CN106485313B - 一种菌落快速记数方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种菌落快速记数方法，包括以下步骤：利用数码相机对培养皿内培养基上微生物菌落进行图像采集；建立平面直角坐标系，生成图像Ⅰ；对图像Ⅰ灰度化处理，生成图像Ⅱ；对图像Ⅱ二值化处理，生成图像Ⅲ；对图像Ⅲ裁剪，生成图像Ⅳ；对图像Ⅳ矢量化，得到矢量图像(1)；对矢量图像(1)分析，计算组成菌块的菌斑个数；计算每个菌斑的重心(中心)及半径；模拟菌斑重心(中心)的矢量点，生成矢量图像(2)；根据菌斑中心及半径，生成模拟菌斑的圆形矢量图斑和基于面状矢量图形的矢量图像(3)；计算矢量图像(3)中每个图斑的面积，统计菌斑数量。本发明对图像质量要求低，能够普遍实现且计数快速准确，同时还能计算菌落生长面积。

Description

一种菌落快速记数方法

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，尤其涉及一种菌落计数检测方法。

背景技术

菌落计数是微生物实验中最普遍的实验之一，是统计物品含菌数的有效方法，广泛用于食品、饮料、药品、生物制品、化妆品、卫生用品、饮用水、生活污水、工业废水、临床标本中细菌数的检验。一般是利用培养皿在固体培养基上(内)以特定条件进行培养，培养出以微生物母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞的集团，即菌落，通过菌落计数可以确定病原菌是否存在及其数量或用于判定食品被污染程度等。传统方法为人工目测计数，工作效率低。

目前的主流技术主要通过基于CCD相机结合计算机图像处理技术实现菌落快速计数，但由于光照类型、光照角度、拍摄距离、背景颜色等因素的影响，使图像质量不能完全满足计算机自动计数的要求，从而导致计数结果存在不确定性。

针对上述缺陷，专利号为2004100105476和2012103990911的两个专利中提出了通过严格控制图件采集环境来获得更好的计数，专利号2012100599555的专利中利用优化图像处理方法来提高自动计数结果的精度，专利号为2008800186164的专利中提出了通过多次自动计数并对计数结果进行数值处理得到计数结果的方法。

以上方法都需要特定的仪器设备来保证图像采集质量或图像处理过程，成本较高，导致普遍推广性受到制约；而且以上方法缺少计数结果的检验。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种菌落快速记数方法，目的就是解决菌落自动计数对于图像质量要求高、计算结果缺少检验的不足，提出一个能够普遍实现而且快速准确的计数方法，同时，本发明还能计算菌落生长面积，满足对微生物生长速度检测的需要。

本发明采用以下技术方案：

一种菌落快速记数方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

步骤1：利用数码相机对培养皿内培养基上微生物菌落进行图像采集；

步骤2：建立平面直角坐标系，定义原始图像坐标，生成图像Ⅰ；

步骤3：对图像Ⅰ进行灰度化处理，生成图像Ⅱ；

步骤4：对图像Ⅱ进行二值化处理，生成图像Ⅲ；

步骤5：对图像Ⅲ中计数范围外的图像进行裁剪，生成图像Ⅳ；

步骤6：对二值化栅格图像Ⅳ矢量化，得到模拟菌落边缘的矢量图像(1)；

步骤7：对矢量图像(1)中模拟每个菌块边缘的矢量线段夹角进行分析，计算组成菌块的菌斑个数；

步骤8：计算每个菌斑的重心(中心)及半径；

步骤9：根据菌斑中心点坐标自动生成模拟菌斑重心(中心)的矢量点，生成矢量图像(2)；

步骤10：根据菌斑中心及半径，生成模拟菌斑的圆形矢量图斑，生成基于面状矢量图形的矢量图像(3)；

步骤11：计算矢量图像(3)中每个图斑的面积，统计菌斑数量。

进一步的，步骤11完成后，还需要进行以下操作：

步骤12：将矢量图像(2)和矢量图像(3)与图像Ⅰ叠合，利用传统目视法对计数结果进行检验，并对漏计的菌斑进行补充计数，修正计数结果。

进一步的，所述步骤1的具体过程为：将培养皿置于均一颜色的背景上，选择分辨率不低于30万相素的数码相机，在培养皿正上方对培养皿拍照。

进一步的，步骤2中建立平面直角坐标系的具体方法为：以培养皿拍摄图像的左下角为原点，按照培养皿实际大小建立平面直角坐标系。

进一步的，步骤3中灰度转化的转化公式为Gray(x，y)＝0.299*R(x，y)+0.587*G(x，y)+0.114*B(x，y)。

进一步的，所述步骤4的具体过程为：

1)首先对图像的灰度分布进行分析，对目标区域图像做灰度直方图分布，由于图像的灰度直方图分布的双峰趋势不明显，因此在设计中采用局部阈值的方法对图像进行二值化；

2)采用自适应阈值方法(动态阈值方法)，根据图像实际情况，按照坐标对图像进行分块，对每一块分别选择一个阈值进行图像二值化，也可依据均方差限或分水岭算法对图像进行分块；

3)对于每一个图像分块，确定整体阈值T；具体过程为：对图像选取一个介于g_min和g_max的阈值T，阈值T的确定公式为T＝T((x，y)，f(x，y)，q(x，y))；式中，(x，y)表示像素点在图像中的坐标，f(x，y)是像素点(x，y)处的灰度值，q(x，y)是该点邻域的某种局部性质；

4)确定局部阈值g(x，y)，计算公式为：把图像中的像素按其灰度值分为两类。

进一步的，步骤5的具体实现过程为：利用公式(x-a)²+(y-b)²＝r²，其中，圆心(a,b)，半径为r，选定图像Ⅲ中的计数范围，对计数范围外的图像进行裁剪，生成图像Ⅳ。

进一步的，步骤7的具体实现方法为：

①将菌块弧线向量化；

②计算起点两侧线段在图形内部的夹角，若≤180度，i＝0；否则i＝1；

③由矢量弧线起点开始依次计算相邻向量的角度，设定角度阈值和间隔折线数量阈值，若≤180度，i＝i+0；若≥180度，且间隔折线数量超过阈值，i＝i+1；否则，i＝i+0；

④判定菌斑个数：若i＝0，则菌斑数为1；若i＞0，则菌斑数为i。

本发明的有益效果是：

1、本发明对图像采集质量要求不十分严格，采用普通数码相机对培养基中的生物菌落进行图像采集即可满足需求，也不用专门的照明设备，便于推广应用。

2、本发明将栅格图像格式的菌斑进行矢量化处理，既可以模拟菌斑大小，又可以表示菌斑位置，矢量图斑和点与栅格格式菌斑图像完全套合，便于利用人工目测的方式对计数结果进行检验，保证计数精度。

3、本发明将栅格图像格式的菌斑进行矢量化处理，利用矢量图斑模拟菌斑大小，可以自动测量每个菌斑的大小，如半径和面积，实现对菌落生长速度的定量化表示。

附图说明

图1是本发明方法的流程图；

图2是本发明步骤2中坐标系建立示意图；

图3是本发明图像Ⅰ示意图；

图4是本发明图像Ⅱ示意图；

图5是本发明图像Ⅲ示意图；

图6是本发明图像Ⅳ示意图；

图7是本发明矢量图像(1)示意图；

图8是本发明步骤7图像处理示意图；

图9是本发明步骤8图像处理示意图；

图10是本发明矢量图像(2)示意图；

图11是本发明矢量图像(3)示意图。

具体实施方式

如图1所示的一种菌落快速记数方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

步骤1：利用数码相机对培养皿内培养基上微生物菌落进行图像采集，具体要求为：拍摄角度为培养基正上方，背景尽量采用均一颜色，以与菌落颜色反差较大颜色为佳。相机的分辨率以不低于30万相素(640*480)，相素越高效果越好，拍摄时在保证拍摄到整个培养皿的同时，尽量保证培养基布满拍摄范围。

步骤2：以培养皿拍摄图像的左下角为原点，按照培养皿实际大小建立平面直角坐标系，定义原始图像坐标，如图2所示，隐藏坐标系后，生成图像Ⅰ，如图3所示。

步骤3：利用灰度转化公式Gray(x，y)＝0.299*R(x，y)+0.587*G(x，y)+0.114*B(x，y)，对图像Ⅰ进行灰度化处理，将彩色图像的R、G、B分量转化为灰度值表征每个像素点(灰度范围为0-255)，生成图像Ⅱ，如图4所示。

步骤4：通过对图像Ⅱ的灰度分布进行分析，采用局部阈值的方法对图像进行二值化处理，生成图像Ⅲ，如图5所示。具体做法和要求是：首先对图像的灰度分布进行分析，对目标区域图像做灰度直方图分布。由于图像的灰度直方图分布的双峰趋势不明显，因此在设计中采用局部阈值的方法对图像进行二值化。然后采用自适应阈值方法(动态阈值方法)，根据图像实际情况，按照坐标对图像进行分块，对每一块分别选择一个阈值进行图像二值化。也可依据均方差限或分水岭算法对图像进行分块。对于每一个图像分块，选取一个介于g_min和g_max的阈值T，阈值T的确定公式为T＝T((x，y)，f(x，y)，q(x，y))；式中，(x，y)表示像素点在图像中的坐标，f(x，y)是像素点(x，y)处的灰度值，q(x，y)是该点邻域的某种局部性质。而局部阈值方法中阈值是根据f(x，y)和q(x，y)选取的，所得的阈值是与图像的某个局部区域相关的，对不同的区域使用不同的阈值。根据选择的阈值，利用公式把图像中的像素按其灰度值分为两类。

步骤5：由于培养皿一般为标准圆形，利用公式(x-a)²+(y-b)²＝r²，圆心(a,b)，半径为r，选定图像Ⅲ中的计数范围，对计数范围外的图像进行裁剪，生成图像Ⅳ，如图6所示。

步骤6：利用矢量化工具对二值化栅格图像Ⅳ矢量化，得到模拟菌落边缘的矢量图像(1)，如图7所示；

步骤7：如图8所示，对矢量图像(1)中模拟每个菌块边缘的矢量线段夹角进行分析，设定角度阈值和间隔折线数量阈值，计算组成菌块的菌斑个数，具体原理为：矢量图像(1)中的模拟弧线由折线和折点构成。对于某个菌块弧线，首先将折线中顺时针或逆时针向量化，判断矢量弧线起点两侧折线菌斑内部夹角是否大于180度，然后将i赋值为1或0(起点两侧折线大于180度赋值为1，否则赋值为0)，由矢量弧线起点开始计算相邻向量的角度，设定角度阈值和间隔折线数量阈值，若超过阈值，则i＝i+1，直至矢量弧线起点结束，最终根据i的赋值即可判定该菌块粘连的菌斑个数，若i＝0，则菌斑个数为1，若i＞0，则i的赋值即为菌斑个数。

步骤8：根据菌斑个数、面积比例，利用几何关系计算每个菌斑的重心(中心)及半径，处理结果如图9所示；

步骤9：利用ArcGIS软件中Add XY Data等专业工具，根据菌斑中心点坐标自动生成模拟菌斑重心(中心)的矢量点，生成矢量图像(2)，如图10所示，矢量图像(2)的位置即为菌斑的位置。

步骤10：利用ArcGIS软件中缓冲(buffer)工具等专业工具，根据菌斑中心及半径，生成模拟菌斑的圆形矢量图斑，生成基于面状矢量图形的矢量图像(3)，如图11所示，矢量图像(3)中每个图斑的面积即为菌斑面积，半径即为菌斑半径，图斑数量即为菌斑数量。

步骤11：利用ArcGIS软件中计算几何要素(Calculate Geometry)等专业工具，计算矢量图像(3)中每个图斑的面积，统计菌斑数量。

步骤12：将矢量图像(2)和矢量图像(3)与图像Ⅰ叠合，利用传统目视计数方法对计数结果进行检验，并对漏计的菌斑进行补充计数，修正计数结果。

应当指出，以上所述具体实施方式可以使本领域的技术人员更全面地理解本发明的具体结构，但不以任何方式限制本发明创造。因此，尽管说明书及附图和实施例对本发明创造已进行了详细的说明，但是，本领域技术人员应当理解，仍然可以对本发明创造进行修改或者等同替换；而一切不脱离本发明创造的精神和范围的技术方案及其改进，其均涵盖在本发明创造专利的保护范围当中。

Claims (8)

1.一种菌落快速记数方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

步骤1：利用数码相机对培养皿内培养基上微生物菌落进行图像采集；

步骤2：建立平面直角坐标系，定义原始图像坐标，生成图像Ⅰ；

步骤3：对图像Ⅰ进行灰度化处理，生成图像Ⅱ；

步骤4：对图像Ⅱ进行二值化处理，生成图像Ⅲ；

步骤5：对图像Ⅲ中计数范围外的图像进行裁剪，生成图像Ⅳ；

步骤6：对二值化栅格图像Ⅳ矢量化，得到模拟菌落边缘的矢量图像1；

步骤7：对矢量图像1中模拟每个菌块边缘的矢量线段夹角进行分析，计算组成菌块的菌斑个数；

步骤8：计算每个菌斑的中心及半径；

步骤9：根据菌斑中心点坐标自动生成模拟菌斑中心的矢量点，生成矢量图像2；

步骤10：根据菌斑中心及半径，生成模拟菌斑的圆形矢量图斑，生成基于面状矢量图形的矢量图像3；

步骤11：计算矢量图像3中每个图斑的面积，统计菌斑数量。

2.根据权利要求1所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，步骤11完成后，还需要进行以下操作：

步骤12：将矢量图像2和矢量图像3与图像Ⅰ叠合，利用传统目视法对计数结果进行检验，并对漏计的菌斑进行补充计数，修正计数结果。

3.根据权利要求1或2所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，所述步骤1的具体过程为：将培养皿置于均一颜色的背景上，选择分辨率不低于30万相素的数码相机，在培养皿正上方对培养皿拍照。

4.根据权利要求1或2所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，步骤2中建立平面直角坐标系的具体方法为：以培养皿拍摄图像的左下角为原点，按照培养皿实际大小建立平面直角坐标系。

5.根据权利要求1或2所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，步骤3中灰度转化的转化公式为Gray(x，y)＝0.299*R(x，y)+0.587*G(x，y)+0.114*B(x，y)。

6.根据权利要求1或2所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，所述步骤4的具体过程为：

1)首先对图像的灰度分布进行分析，对目标区域图像做灰度直方图分布；

2)采用自适应阈值方法，根据图像实际情况，按照坐标对图像进行分块，对每一块分别选择一个阈值进行图像二值化；

3)对于每一个图像分块，确定局部阈值T，具体过程为：对图像选取一个介于g_min和g_max的阈值T，阈值T的确定公式为T＝T((x，y)，f(x，y)，q(x，y))；式中，(x，y)表示像素点在图像中的坐标，f(x，y)是像素点(x，y)处的灰度值，q(x，y)是像素点(x，y)邻域的局部性质；

4)确定局部阈值g(x，y)，计算公式为：把图像中的像素按其灰度值分为两类。

7.根据权利要求1或2所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，步骤5的具体实现过程为：利用公式(x-a)₂+(y-b)₂＝r₂，其中，圆心(a,b)，半径为r，选定图像Ⅲ中的计数范围，对计数范围外的图像进行裁剪，生成图像Ⅳ。

8.根据权利要求1或2所述的一种菌落快速记数方法，其特征在于，步骤7的具体实现方法为：

①将菌块弧线向量化；

②计算起点两侧线段在图形内部的夹角，若≤180度，i＝0；否则i＝1；

③由矢量弧线起点开始依次计算相邻向量的角度，设定角度阈值和间隔折线数量阈值，若≤180度，i＝i+0；若≥180度，且间隔折线数量超过阈值，i＝i+1；否则，i＝i+0；

④判定菌斑个数：若i＝0，则菌斑数为1；若i＞0，则菌斑数为i。