上皮间质转化的发生。
对人体进行以上指标检测,只要各指标在正常范围,机体就是健康不会癌变的,只要有一项或者多项超出正常范围,表示机体处于受伤害的炎症状态,必须进行积极干预,将指标恢复到正常水平。该以消除炎症为主的恢复过程,就是人体从亚健康恢复到健康的过程,也是阻断有可能发生的癌变的过程。
进行检测后,对于超标者,虽然肯定不是癌症患者(检测之前,排除癌变),检测数据足够引起个人注意,从而检讨个人受到何种伤害,在专门指导下,可以轻松进行伤害阻断,隔离,然后定期进行复检,观察指标恢复情况,只要恢复正常,就彻底避免了癌症发生,如果没有恢复,就要进一步进行更有效干预,直到指标逆转。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种机体癌症倾向的检测方法,其特征在于,通过如下步骤实现:
1)检测机体8-羟基脱氧鸟苷水平,酶联免疫吸附法测定尿样8-羟基脱氧鸟苷,与人体正常参考值对照,判定个体DNA受到伤害情况,在判定个体8-羟基脱氧鸟苷水平偏高后,要通过询问等调查方法,确定个体导致该偏差的原因,然后进行伤害因素消除工作;
2)检测机体丙二醛水平,人体血清丙二醛水平采用硫代巴比妥酸比色法测定,与人体正常参考值对照,对于严重偏高个体进行原因调查,有效干预;
3)检测机体高敏感C反应蛋白水平,采用胶乳增强的免疫比浊法进行高敏感C反应蛋白检测,与人体正常参考值对照,个体高敏感C反应蛋白偏高,而并没有浅表性、侵袭性、败血症的细菌性感染发生,就提示机体正在遭受某种原因的炎症性伤害,必须查明具体伤害因素,进行有效干预;
4)检测机体线粒体伤害水平,采用线粒体形态学变化检测方法,电镜观察线粒体形态变化,分光光度法和钙离子荧光探针FLUO-2/AM及荧光分光光度法测定线粒体肿胀及游离钙离子的含量,线粒体渗透性转换孔检测方法:有膜片钳技术法、活性物质标记法、分光光度法;
5)检测机体细胞凋亡状况,用磷脂酰丝氨酸外翻检测法或线粒体膜电位势能检测法,检测机体细胞凋亡情况,在凋亡水平还处于比较高的炎症状态时,进行有效消除炎症干预;
6)检测机体上皮间质转化情况,检测细胞黏附分子表达的减少、细胞角蛋白、细胞骨架转化为波形蛋白确定细胞的间充质细胞特征,从而确定上皮间质转化的发生。
2.根据权利要求1所述的一种机体癌症倾向的检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述8-羟基脱氧鸟苷水平正常人群男性水平为11.85±5.72ng/mg Gr,女性为16.24±10.83ng/mg Gr。
3.根据权利要求1所述的一种机体癌症倾向的检测方法,其特征在于,步骤(2)中所述丙二醛水平正常男性丙二醛含量在4.21±0.57nmol/ml,女性为3.99±0.47nmol/ml。
4.根据权利要求1所述的一种机体癌症倾向的检测方法,其特征在于,步骤(3)中所述高敏感C反应蛋白水平儿童和成人≤10mg/L;10-99mg/L提示局灶性或浅表性感染,≥100mg/L提示败血症或侵袭性感染的严重感染。
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CN109355294A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-02-19 | 温州医科大学附属第医院 | 特异性识别Vimentin的核酸适配体及其应用 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170322 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |