CN106467926A - 一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法,用于癌症的治疗。方法包括:对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取,将提取的总RNA进行反转录,得到cDNA,然后以得到的cDNA为模板,实时定量PCR计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平,根据目标表型癌细胞中基因表达的相对转录水平定位目标表型癌细胞的表型基因,最后建立包含癌细胞表型、表型基因以及癌细胞表型和表型基因之间对应关系的数据表,当获知癌细胞表型时,能够根据所述癌细胞表型在所述数据表中快速查询表型基因,所述表型基因用于癌症的治疗。
Description
技术领域
本申请涉及恶性肿瘤基因治疗领域,尤其涉及一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法。
背景技术
恶性肿瘤己成为严重威胁人类生命与健康的疾病之一。据世界卫生组织统计,全世界死于恶性肿瘤的人约每年700万,我国每年死于恶性肿瘤的人约150万,目前我国国内新增肿瘤患者每年高达180万以上,癌症治疗技术的研究已经迫在眉睫。经研究表明,肿瘤的发生既与外源性致癌因素的性质、强度和作用时间有关,同时也与人体的内在因素有重要的关系。经常可以见到,处于同样条件下接触同质、同量致癌因素,有的人发病,而有的人不发病,可见外源性致癌因素虽然很重要,但人体的内在因素才是癌细胞产生和发展的决定性因素。因此,从人体自身层面上研究癌症发病机制具有重要意义。
在引起人体恶性肿瘤的众多内在因素中,与基因相关的因素占据极其重要的部分。分子生物学的研究己经发现2.5万多种癌症与相关的基因变异和基因表达失调有关,这些与肿瘤发生发展有关的基因一般是编码生长因子、生长因子受体、信号转导蛋白、转录因子、凋亡蛋白、细胞周期蛋白和DNA修复蛋白等的基因。
一方面癌细胞有许多共性,如生长和分裂失去控制,具有浸润性和扩散性,细胞间粘着性下降,细胞分化程度较低,失去运动和分裂的接触抑制等,癌细胞的每种细胞功能特点都有相对应的基因所控制,如癌细胞中调控细胞增殖、凋亡、细胞间粘连等功能的基因往往出现异常。另一方面不同种类的癌细胞基因表达谱却不尽相同,正是由于这些不同的基因表达决定了各式各样癌细胞的表型。因此,研究这些基因表达谱中不同的表达基因能够对癌症的发病原因以及癌症的治疗提供重要帮助。
然而,人类的基因组数据库过于复杂,从不同表型癌细胞的基因表达谱中筛选出决定其表型的基因需要花费大量的工作,并且有的时候癌症病人的治疗情况十分急迫,要检测导致癌细胞表型的基因会耗费大量时间,从而不利于癌症病人的及时治疗。
发明内容
本发明的实施例提供了一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法,用于定位目标表型癌细胞的表型基因。
一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法,其特征在于,该方法包括:
对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取;
将所提取的总RNA进行反转录,得到cDNA;
以得到的cDNA为模板,实时定量PCR计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平;
根据目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平的计算结果定位目标表型癌细胞的表型基因。
优选的,所述定位目标表型癌细胞的表型基因具体为:比较目标表型癌细胞各个基因mRNA的相对转录水平,以目标表型癌细胞中mRNA的相对转录水平最高的基因作为目标表型癌细胞表型基因。
优选的,所述方法还包括:根据目标表型癌细胞以及所定位的表型基因,构建癌细胞表型、表型基因和它们对应关系三者的文库;所述文库具体为癌细胞表型、表型基因以及对应关系三者的数据表。
优选的,其特征在于,当获知癌细胞表型时,能够根据所述癌细胞表型在所述文库中快速查询表型基因,用于癌症的基因治疗。
优选的,其特征在于,所述对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取具体为:使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus试剂盒分别提取目标表型癌细胞和对应正常细胞中全部的RNA。
优选的,所述目标表型癌细胞具体指:包括人胰腺癌细胞在内的不同表型的癌细胞;所述对应正常细胞指:与目标表型癌细胞相对应的正常细胞,包括人胰腺细胞HPC-Y5。
优选的,所述反转录具体为:用TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒,将提取得到的目标表型癌细胞和对应正常细胞的总RNA分别进行反转录。
优选的,所述目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平计算方法为:将选定基因在对应正常细胞中转录mRNA的量定为1个基本单位,并以此确定目标表型癌细胞中相同基因的mRNA转录量;所述选定基因为人类基因组数据库中任何一个基因。
优选的,所述表型基因指通过精确协调的活动而维持细胞特定表型的基因,癌细胞表型基因的mRNA高相对转录水平造成了癌细胞与正常细胞的差别。
本发明所带来的有益效果是,一方面本发明对目标表型癌细胞中基因表达的实时定量PCR,通过比较癌细胞和对应正常细胞之间不同基因mRNA相对转录水平之间的比较,根据细胞表型的差异由表型基因的活动状态决定的原理,筛选出决定癌细胞表型的表型基因,另一方面本发明提供了表型基因、癌细胞表型和表型基因及癌细胞表型对应关系三者的文库,当获知癌细胞表型时,能够根据所述癌细胞表型在所述文库中快速查询表型基因,用于癌症的基因治疗。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例一的流程图
图2为本发明实施例二的流程图
图3为本发明实施例二胸RNA提取具体操作步骤流程图
图4为本发明实施例三的流程图
图5为本发明实施例四的流程图
图6为PANC-1中4种基因mRNA的相对转录水平
图7为本发明实施例五的流程图
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
本发明的主要思想是细胞表型的差异(正常细胞和癌细胞之间以及不同癌细胞之间)与表型基因的活动状态有关,表型基因是指通过精确协调的活动而维持细胞特定表型的基因,癌细胞表型基因的mRNA高相对转录水平造成了癌细胞与正常细胞的差别。可以通过比较目标表型癌细胞不同基因信使RNA(mRNA)的相对转录水平,相对转录水平最高的基因即为目标表型癌细胞的表型基因,并且目标表型癌细胞整个生命过程受到表型基因的调控。本发明通过比较PANC-1细胞内不同基因mRNA的相对转录水平,筛选出决定PANC-1细胞表型的表型基因。并根据筛选的结果构建癌细胞表型、表型基因和它们对应关系三者的文库。
根据上述总体过程,本发明筛选出的表型基因与癌细胞的增殖和/或凋亡和/或浸润和/或转移等细胞生命过程相关。
为了使本领域技术人员能进一步了解本发明的特征及技术内容,下面结合附图和实施例,对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例一
附图1为本发明实施例一的流程图。该实施例所述的一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法包括以下步骤:
步骤101:对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取;
步骤102:将步骤101中提取的总RNA进行反转录,得到cDNA;
所述总RNA进行反转录具体为用TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒,将提取得到的目标表型癌细胞和对应正常细胞的总RNA分别进行反转录。
步骤103:以步骤102得到的cDNA为模板,实时定量PCR计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平;
所述选定基因具体为人类基因组数据库中任何单个基因,当需要测量多个选定基因的mRNA相对转录水平时,分别测量每个选定基因的mRNA相对转录水平。
步骤104:根据步骤103的计算结果定位目标表型癌细胞的表型基因;
本发明对目标表型癌细胞中基因表达的实时定量PCR,通过比较癌细胞和对应正常细胞之间不同基因的mRNA相对转录水平之间的比较,根据细胞表型的差异由表型基因的活动状态决定的原理,筛选出决定癌细胞表型的表型基因。
实施例二
实施例一中步骤101提到对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取,这种总RNA提取可以有多种具体实现方式,只要这些方式能够分别提取细胞内全部的RNA即不妨碍本发明的发明目的的实现。比如可以使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus试剂盒对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取。由此可构成本发明的又一个实施例,参见附图2和附图3,本实施例二与实施例一相比,除步骤101外,其他步骤均相同。实施例一的步骤101在本实施例中变化为:
步骤201:使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus试剂盒对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取。
所述目标表型癌细胞具体指包括人胰腺癌细胞(PANC-1)在内的不同表型的癌细胞;所述对应正常细胞指与目标表型癌细胞相对应的正常细胞,包括人胰腺细胞(HPC-Y5);所述总RNA提取指提取细胞内的全部的RNA;所述RNAisoPlus用量为每10cm2的贴壁细胞1mL;所述步骤201具体为:
步骤2011:匀浆。倒出培养液,用杜氏磷酸缓冲液洗一次后,加入RNAisoPlus,水平放置片刻使细胞裂解,将裂解液移至无酶离心管中,反复吹吸至无明显沉淀,室温静置5分钟;
步骤2012:总RNA提取。向匀浆裂解液中加入氯仿(加入的量为RNAiso Plus体积的1/5),用手剧烈震荡15秒,室温静置5分钟。然后在4℃的条件下离心15分钟,离心机转速为12000rpm。将离心后的无色上清液移至新的无酶离心管中,向其中加入等体积的异丙醇,混匀后静置10分钟,然后在4℃、12000rpm的条件下离心10分钟,最后得到的下层沉淀物为总RNA;
步骤2013:总RNA清洗。使用75%的无水乙醇清洗总RNA;
步骤2014:总RNA溶解。将得到的总RNA在室温干燥2-5分钟,然后加入20uL的无酶水溶解总RNA。
实施例三
实施例一中步骤103提到以cDNA为模板,实时定量PCR计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平,这种计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平有多种方法,只要这些方法能计算选定基因的mRNA相对转录水平即不妨碍本发明发明目的的实现。实施例三与实施例一相比,除步骤103外,其他步骤均相同。参考附图4,实施例一的步骤103在本实施例中变化为:
步骤403:以cDNA为模板,实时定量PCR,将选定基因在对应正常细胞内转录mRNA的量定为1个基本单位,确定目标表型癌细胞中相同基因的mRNA相对转录水平。具体操作为:
分别以目标表型癌细胞和对应正常细胞的cDNA为模板,对内参基因和选定基因进行实时定量PCR扩增,每组实验重复测试3次,对目标基因进行实时定量PCR检测表达量,计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平。所述目标表型癌细胞内选定基因的mRNA相对转录水平计算方法为:将选定基因在对应正常细胞内转录mRNA的量定为1个基本单位,并以此确定目标表型癌细胞中相同基因的mRNA转录量。
实施例四
实施例一中步骤104提到,根据步骤103的计算结果定位目标表型癌细胞的表型基因,定位目标表型癌细胞的表型基因有多种方法,只要这些方法能计算选定基因的mRNA相对转录水平即不妨碍本发明发明目的的实现。比如可以比较目标表型癌细胞各个基因mRNA的相对转录水平,以目标表型癌细胞中相对转录水平最高的基因作为目标表型癌细胞表型基因。这样就构成了本发明的实施例四,参考附图5。实施例四与实施例一相比,除步骤104外,其他步骤均相同。实施例四的步骤104在本实施例中变化为:
步骤504:比较目标表型癌细胞各个基因mRNA的相对转录水平,以目标表型癌细胞中相对转录水平最高的基因作为目标表型癌细胞表型基因。
以PANC-1细胞为例,附图6提供了PANC-1中表达量最高的四种不同基因mRNA相对转录水平,通过比较四种不同基因mRNA相对转录水平定,根据本实施例所提供的方法,筛选出了决定PANC-1细胞表型的表型基因为STAT5B基因。
STAT5B基因在PANC-1中mRNA的相对转录水平达到了正常HPC-Y5的54倍,而其它几种基因的mRNA相对转录水平虽然较高,但是与STAT5B基因相比相对表达水平差距明显,所以确定STAT5B基因为PANC-1的表型基因。STAT5B是一个转录因子,能够对许多细胞因子、激素和生长因子产生影响,它通过调控基因转录的过程,影响细胞增殖的进程。
实施例五
实施例一的方法还可以包括构建癌细胞表型、表型基因和表型基因及癌细胞表型对应关系三者的文库,这就构成了本发明的实施例五。参考附图7,实施例五与实施例一相比,除增加了步骤705外,其他步骤均相同实施例一相同。
步骤705:构建癌细胞表型、表型基因和表型基因及癌细胞表型对应关系三者的文库。具体操作步骤为:
根据实施例一步骤104得到的目标表型癌细胞和表型基因对应的结果,构建癌细胞表型、表型基因和它们对应关系三者的文库。所述文库具体为癌细胞表型、表型基因以及对应关系三者的数据表格。表1为根据实施例四的结果构建的文库,可以在文库中根据癌细胞的表型快速地找到对应的表型基因以及对应关系,为癌细胞的针对性治疗提供便利。
表1细胞表型、表型基因以及它们对应关系三者的文库
以上仅为本申请的实施例而已,并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (9)
1.一种定位目标表型癌细胞中表型基因的方法,其特征在于,该方法包括:
对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取;
将所提取的总RNA进行反转录,得到cDNA;
以得到的cDNA为模板,实时定量PCR计算目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平;
根据目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平的计算结果定位目标表型癌细胞的表型基因。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述定位目标表型癌细胞的表型基因具体为:
比较目标表型癌细胞各个基因mRNA的相对转录水平,以目标表型癌细胞中mRNA的相对转录水平最高的基因作为目标表型癌细胞表型基因。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:根据目标表型癌细胞以及所定位的表型基因,构建癌细胞表型、表型基因和它们对应关系三者的文库;所述文库具体为癌细胞表型、表型基因以及对应关系三者的数据表。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,当获知癌细胞表型时,能够根据所述癌细胞表型在所述文库中快速查询表型基因,用于癌症的基因治疗。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述对目标表型癌细胞和对应正常细胞分别进行总RNA提取具体为:
使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus试剂盒分别提取目标表型癌细胞和对应正常细胞中全部的RNA。
6.如权利要求1和5中任何一项所述的方法,其特征在于,
所述目标表型癌细胞具体指:包括人胰腺癌细胞在内的不同表型的癌细胞;
所述对应正常细胞指:与目标表型癌细胞相对应的正常细胞,包括人胰腺细胞。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述反转录具体为:
用TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒,将提取得到的目标表型癌细胞和对应正常细胞的总RNA分别进行反转录。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述目标表型癌细胞中选定基因的mRNA相对转录水平计算方法为:将选定基因在对应正常细胞中转录mRNA的量定为1个基本单位,并以此确定目标表型癌细胞中相同基因的mRNA转录量;
所述选定基因为人类基因组数据库中任何单个基因。
9.如权利要求1至8中任何一项所述的方法,其特征在于,所述表型基因指通过精确协调的活动而维持细胞特定表型的基因,癌细胞表型基因的mRNA高相对转录水平造成了癌细胞与正常细胞的差别。
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任晓律: "表观遗传调控对人胰腺癌细胞PANC-1增殖和基因表达的影响", 《万方数据知识服务平台》 * |
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