CN106520618A - 一种用于降解百草枯的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于降解百草枯的复合菌剂及其制备方法。该复合菌剂按质量百分比计由下述菌种组成：土壤纤发菌(Roseateles terrae)10％，芽孢杆菌(Bacillus.sp)25‑55％，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)20‑50％，大肠杆菌(Escherichia coli)15‑35％接种培养。本发明通过上述菌种之间的协同作用，不仅能有效降解土壤中百草枯除草剂，还能改良土壤结。该发明简单、方便、成本低、环境友好、安全。

Description

一种用于降解百草枯的复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于农药技术领域，具体涉及一种用于降解百草枯的复合菌剂及其制备方法，主要应用于土壤修复因使用百草枯除草剂后产生的药物残留。
背景技术
近年来，农业面源除草剂污染问题已成为我国广泛关注的重大农业生态环境问题。百草枯(Paraquat)是一种高效的除草剂，喷洒后可迅速渗透进入杂草细胞中，破坏杂草细胞的叶绿体结构导致杂草干枯致死。目前在所有除草剂中，百草枯的效果最好。但百草枯使用中也存在重大问题隐患，即百草枯极难降解，且对人和动物伤害极大，且人误食百草枯后会导致多脏器衰竭，暂无解药可以治疗。因此2016年7月开始，国家禁止制药企业销售、流通百草枯，但可用于出口。因此，找到百草枯生物降解路线成为土壤修复、减少农残伤害的重要手段。
生物降解技术中加入微生物可以经过驯化、富集、筛选、培养，从而达到一定数量及比例后发挥作用，也可以是原来不存在的外源微生物或遗传工程菌。优势菌种在系统中的稳定性是决定生物强化运行的关键所在。通过研究比较微生物种群间的相互作用，筛选组成微生物优势种群，其生物降解及发酵过程优于单一菌种的生物降解效果。
由于农田中、果实及叶片上含有大量的百草枯残留，且百草枯本身较难溶于水且残留毒性极大，因此很难通过清洗的方式清除百草枯。随着生物技术领域的发展及筛选水平的提高，目前可以有效的使用从自然界筛选的菌种进行生物修复，以有效减少百草枯在土壤及果蔬表面的残留，减少人类中毒事件的发生。但是，目前尚未有研究报道称筛选到可降解百草枯的菌剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于降解百草枯的复合菌剂，该菌剂可以降解剧毒除草剂百草枯，实现百草枯的无害化处理，并完成土壤的修复。
本发明的另一目的在于提供一种上述用于降解百草枯的复合菌剂的制备方法，该方法可以快速生产出可高效降解百草枯的复合菌剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于降解百草枯的复合菌剂，所述复合菌剂按质量百分比计由下述菌种组成：土壤纤发菌(Roseateles terrae)10％，芽孢杆菌(Bacillus.sp)25-55％，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)20-50％，大肠杆菌(Escherichia coli)15-35％。
优选地，所述复合菌剂按质量百分比计由下述菌种组成：土壤纤发菌(Roseatelesterrae)10％，芽孢杆菌(Bacillus.sp)25％，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)50％，大肠杆菌(Escherichia coli)15％。
本发明还提供上述用于降解百草枯的复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)挑取土壤纤发菌，芽孢杆菌，荧光假单胞菌，大肠杆菌，分别接种到LB培养基中，每种细菌在35℃的条件下摇床200rpm培养2天，再分别将四种菌的培养液按1:10的体积比例加入到M9营养培养基中，37℃，摇床200rpm培养12h至对数生长期；
2)将所述四种菌体的对数生长期细胞12000rpm离心10min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，将四种菌体按质量百分比混合，获得用于降解百草枯的复合菌剂。
其中的质量百分比为菌体干重的质量百分比。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠10g/L，氯化钾0.05g/L，磷酸氢二钾0.9g/L和磷酸二氢钾0.25g/L，其余为水。
上述用于降解百草枯的复合菌剂的使用方法为：用所述复合菌剂降解百草枯时，取复合菌剂的混合菌液以1:20的体积比例投加到M9培养基中37℃摇床200rpm培养12h，使复合菌剂活化后直接投入到100mg/L百草枯中，每100ml百草枯加入混合菌液1～2mL；35℃处理3-4d，转速为200rpm。
本发明所用LB培养基配方为：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；pH7.0，使用前121℃灭菌30min。
本发明所用M9培养基配方(500mL)为：NH4Cl 0.5g，Na2HPO4 3.0g，KH2PO4 1.5g，NaCl 0.25g，MgSO4 0.12g，葡萄糖10g；其中MgSO4、葡萄糖分别灭菌，其余成分一起灭菌后冷却，混合。
本发明所具有的优势：
本发明提供一种用于降解百草枯的复合菌剂，得到了四种菌种混合物，可实现百草枯的生物降解，每100mg/L百草枯一周可降解高达97mg/L，并完成一定的土壤修复。该发明简单、方便、成本低、环境友好、安全。
附图说明
图1为四种菌单独降解百草枯效果。
图2A为以土壤纤发菌为基准分别与芽孢杆菌按不同比例配置分解百草枯效果。
图2B为以土壤纤发菌为基准分别与荧光假单胞菌按不同比例配置分解百草枯效果。
图2C为以土壤纤发菌为基准分别与大肠杆菌按不同比例配置分解百草枯效果。
图3为本发明不同比例组合四种菌剂后百草枯降解结果。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的实质，下面结合实例对本发明的技术内容作详细的说明，但本发明的内容并不局限如此，不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。
本发明所用土壤纤发菌(Roseateles terrae)，芽孢杆菌(Bacillus.sp)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，大肠杆菌(Escherichia coli)四种菌由北京化工大学田平芳教授馈赠。
实施例1
分别挑取土壤纤发菌(Roseateles terrae)，芽孢杆菌(Bacillus.sp)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，大肠杆菌(Escherichia coli)四种菌，分别接种至20ml的LB液体培养基中，35℃摇床200rpm培养2天，再分别将四种菌的培养液按1:10的比例加入含有100mg/L百草枯及50mM的PBS磷酸缓冲液(pH7.0)的M9培养基(待降解百草枯溶液)中，37℃，摇床200rpm进行培养。培养一周后使用高效液相色谱法进行百草枯含量的测定。每次取样时间间隔为一天。测定每株菌降解百草枯的曲线如图1所示。
由图1中可以看出，土壤纤发菌(Roseateles terrae)降解百草枯的能力最强，在一周时间内百草枯剩余量为39mg/L。大肠杆菌(Escherichia coli)降解百草枯的能力最弱，反应结束后剩余百草枯95mg/L。由于百草枯结构较为复杂，微生物降解比较困难，因此靠单一菌种不能在一周时间内完成对100mg/L百草枯的降解，因此考虑利用集中可降解菌的优势进行互补，复配菌剂进行百草枯的降解。
实施例2
分别挑取土壤纤发菌(Roseateles terrae)，芽孢杆菌(Bacillus.sp)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，大肠杆菌(Escherichia coli)四种菌，分别接种至20ml的LB液体培养基中，35℃摇床200rpm培养2天。之后以土壤纤发菌(Roseateles terrae)为基准，按照其与另外三种菌种之间的接种比例进行降解实验，测定百草枯一周后的降解。与待降解百草枯溶液的接种比例及待降解百草枯溶液成分与实施例1相同，实验结果如图2A至图2C所示。
由图2A中可以看出，在土壤纤发菌(Roseateles terrae)与芽孢杆菌(Bacillus.sp)的复合菌剂制备中，随着土壤纤发菌(Roseateles terrae)比例的提高，百草枯降解剩余量出现了先降后升的趋势。最优的菌剂制备比例为土壤纤发菌(Roseatelesterrae)30％。由图2B至图2C中可以看出，而在土壤纤发菌(Roseateles terrae)与其他两株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与大肠杆菌(Escherichia coli)的复合菌及制备中，随着土壤纤发菌(Roseateles terrae)比例含量的提高，百草枯剩余量出现了上升的趋势，证明百草枯的降解能力的减弱。实验研究表明，虽然单株菌土壤纤发菌(Roseateles terrae)有着最强的百草枯降解能力，但初始菌种的添加比例不宜过高，过高的比例反而导致了百草枯降解能力的下降，推测可能由于土壤纤发菌(Roseatelesterrae)可利用其他菌种的相关代谢产物进行百草枯降解。土壤纤发菌(Roseatelesterrae)与其他三种菌种最优的配置比例分别为30％、15％和15％。
实施例3
分别挑取土壤纤发菌(Roseateles terrae)，芽孢杆菌(Bacillus.sp)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，大肠杆菌(Escherichia coli)四种菌，分别接种至20ml的LB液体培养基中，35℃生长2天。之后按照比例将每种菌的比例进行综合调整，以增加复合菌剂降解百草枯的能力。根据实施例2中得到的结果，最优的土壤纤发菌(Roseatelesterrae)比例为10％，因此该菌种的比例设为定值。其他三种菌按照一定的比例进行分配。共进行六组实验，土壤纤发菌(Roseateles terrae)、芽孢杆菌(Bacillus.sp)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与大肠杆菌(Escherichia coli)的比例分别为A:10:25:30:35，B:10:25:40:25，C:10:25:50:15，D:10:35:40:15，E:10:45:30:15，F:10:55:20:15。与待降解百草枯溶液的接种比例及待降解百草枯溶液成分与实施例1相同，六组实验一周后降解百草枯的实验结果如图3所示。
由图3中可以看出，最佳比例为C组合，四种菌种的比例为10:25:50:15。在该比例的状态下，百草枯在一周后剩余量仅为3mg/L，该复配比例的菌剂每周消耗百草枯的能力为97mg/L。
通过上述实施例可以看出，通过组合优化的形式得到了可高效降解百草枯菌剂的配方比例，其在一周内降解百草枯的能力为97mg/L，说明本发明具有良好的应用前景。
本发明对解决近年来农业面源除草剂污染问题，实现现代农业和社会经济的可持续发展、农业生态环境安全和农产品质量安全起到积极作用，可以大面积推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于降解百草枯的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂按质量百分比计由下述菌种组成：土壤纤发菌10％，芽孢杆菌25-55％，荧光假单胞菌20-50％，大肠杆菌15-35％。
2.如权利要求1所述的用于降解百草枯的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂按质量百分比计由下述菌种组成：土壤纤发菌10％，芽孢杆菌25％，荧光假单胞菌50％，大肠杆菌15％。
3.如权利要求1或2所述的用于降解百草枯的复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)挑取土壤纤发菌，芽孢杆菌，荧光假单胞菌，大肠杆菌，分别接种到LB培养基中，每种细菌在35℃的条件下摇床200rpm培养2天，再分别将四种菌的培养液按1:10的体积比例加入到M9营养培养基中，37℃，摇床200rpm培养12h至对数生长期；
2)将所述四种菌体的对数生长期细胞12000rpm离心10min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，将四种菌体按质量百分比混合，获得用于降解百草枯的复合菌剂。
4.如权利要求3所述的用于降解百草枯的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠10g/L，氯化钾0.05g/L，磷酸氢二钾0.9g/L和磷酸二氢钾0.25g/L，其余为水，pH7.0。
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