CN106474483A - 氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗、制备方法和应用,该氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗包括西妥昔单抗和氧化石墨烯,西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接,氧化石墨烯为二维纳米氧化石墨烯,且粒径小于0.22μm。上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接,形成复合抗体,可大幅度的增强生物学反应。相比西妥昔单抗在体外只有轻微抑制作用,上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗可直接抑制或杀伤胶质瘤细胞。同时采用粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯,可使得氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗性质稳定,同时降低对外周血管的刺激。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域,特别地,涉及一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗。此外,本发明还涉及一种包括上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法及应用。
背景技术
靶向治疗是指作用于专门分子从而阻止肿瘤生长、增殖、扩散的药物或者小分子物质,也被称为分子靶向治疗,分子靶向药物和精准医学。靶向治疗与化疗不同:(1)靶向治疗只专门作用于肿瘤相关的分子,而化疗抑制细胞代谢,影响细胞周期,作用于所有快速分裂的细胞既包括肿瘤,也包括正常细胞,换而言之,化疗的特异性相对较差;(2)靶向治疗是瞄准靶细胞或者靶点精心设计和选择的,而化疗的选择仅仅是因为可以抑制或杀伤肿瘤细胞;(3)靶向治疗是抑制细胞的增殖分化,与细胞周期无关,而化疗药物是利用细胞周期的敏感阶段引起细胞中毒而杀伤细胞。
西妥昔单抗是一种已经使用12年的EGFR抗体的靶向治疗药物,疗效肯定但是微弱。随着化疗对免疫系统的损害,耐药复发,先天性反应低等情况的出现,亟需更加高效的EGFR抗体。
发明内容
本发明提供了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,以解决现有的西妥昔单抗疗效弱的技术问题。
本发明采用的技术方案如下:
本发明一方面提供了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗包括西妥昔单抗和氧化石墨烯,西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接,氧化石墨烯为二维纳米氧化石墨烯,且粒径小于0.22μm。
进一步地,西妥昔单抗和氧化石墨烯的质量比为50~5:1。
本发明另一方面提供了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,包括以下步骤:将西妥昔单抗、氧化石墨烯加入体积百分数为10~50%的磷酸盐缓冲液中,在4~40℃下震荡摇匀,反应2~24小时得到氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗。
进一步地,磷酸盐缓冲液的体积百分数为10%,磷酸盐缓冲液的用量为1mg氧化石墨烯加入0.5~1.5ml所述磷酸盐缓冲液,优选为1ml磷酸盐缓冲液。
进一步地,反应温度为37℃。
进一步地,反应时间为12~24小时,优选为12小时。
进一步地,氧化石墨烯的制备包括以下步骤:
将氧化石墨烯原材料在0~4℃的条件下,通过超声波破碎,经过孔径0.22μm的滤网过滤,得到氧化石墨烯。
进一步地,超声波破碎的操作包括以下步骤:
将氧化石墨烯原材料配置为1~2mg/ml,在超声波的强度为3.5的条件下,超声2小时,超声模式为工作10s,休息5s。
本发明还提供了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
本发明具有以下有益效果:上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接,形成复合抗体,可大幅度的增强生物学反应。相比西妥昔单抗在体外只有轻微抑制作用,上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗可直接抑制或杀伤胶质瘤细胞。同时采用粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯,可使得氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗性质稳定,同时降低对外周血管的刺激。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外,本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图,对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是氧化石墨烯原料和二维纳米氧化石墨烯的对比图;
图2是氧化石墨烯原料和二维纳米氧化石墨烯在10×10×=100×倍数下的对比图;
图3是CTX/GO和PANI/GO的对比图;
图4是PBS、GO、CTX、CTX/GO溶液处理的胶质瘤细胞在10×10×=100×倍数下的观测图;
图5是PANI、PANI/GO溶液处理的胶质瘤细胞在10×10×=100×倍数下的观测图;
图6是PBS和CTX/GO溶液处理的胶质瘤细胞在10×40×=400×倍数下的观测图;
图7是各组溶液不同梯度下处理的胶质瘤细胞存活数目吸光值分布图;
图8是各组溶液不同梯度下处理的胶质瘤细胞存活数目吸光值柱状图;
图9是CTX-FITC处理的不同细胞株的荧光强度图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明,但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明的优选实施例提供了本发明一方面提供了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗(CTX/GO),氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗包括西妥昔单抗(CTX)和氧化石墨烯(GO),西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接。
氧化石墨烯含有sp2杂化带羟基和羧基的苯环,不仅性质稳定、生物相容性好,还可以通过π键、疏水作用、氢键和离子键与抗体、药物分子、金属离子、荧光基团或者细胞非共价结合。其次,二维结构的GO的表面比任何其他纳米材料都高出至少4个量级,它的每个原子都暴露在表面,适合于运载药物。GO是其他石墨材料的基本构建块,可以裹成零维的球体,滚成一维的碳纳米管,层叠成三维结构的石墨。
石墨烯虽然是公认的纳米材料,但是并不一定适合作为静脉用的药物。因为纳米材料的概念是指,任何三维结构中,只要有一维达到纳米级就可以称为纳米材料。比如未经改良的石墨烯(可购买于Sigma),虽然厚度符合纳米级,但是直径较大,不符合纳米级要求。申请人认为作为静脉用的药物,必须达到所有维度的纳米级才能减小毒性,最大发挥纳米材料的优势。石墨烯为二维结构,选择或制备厚度及直径均符合纳米级的二维纳米石墨烯作为原料,使得氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗更加适合体外实验和体内试验,尤其是体内试验。
氧化石墨烯的粒径小于0.22μm。颗粒较大的氧化石墨烯在生理盐溶液下容易发生聚集,生成沉淀,性质不稳定。采用粒径小于0.22μm的氧化石墨烯可在人血清中稳定均匀分散。粒径小于0.22μm的氧化石墨烯可直接购买或将大颗粒的氧化石墨烯破碎制取,如通过超声波破碎制取。
此外,尽管GO可分散于水中,如生理盐水,然而由于盐的电荷屏蔽作用使得GO易发生聚集。良好的药物载体具有优良的表面化学性质,不仅生物相容性好,而且生物变化可控。因此,GO的表面修饰势在必行,目前主要分两种:共价和非共价,前者通常是通过氧化石墨烯的非饱和结构破坏而形成的原子掺杂或反应的技术;后者不改变GO的自然结构,只通过非共价键,范德华力,电荷吸引,结合更加灵活。本申请中的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗中,西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接,结合灵活,并且杀伤淋巴瘤细胞的效果强。
本发明具有以下有益效果:上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,西妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接,形成复合抗体,可大幅度的增强生物学反应。相比西妥昔单抗在体外只有抑制作用,上述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗可直接抑制或杀伤胶质瘤细胞。同时采用粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯,可使得氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗性质稳定,同时降低对外周血管的刺激。
可选地,妥昔单抗和所述氧化石墨烯的质量比为50~5:1。
本发明另一方面提供了一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,包括以下步骤:将西妥昔单抗、氧化石墨烯加入体积百分数为10~50%的磷酸盐缓冲液中,在4~40℃下震荡摇匀,反应2~24小时得到所述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗。
磷酸盐缓冲液(PBS)为本领域常用试剂,其pH值范围为7.35~7.45。体积百分数为10~50%的磷酸盐缓冲液即PBS溶液在原配方的基础上调整水的加入量,将其稀释。
西妥昔单抗、氧化石墨烯在振荡摇匀的条件下反应,二者通过非共价键结合得到氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗。并且氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗可从作为溶剂的磷酸盐缓冲液中分离出来,也可不予分离仍在磷酸盐缓冲液中保持。
在上述条件得到的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗在稀释一倍之后仍具有一定的杀伤效果。
反应时间过短,西妥昔单抗和氧化石墨结合时间不够,导致二者结合量较小,结合不稳定。而反应时间过长,则增加了抗体变异的风险。因此反应时间可优选为2~24小时。在研究中随着CTX/GO的浓度稀释,大部分不同温度下制备的CTX/GO杀伤细胞的能力逐步减弱,但是只有在37℃和42℃合成的CTX/GO并没有随着浓度稀释明显降低疗效,提示37℃和42℃制备的CTX/GO的治疗效果最好。并且制备温度越高,抗体分子高温变性越严重,抗体活性越弱,而且温度过高时,氧化石墨烯的结构也会遭到破坏,这两方面的因素损害了CTX/GO的杀伤功能。
可选地,磷酸盐缓冲液的体积百分数为10%,磷酸盐缓冲液的用量为1mg氧化石墨烯加入0.5~1.5ml所述磷酸盐缓冲液,优选为1ml磷酸盐缓冲液。10%PBS的条件下,CTX的结合量较高,更重要的是10%PBS有比较稳定的缓冲系统,更接近生理情况。
可选地,反应温度为37℃。
反应温度选择37℃。原因有二:第一,这个温度下杀伤效果最好;第二,这个温度也是生理温度,有利于保障体外和体内实验结果的稳定,并为得到体外和体内一致的结果奠定了基础。
可选地,反应时间为12~24小时,优选为12小时。反应时间为12~24小时,西妥昔单抗和氧化石墨量大,结合稳定,继续增加反应时间,西妥昔单抗和氧化石墨结合数量并不会明显增加。考虑到时间成本,反应时间可选优为12小时。
可选地,氧化石墨烯的制备包括以下步骤:
将氧化石墨烯原材料在0~4℃的条件下,通过超声波破碎,经过孔径0.22μm的滤网过滤,得到氧化石墨烯。
氧化石墨烯的制备很重要,严格控制大小和厚度。可从Sigma购得氧化石墨烯原材料,透析纯化去除酒精。将氧化石墨烯原材料在超声仪下破碎成细小颗粒。然后将经过孔径0.22μm的滤网过滤。可采用全程在冰水混合物中进行操作以保证反应温度在0~4℃的条件。
可选地,超声波破碎的操作包括以下步骤:
将氧化石墨烯原材料配置为1~2mg/ml,在超声波的强度为3.5的条件下,超声2小时,超声模式为工作10s,休息5s。
在美国Misonix超声波破碎仪Sonicator 3000,强度3.5,持续超声2小时,模式工作10秒,休息5秒。在该条件下,氧化石墨烯的粒径小于50nm,厚度为1~3nm。
分别取未处理的氧化石墨烯原料和处理后的氧化石墨烯10μl(浓度均为1mg/ml),分别滴在细胞板上,如图1所示。在显微镜下拍照,得到图2a和图2b。图2a可见购买的氧化石墨烯原料比较大,直径达40μm。图2b的加工后的氧化石墨烯的颗粒小得多。
参照图1和图2,超声过滤处理过的GO能在人血清中稳定均匀分散,然而未经超声的一般GO(即一般的颗粒较大的氧化石墨烯,如从Sigma购得的氧化石墨烯原材料,其粒径>0.5-1μm和厚度>10nm)在4小时之内就发生沉淀。
实施例1
从Sigma购得氧化石墨烯原材料,透析纯化去除酒精,配制为浓度1mg/ml,在美国Misonix超声波破碎仪Sonicator 3000强度3.5的条件下,持续超声2小时,模式工作10秒,休息5秒。注意全程在冰水混合物中进行。超声结束后,用0.22μm的过滤器过滤,制得氧化石墨烯,Nanodrop测量最终浓度,冷藏备用。
将1mg西妥昔单抗、0.2mg氧化石墨烯加入1ml体积百分数为10%的磷酸盐缓冲液中,在4℃下震荡摇匀,反应12小时,得到含氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的混合液。
实施例2
和实施例1的区别在于,制备氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗时的温度为37℃。
实施例3
和实施例1的区别在于,制备氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗时的温度为40℃。
实施例4
和实施例1的区别在于,制备氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗时的反应时间为2小时。
实施例5
和实施例1的区别在于,制备氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗时的反应时间为24小时。
对比例1
和实施例1的区别在于,西妥昔单抗与PANI单抗反应。
实验数据
关于稳定性
取实施例1的CTX/GO与对比例1的PANI/GO进行比较。如图3所示,CTX/GO清亮,均匀;而PANI/GO浑浊,包含沉淀。结果提示,PANI/GO性质不稳定,不适合作为治疗的化合物进行研究。
细胞培养实验
圆底96孔板培养胶质瘤细胞,细胞浓度为4x106/ml,200μl,分为五组。五组分别加入相同浓度的PBS溶液、氧化石墨烯溶液、实施例1的CTX溶液、实施例1的CTX/GO溶液、对比例1的PANI溶液和对比例1的PANI/GO溶液,在恒温,恒湿,恒定二氧化碳浓度的情况下培养3天。在显微镜中(10×10×=100×)观察各组中胶质瘤细胞的存活数量。如图4和图5所示。观察结果显示,PBS组、GO组、CTX组和PANI组的胶质瘤细胞存活数量较多,PANI/GO组和CTX/GO组的胶质瘤细胞存活数量较少,并且高放大系数的镜头(10×40×=400×)显示,如图6所示,CTX/GO组的胶质瘤细胞存活数量远小于PANI/GO组。
实验结果证明:
1、CTX组和PANI组在体外细胞实验中并不具备抑制或杀伤胶质瘤细胞的能力或者抑制能力微弱。这与公知的认识也是吻合。因为CTX和PANI应用于人体时,其作用于人体免疫系统,刺激免疫系统将胶质瘤细胞消灭,因而在体外实验中,由于没有免疫系统或者补体,CTX和PANI对胶质瘤细胞作用微弱。
2、PANI/GO组和CTX/GO组具备抑制或杀伤胶质瘤细胞的能力。相应组的胶质瘤细胞存活数量大为减少。PANI和CTX与GO结合后,改变了PAN和CTX两种EGFR受体抗肿瘤药物的作用机制,使其在体外细胞试验中仍具有抑制或杀伤胶质瘤细胞的能力。而CTX/GO组的抑制或杀伤胶质瘤细胞的能力远高于PANI/GO组。
MTS胶质瘤细胞增殖活性检测
圆底96孔板培养胶质瘤细胞,细胞浓度为1x106/ml,200μl,分为四组。每组分别对应PBS处理组、GO组、CTX组和CTX/GO组。其中,将10%的PBS溶液、2μg/ml的GO溶液、10μg/mlCTX和CTX/GO溶液处理相应的干预组。在恒温,恒湿,恒定二氧化碳浓度的情况下培养3天。将各组的胶质母细胞瘤细胞DBTRG-MG待检,向96孔板中每孔中加入20μl的MTS试剂,轻软震动,混匀,避免液体溅出来。放入培养箱中继续培养2小时,然后在全功能酶标仪Synergy H1仪器中读取450nm处的吸光值。吸光值可以反应细胞的增殖活性,用来评价干预药物的疗效。
实验结果显示,参照图7和8,MTS中吸光值代表细胞增殖活性,PBS组、GO组、CTX组的吸光值集中于100附近,而CTX/GO组的吸光值虽随梯度浓度的降低逐渐升高,吸光值由5.99升至40.54,仍远低于其他各组,说明CTX/GO能明显抑制胶质瘤细胞株DBTRG的活性。具体的吸光值数据如表1所示。
表1不同组别及梯度的吸光值
实验结果证明二维纳米氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗抑制/杀伤胶质瘤细胞的效果更强。
EGFR表达水平及其与西妥昔单抗亲和性的检测
在西妥昔单抗上结合FITC基团,制备成西妥昔单抗-FITC抗体(CTX-FITC)备用。CTX-FITC与二维纳米氧化石墨烯结合,形成CTX-FITC/GO,备用。准备DBTRG、U251、SGH44和HS683四种细胞株,各细胞株的操作如下:
取细胞1x105重悬于200μl的培养基RPMI1640中,置于96孔板,每孔加入CTX-FITC50μg,CTX-FITC/GO 50μg,或者等体积的PBS(对照,即图例中的Cell)。混匀后继续培养2小时,消化并取出细胞做流式细胞仪分析,数据处理后如图9。
结果分析:
四张图分别代表不同的细胞株,分为两组:第一二幅图代表EGFR高表达胶质瘤细胞株,第三四幅图代表胶质瘤EGFR低表达株。细胞对照组的自身荧光基础值在104~105之间,CTX-FITC与EGFR结合显现出的荧光强度代表EGFR的表达水平,故此可鉴别出,DBTRG与U251属于高表达株,而SGH44和HS683属于低表达株。
实验结果显示:
1、从DBTRG组与U251组中CTX-FITC/GO与EGFR的结合情况可以看出,其中的GO并不影响CTX-FITC与EGFR结合,反而增强了结合的信号。
2、在SGH44组和HS683组中,CTX-FITC/GO不能增强结合信号。
综合上述两点可以得出结论,二维纳米氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗更高效的特异性结合EGFR受体,CTX-FITC/GO与EGFR之间为特异性结合,即只与EGFR结合。这是只抑制/杀伤胶质瘤细胞,保护正常细胞,减少毒副作用的重要基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,其特征在于,所述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗包括西妥昔单抗和氧化石墨烯,所述西妥昔单抗和所述氧化石墨烯通过非共价键连接,所述氧化石墨烯为二维纳米氧化石墨烯,且粒径小于0.22μm。
2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗,其特征在于,所述西妥昔单抗和所述氧化石墨烯的质量比为50~5:1。
3.一种权利要求1或2所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将西妥昔单抗、氧化石墨烯加入体积百分数为10~50%的磷酸盐缓冲液中,在4~40℃下震荡摇匀,反应2~24小时得到所述氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗。
4.根据权利要求3所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的体积百分数为10%,所述磷酸盐缓冲液的用量为1mg所述氧化石墨烯加入0.5~1.5ml所述磷酸盐缓冲液,优选为1ml磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求3所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,其特征在于,反应温度为37℃。
6.根据权利要求3所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,其特征在于,反应时间为12~24小时,优选为12小时。
7.根据权利要求3~6中任一项所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,其特征在于,所述氧化石墨烯的制备包括以下步骤:
将氧化石墨烯原材料在0~4℃的条件下,通过超声波破碎,经过孔径0.22μm的滤网过滤,得到氧化石墨烯。
8.根据权利要求7所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗的制备方法,其特征在于,所述超声波破碎的操作包括以下步骤:
将氧化石墨烯原材料配置为1~2mg/ml,在超声波的强度为3.5的条件下,超声2小时,超声模式为工作10s,休息5s。
9.一种权利要求1或2所述的氧化石墨烯修饰的西妥昔单抗在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
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