CN106461660B - 使用疏水性收集材料的内生孢子检测 - Google Patents

使用疏水性收集材料的内生孢子检测 Download PDF

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Abstract

当内生孢子存在于光学活性载体介质中时，可以抑制细菌内生孢子的原位光学分析。为了帮助将内生孢子与载体介质分离，在一些实施例中，载体介质穿过疏水性材料，其通过疏水性吸引捕获内生孢子。随后，可将萌发流体和镧系元素源例如铽加入捕获在疏水性材料上的细菌内生孢子中，以在萌发流体中形成镧系元素‑吡啶(‑2,6‑)二羧酸络合物。然后可以通过测量镧系元素‑吡啶(‑2,6‑)二羧酸络合物的荧光响应来确定载体介质中细菌内生孢子的浓度，从而光学分析萌发流体。

Description

使用疏水性收集材料的内生孢子检测
技术领域
本公开涉及细菌内生孢子分离和分析。
背景
细菌孢子通常被认为是用于验证无菌性(sterility)的指示剂物种(indicatorspecies)，因为它们是针对灭菌方案的最有恢复力(resilient)的生命形式。传统的细菌孢子分析是劳动密集和耗时的过程。例如，孢子分析可以涉及热激活，连续稀释，在合适的生长培养基上铺板，和孵育两至三天，直到可以进行计数。该分析过程可能需要几天时间，要求进行分析的产品的制造商在接收无菌性测试结果之前持有显著量的产品，所述无菌性测试结果允许制造商将产品投放到市场。此外，在存在无菌性问题的情况下，缺乏实时信息可能导致消耗几天以确认产品超出规范，并且需要被丢弃或重新使用。
在提供更快分析的尝试中，设计者已经利用光学分析技术，所述光学分析技术检测与细菌孢子相关的光学发射信号，然后将这些信号与孢子计数相关联。然而，这些技术对于需要分析细菌孢子计数的许多类别的材料具有有限的用途。例如，含有少量细菌孢子或在光学干扰与孢子相关的发射的周围流体内含有细菌孢子的材料可能难以使用光学分析技术来评价。作为一个实施例，监测其产品中的细菌孢子计数的乳制品生产设施(facilities)通常不能使用光学发射分析技术。这是因为乳制品中的蛋白质和其他分子可以光学干扰细菌孢子产生的发射。
概要
一般而言，本公开涉及用于分析流体内的细菌内生孢子的技术和系统。根据应用，含有细菌内生孢子的流体可以是或可以不是光学活性的，使得内生孢子的周围流体光学地干扰对应于内生孢子的光学发射。在任一情况下，流体可以通过疏水筛以帮助将内生孢子与周围流体分离。疏水筛可以由疏水性材料制成并且具有允许基本上所有流体穿过疏水筛的多孔结构。由于当流体穿过筛时，包含在流体内的内生孢子接近疏水性材料，内生孢子可以通过疏水性吸引力粘附到疏水筛的表面。围绕内生孢子的流体可以继续穿过疏水筛。以这种方式，细菌内生孢子可以基本上与载流体分离。
一旦从周围载流体分离，通过疏水性吸引力在疏水筛的表面上捕获的细菌内生孢子可以被处理以定性和/或定量评价流体内的内生孢子的特征。在一些实施例中，疏水筛用光学惰性冲洗流体例如水冲洗以从细菌内生孢子中除去残余的载流体。另外或可选地，可以向疏水筛中加入萌发流体以使捕获的细菌内生孢子萌发，并从孢子核释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)。当将镧系元素离子源加入萌发流体中时，镧系元素离子可以与DPA结合以形成当光学激发时发荧光的镧系元素-DPA络合物。该荧光可以被检测并与由疏水筛捕获的细菌内生孢子的浓度相关，由疏水筛捕获的细菌内生孢子的浓度又可以与原始载流体中的细菌内生孢子的浓度相关。
由于各种原因，使用疏水性材料例如疏水筛，帮助从周围流体中分离细菌内生孢子是有用的。在周围流体具有光学活性的情况下，疏水性材料可以帮助将细菌内生孢子与光学活性流体分离。这可以去除否则会在细菌内生孢子光学分析期间干扰镧系元素-DPA络合物产生的发射的光学发射源。作为另一个实施例，疏水性材料可用于增加可用于分析的细菌内生孢子的浓度，这可增加可分析的细菌内生孢子浓度的范围和/或减少与低内生孢子浓度流体相关的误差效应。例如，由疏水性材料捕获的内生孢子的数量可以与穿过材料的流体的体积成比例。在这些应用中，可用于分析的细菌内生孢子的浓度可以通过增加通过(passed over)疏水性材料的载流体的体积而增加。然后可以通过控制加入疏水性材料中的萌发流体的量来控制可用于随后的光学分析的细菌内生孢子的浓度。当加入疏水性材料中的萌发流体的体积小于穿过材料的载流体的体积时，与原始载流体中的浓度相比，细菌内生孢子的浓度可以增加以用于随后的光学分析。当分析具有相对低浓度的细菌内生孢子的流体时，这可能是有帮助的。
在一个实施例中，描述了一种方法，其包括使含有细菌内生孢子的流体穿过疏水性收集材料，从而在疏水性收集材料上收集细菌内生孢子。该方法还包括从收集的细菌内生孢子释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并将镧系元素源加入从收集的细菌内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸以形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。该方法还包括基于镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的光学响应来确定流体中的细菌内生孢子的浓度。
在另一个实施例中，描述了一种系统，其包括待评价的含水液体，萌发流体，镧系元素源，疏水性收集材料和光学传感器。疏水性收集材料构造成接收含水液体并从其中捕获细菌内生孢子，接收萌发流体以从捕获的细菌内生孢子释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并接收镧系元素源以在萌发流体中形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。光学传感器被构造为将光能发射到萌发流体中，从而从镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物产生光学发射，检测由镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发射的光学发射，并由此确定含水液体中细菌内生孢子的浓度。
在另一个实施例中，描述了一种方法，其包括使含水液体穿过疏水筛，从而通过疏水筛和细菌内生孢子之间的疏水性吸引在疏水筛的表面上捕获存在于含水液体中的细菌内生孢子。该方法包括向疏水筛添加萌发流体，以从在疏水筛上捕获的细菌内生孢子中释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并提供镧系元素源以与从在疏水筛上捕获的细菌内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸形成萌发流体中镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。该方法还包括对萌发流体进行荧光分析以确定含水液体中细菌内生孢子的浓度。
在附图和下面的描述中阐述了一个或多个实施例的细节。根据说明书和附图以及根据权利要求，其它特征，目的和优点将是显而易见的。
附图简要说明
图1是说明用于从被评价的流体捕获和分析细菌内生孢子的实施例过程的流程图。
图2是实施例系统的概念图，所述实施例系统可用于根据图1的实施例技术来确定流体中的细菌内生孢子计数。
图3是显示通过使乳样品穿过疏水性材料制备的流体的实施例光学响应的图。
图4是显示所捕获的内生孢子的实例数量与实施例疏水性材料的表面积的图。
图5是显示在使乳通过材料之后在1毫米的分辨率下的一种实施例疏水性材料的显微照片。
图6是图5的显微照片的100倍放大图，其显示内生孢子粘附到材料的表面。
详细说明
本公开一般涉及来自其中携带内生孢子的流体的细菌内生孢子的分离，浓缩和分析。在一些实例中，细菌内生孢子包含在光学活性流体中，所述流体在与从细菌内生孢子释放的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发射的波长重叠的波长内发射光学发射。这由于光学干扰可以阻止载流体内的细菌内生孢子的直接原位光学分析。在根据本公开的一些实施例中，载流体穿过疏水性收集材料以帮助将细菌内生孢子与剩余的载流体分离。疏水性收集材料可以是载流体流过的多孔筛，定位成与载流体接触的疏水性材料片，或者例如通过疏水性吸引力吸引并保持细菌内生孢子的另一结构。不管结构如何，疏水性收集材料可以从载流体中捕获和收集细菌内生孢子。
可以使用多种不同的技术分析从周围载流体收集的细菌内生孢子。在一些实施例中，将萌发流体加入疏水性收集材料中以使收集的细菌内生孢子萌发，并从内生孢子中释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)。可以将镧系元素离子试剂加入萌发流体中以形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。当用适当波长的光照射时，该镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物可以发射可以被检测和定量的荧光。镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发射的光的大小和/或波长对应于萌发流体中的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的浓度，其反过来对应于载流体中的细菌内生孢子的浓度。
用于分离、浓缩和/或分析细菌内生孢子的所公开的系统和技术可以与可以含有细菌内生孢子的任何所需流体一起使用。可以使用该系统和技术的实施例工业包括食品工业，饮料工业，制药工业，化学工业，保健工业，水净化工业以及其他针对细菌内生孢子检查材料的工业。在食品和饮料工业的情况下，可以分析细菌内生孢子的流体包括从哺乳动物可消费的(例如，人类可消费的)食品和饮料获得的那些，例如但不限于乳制品(例如，生奶，全脂和脱脂乳，炼乳，奶油(cream)，乳清和乳清衍生物，酪乳)，汁(例如果汁，例如橙子和其他柑橘属果汁，苹果汁和其他苹果类(pomaceous)果汁，红莓(red berry)果汁，椰子乳和热带水果果汁，蔬菜汁例如番茄汁，甜菜根汁，胡萝卜汁，和草汁)，和罐装食品(例如罐装水果，罐装蔬菜，罐装肉)。可能产生需要分析的内生孢子的细菌的类型包括但不限于，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)，魏登施泰芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)，脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，难辨梭菌(Clostridium difficile)和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。
通常，包含用于分析的细菌内生孢子的流体将是液体，例如含水液体(例如，水基液体)，但是也可以使用系统和技术来评价含有细菌内生孢子的气体载流体。流体可以直接从分析中的产品样品获得，或者可以通过将产品样品与载流体组合以从样品提取细菌内生孢子而形成。例如，在潜在地含有细菌内生孢子的产品样品是固体的情况下，可以将固体研磨或与载流体混合以提取细菌内生孢子用于分析。
术语细菌内生孢一般是指在细菌内产生的内生孢子。术语内生孢子不包括分生孢子(conidio spore)和真菌的子囊孢子(ascospores)。内生孢子通常是非生殖结构，其主要功能是确保细菌在环境应激(environmental stress)期间的存活。内生孢子可以耐受极端的干旱，热和饥饿。它们受到蛋白质和碳水化合物的硬壳的保护，并且通过细菌中的二分裂形式产生。内生孢子可以包含其亲本细菌的DNA，核糖体和大量的吡啶(-2,6-)二羧酸。例如，吡啶(-2,6-)二羧酸可以占内生孢子干重的大于5重量％，例如至少10重量％或至少15重量％，例如5重量％至20重量％，或7重量％至16重量％。吡啶(-2,6-)二羧酸是被认为帮助内生孢子维持其休眠的化学品。
因为内生孢子可以在恶劣环境中存活并且对于灭菌方案是有恢复力的，所以内生孢子可以是用于验证产品无菌性的良好指示剂物种。产品样品内不存在内生孢子和/或产物内低含量内生孢子的检测可表明产品对于市场释放是合适地无菌的。尽管这样的信息对于各种产品是有用的，但是该信息对于可消费产品(例如可摄入的食物和饮料)可能是特别有价值的。事实上，在将产品出售给公众之前，政府监管制度可能要求遵守某些无菌性标准。根据本公开的一些实施例，基本上实时地测量产品内的内生孢子计数的能力可以使制造商能够基本上实时地监视他们的产品的质量，并且如果检测到无菌性问题，则快速响应。
图1是说明用于从被评价的流体捕获和分析细菌内生孢子的实施例过程的流程图。该方法包括使待评价的流体穿过疏水性材料(10)，从而例如通过疏水性吸引力将内生孢子捕获在疏水性材料的表面上，从流体收集细菌内生孢子。在从流体捕获细菌内生孢子后，任选冲洗(12)细菌内生孢子以除去光学干扰载流体，然后处理细菌内生孢子以释放吡啶(-2,6-)二羧酸(14)。此外，将镧系元素离子源加入吡啶(-2,6-)二羧酸(16)中以形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物，然后可以对镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物进行光学分析(18)以确定所评价的流体中的细菌内生孢子的浓度。如下面更详细地描述的，多种不同的处理参数和条件可以用于利用图1的实施例过程来捕获和分析细菌内生孢子。
为了从被评价的流体中浓缩和/或分离细菌内生孢子，流体可以通过疏水性材料(10)。参照图2更详细地描述了可用于浓缩和/或分离内生孢子的疏水性材料的实施例。然而，一般来说，疏水性材料可以是被选择为选择性地与被分析的流体中的内生孢子结合的材料或材料的组合，同时所述材料或材料的组合允许携带内生孢子的周围流体穿过疏水性材料而不结合。当这样构造时，存在于被分析的流体中的内生孢子可以附着到疏水性材料的表面，而流体的剩余部分继续穿过疏水性材料而不粘附。这可以允许存在于被分析的流体中的内生孢子聚集在疏水性材料的表面上，就此从周围载流体中浓缩并分离内生孢子。
疏水性收集材料可以是疏水性的，因为其不结合或吸收水。例如，疏水性收集材料可以排斥极性分子，例如水和可溶于水的分子，同时允许至少一些类型的非极性分子结合到材料的表面。非极性分子可以通过疏水性吸引粘附到疏水性材料的表面。具有极性和非极性官能团的分子可以或可以不粘附于疏水性材料，例如，取决于所使用的材料的疏水性、将极性官能团与非极性官能团分开的碳链的长度、和/或分子的净极性。
当使用时，疏水性收集材料可以通过疏水性吸引从通过材料的流体中捕获并收集内生孢子。由于含有内生孢子的流体穿过疏水性收集材料，因此内生孢子可以在疏水性收集材料的表面附近通过并且在一些实施例中与疏水性收集材料的表面接触。由于存在于流体内的细菌内生孢子可以是非极性的和/或含有非极性官能团，因此内生孢子可以吸引并附着到疏水性材料的表面。这些内生孢子可以通过疏水性吸引力(例如熵界面力)结合到疏水性材料的表面。这些力的大小可以取决于相互作用基团(例如，内生孢子和疏水性材料)的疏水性以及间隔它们的距离。在一些实施例中，疏水力随着间隔距离的减小而近似指数地增加。
围绕内生孢子的载流体可以继续穿过疏水性收集材料，而不结合到材料的表面。例如，当载流体是含水流体时，疏水性材料可以排斥存在于载流体中的极性水分子，导致载流体流过(flow past)疏水性材料而不附着到材料的表面。以这种方式，疏水性材料可以捕获经过材料的流体样品中的内生孢子，并在表面材料上收集内生孢子，产生积累的大量内生孢子以用于随后的分析。在不同的实施例中，已经穿过疏水性材料的流体可以被处置或再循环并且再次穿过疏水性材料。例如，流体可以穿过疏水性材料两次，三次或更多次，以增加疏水性材料从流体中收集的内生孢子的数量。
穿过疏水性材料的流体体积可以变化，例如，取决于所使用的疏水性材料的尺寸和被分析的样品中内生孢子的预期浓度。在一些实施例中，穿过疏水性材料的流体体积等于或大于疏水性材料本身的体积。例如，穿过疏水性材料的含有内生孢子的流体的体积可以是疏水性材料本身的体积的至少10倍，例如材料体积的至少100倍，材料体积的至少1000倍或材料体积的至少10,000倍。通常，增加穿过疏水性材料的流体的体积增加了捕获在材料表面上并可用于分析的内生孢子的数量。
可以使用各种不同的技术使被分析的流体穿过疏水性收集材料(10)。在一些实施例中，将疏水性收集材料浸入或浸渍入含有被分析的流体的储存器中，然后从储存器中取出，以提供疏水性结合在材料表面上并可用于分析的内生孢子。在其它实施例中，移动的流体流流动穿过疏水性材料的表面，允许流体流中的内生孢子附着到材料的表面，而流体的剩余部分继续流动通过和远离疏水性材料。在这样的实施例中，被分析的流体流可以大致平行于疏水性材料的平面表面和/或通常横向于(例如，垂直于)疏水性材料的平面表面。例如，在关于图2更详细地描述的一些构造中，疏水性材料可以是具有孔的多孔材料，孔的尺寸允许基本上所有被分析的流体流动穿过材料。当这样构造时，被分析的流体可以一般地致横向于疏水性材料的外表面流动。内生孢子可以在材料的孔内聚集，而流体的剩余部分继续流动穿过材料并在疏水性材料的相对侧上排出。
与用于收集细菌内生孢子的疏水性材料的具体构造无关，图1的实施例技术包括任选地用冲洗流体(12)冲洗收集的内生孢子。在使待评价的流体穿过疏水性材料(10)之后，可以终止流体流(例如其中流体流动穿过材料)，以留下在其表面上具有收集的内生孢子的疏水性材料。这种疏水性材料还可以包含携带内生孢子的残留流体，例如被捕获在收集材料的表面上和/或材料的孔内(在材料是多孔的情况下)的收集的内生孢子之间和周围的流体。在一些应用中，如果在分析前流体没有从内生孢子中除去，则该残留流体可以光学干扰内生孢子的后续光学分析。例如，携带内生孢子的流体可以在范围从250纳米(nm)至300nm的波长内的光撞击流体时发射荧光发射。由载流体发射的这些发射可以在300nm至700nm的波长范围内，其可以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发出荧光的例如450nm至650nm的波长重叠。结果，来自载流体的这些发射可能掩盖和/或扭曲与内生孢子相关的发射，抑制内生孢子的准确量化。
为了帮助从内生孢子中除去这种污染流体，可以用冲洗流体冲洗附着到疏水性材料的内生孢子。冲洗流体可以是光学惰性的，例如使得残留在内生孢子上的残留冲洗流体不干扰内生孢子的随后的光学分析。在一个实施例中，冲洗流体是或包括液体水(例如蒸馏水)。
在不同的实施例中，可以通过将含有孢子的疏水性材料浸渍入含有冲洗流体的储存器中和/或使移动的冲洗流体流穿过疏水性材料的表面和其上含有的内生孢子，冲洗疏水性材料。当疏水性材料构造为多孔材料时，加压的冲洗流体流可以穿过材料(例如，一般地横向地)，漂洗来自内生孢子周围和来自材料的孔的残余的载流体。在实践中，捕获在疏水性材料的表面上的一些内生孢子可以释放到冲洗流体中。然而，当例如通过在校准运行和后续操作之间在一致的压力条件下使用一致量的冲洗流体、校准技术时，可以考虑这些损失的内生孢子。
当进行冲洗时，通过收集的内生孢子和/或穿过疏水性材料的冲洗流体的量可以变化，例如，基于被分析的样品中的内生孢子的浓度和载流体的光学干扰影响。在一些实施例中，穿过疏水性材料和在其上收集的内生孢子的冲洗流体的体积至少等于最初穿过疏水性材料的评价的流体的体积。例如，如果等于“X”的体积的含有内生孢子的液体穿过疏水性收集材料，则疏水性材料可随后用大于或等于“X”的冲洗流体体积冲洗，例如大于或等于1.5倍“X”、大于或等于2倍“X”或在“X”和5倍“X”之间的冲洗流体体积。作为一个具体和非限制性实施例，如果50毫升含有内生孢子的流体穿过疏水性材料，当使用2倍“X”的冲洗流体比时，该材料可随后用100毫升冲洗流体冲洗。在一些实例中，使用足以从内生孢子除去基本上所有(以及，在其它实例中，全部)光学干扰载流体的冲洗流体体积。
在从所评价的流体捕获细菌内生孢子并任选地冲洗含有捕获的内生孢子的疏水性材料以除去光学干扰载流体(12)之后，图1的技术包括处理内生孢子以释放吡啶(-2,6-)二羧酸(14)。吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA，2,6-吡啶二羧酸)通常以高浓度(例如，约1摩尔％或约15％干重％)存在于内生孢子核中，通常为与Ca2+的1:1络合物。吡啶(-2,6-)二羧酸也是具有以下特征的商购可得的产品：CAS#：499-83-2，同义词：2,6吡啶二羧酸，分子式：C7H5NO4，分子量：167.12，说明：白色结晶粉末，硫酸灰分：最大0.3％，水分含量：最大0.5％，熔点：242.0至245.0℃。因为吡啶(-2,6-)二羧酸是与细菌内生孢子唯一相关的指示剂，所以样品中吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度可以指示样品中内生孢子的数量。
为了检测和定量根据图1的实施例技术的样品中存在的吡啶(-2,6-)二羧酸，收集在疏水性材料的表面上的细菌内生孢子可以原位加工以从孢子的核释放吡啶(-2,6-)二羧酸。在一些实施例中，将萌发流体加入收集在疏水性材料表面上的内生孢子中，例如使内生孢子转化为营养细胞并释放吡啶(-2,6-)二羧酸。萌发涉及休眠的内生孢子开始代谢活动，从而打破冬眠。它通常包括孢子外被的破裂或吸收，内生孢子的膨胀，代谢活性的增加和对环境应激的抗性的丧失。单独或与加热组合的萌发流体的添加可以引起内生孢子的萌发。
在一些实施例中，图1的技术包括向包含捕获的内生孢子的疏水性材料中加入萌发流体以释放吡啶(-2,6-)二羧酸(14)。在不同的实施例中，可以通过将含有孢子的疏水性材料浸渍入含有萌发流体的储存器中和/或使移动的萌发流体流穿过疏水性材料的表面和其上含有的内生孢子，将萌发流体加入在疏水性材料上捕获的内生孢子。当疏水性材料构造为多孔材料时，加压的萌发流体流可以穿过材料(例如，一般地横向地)，使在疏水性材料的表面上收集的内生孢子(例如，材料的外表面和孔壁)暴露于萌发流体。用于释放吡啶(-2,6-)二羧酸的实施例萌发流体包括但不限于L-丙氨酸，L-天冬酰胺，D-葡萄糖，L-半胱氨酸，十二烷基胺和混合物AGFK(含有D-葡萄糖，D-果糖，KCl和L-天冬酰胺)。
当使用时，加入疏水性材料中以引发捕获在材料上的内生孢子的萌发的萌发流体的量可以变化。在一些实施例中，加入疏水性材料和在其上收集的内生孢子的萌发流体的体积小于最初穿过疏水性材料的评价的流体的体积。例如，如果含有等于“X”的内生孢子的液体体积穿过疏水性收集材料，随后加入疏水性材料和在其上包含的内生孢子的萌发流体的量可以小于“X”，例如小于0.5倍“X”，小于0.2倍“X”或小于0.05倍“X”的冲洗流体的体积。例如，加入疏水性材料中的萌发流体的体积可以为0.001倍“X”至0.5倍“X”，例如0.01倍“X”至0.2倍“X”或0.025倍“X”至0.1倍“X”。作为一个具体且非限制性实施例，如果50毫升含有内生孢子的流体穿过疏水性材料，则当使用0.1倍“X”的萌发流体比时，可以将5毫升萌发流体加入疏水性材料中(例如，在用任何前述体积的冲洗流体任选地冲洗材料后)。
可以捕获和/或保留加入疏水性材料和在其上收集的内生孢子的萌发流体，用于随后的光学分析。相比之下，在沉积内生孢子和/或冲洗流体之后通过和/或穿过疏水性材料的残留样品流体可以在交叉疏水性材料之后处置。因此，与使用较大体积的萌发流体相比，向疏水性材料添加较小体积的萌发流体可增加萌发流体中的内生孢子和/或吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度，其用于随后的分析。这在分析具有相对低浓度的细菌内生孢子的流体时，可能是有帮助的。
在一些实施例中，萌发流体在加入疏水性材料之前和/或当含有内生孢子的疏水性材料浸渍入萌发流体中时被加热。例如，包含捕获的内生孢子的疏水性材料可以浸没在萌发流体中，或者可以将含有内生孢子的疏水性材料的孔隙用萌发流体饱和，然后进行热休克。加热萌发流体可以帮助引发内生孢子的萌发并加速吡啶(-2,6-)二羧酸的释放。在一些实施例中，将萌发材料加热至75摄氏度至90摄氏度的温度，例如，加热15分钟至30分钟的时间。
除了向细菌内生孢子添加萌发流体之外或代替向细菌内生孢子中添加萌发流体，内生孢子可以通过用核壁破裂力冲击内生孢子而被破坏性裂解。实施例裂解方法包括但不限于：微波，等离子体清洗，干加热，高压灭菌，超声处理和氯化氢气体处理。裂解可破坏内生孢子的核，释放吡啶(-2,6-)二羧酸。
图1的实施例技术还包括向从捕获的内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸中加入镧系元素离子源以形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物(16)。吡啶(-2,6-)二羧酸是以高亲和力结合金属离子的化学配体。一旦结合，吡啶(-2,6-)二羧酸络合物可以在UV激发下发射强烈的绿色荧光。这种荧光的大小可以与吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度相关，吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度又可以与被分析的样品中存在的内生孢子的数量相关。
可以将镧系元素离子源加入从捕获在疏水性材料上的内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸中，以形成发荧光的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。可以加入吡啶(-2,6-)二羧酸中的实施例镧系元素离子包括但不限于：铽(Tb3+)，铕(Eu3+)和镝。在一个实施例中，使用铽(Tb3+)离子，导致铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的形成。通常，将过量的镧系元素离子加入吡啶(-2,6-)二羧酸中，其足以络合样品中存在的所有吡啶(-2,6-)二羧酸分子。
为了向从收集在疏水性材料上的内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸中加入镧系元素离子，可以将镧系元素离子引入到萌发流体或其他流体(例如，当进行破坏性裂解时)，萌发流体或其他流体含有或将含有吡啶(-2,6-)二羧酸酸。在一个实施例中，在将萌发流体引入捕获在疏水性材料上的内生孢子之前，将镧系元素离子加入萌发流体中。在这种应用中，镧系元素离子可以与吡啶(-2,6-)二羧酸络合，因为酸在萌发期间从内生孢子释放。在另一个实施例中，在内生孢子萌发并释放其吡啶(-2,6-)二羧酸、例如形成含有释放的吡啶(-2,6-)二羧酸的萌发流体后，将镧系元素离子加入萌发流体中。因此，尽管图1示出了在从捕获的内生孢子(14)中释放吡啶(-2,6-)二羧酸后作为单独的步骤添加镧系元素离子(16)的实施例技术，应当理解，镧系元素离子可以存在于萌发流体中，使得离子被加入并与吡啶(-2,6-)二羧酸合并，因为它在单个步骤中从内生孢子释放。
图1的技术还包括对包含镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体进行光学分析，并由此确定被评价的流体(18)中的细菌内生孢子的浓度。镧系元素离子的荧光的特征在于长的寿命(例如，0.1至1毫秒)，小的消光系数和窄的发射带。窄的发射带出现，因为将化合价f轨道通过外s和p电子与环境屏蔽，并且由于防止了发射激发态和基态之间的转变而出现长寿命/小消光系数。因此，由于小的吸收截面，镧系元素离子的直接激发导致弱的荧光。然而，有机发色团(如吡啶(-2,6-)二羧酸)与镧系元素离子的配位触发强烈的镧系元素荧光。吡啶(-2,6-)二羧酸用作光收集中心，并且具有下坡能量学的强电子耦合允许以吡啶(-2,6-)二羧酸为中心的激发能量被有效地转移到镧系元素离子，其随后发出亮绿色荧光。
在一个实施例中，使用荧光计对萌发流体或含有镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的其它流体进行光学分析。荧光计将光发射到被分析的流体中，并且响应于接收发射的光，镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发射荧光发射。荧光发射可以处于与由荧光计发射到含有镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体中的光的波长不同的波长。荧光计可以检测荧光发射并基于光学响应确定吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度。
在另一个实施例中，使用分光光度计对萌发流体或含有镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的其它流体进行光学分析。分光光度计将一个或多个特定波长的光发射到含有镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体中，并检测在那些一个或多个波长的穿过流体的光的量。流体样品吸收的光的量可以与样品中镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的浓度成比例。
与所使用的技术无关，包含镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体的光学响应可以与流体中吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度成比例。反过来，该吡啶(-2,6-)二羧酸与捕获在疏水性材料上的内生孢子的浓度成比例，所述捕获在疏水性材料上的内生孢子的浓度进一步与被分析的原始流体样品中的内生孢子的浓度相关。因此，含有镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体的光学响应可以与校准数据一起使用，以确定被分析的原始流体样品中的内生孢子的浓度。
图2是根据图1的实施例技术可用于确定流体中的细菌内生孢子计数的实施例系统20的概念图示。系统20可以实现为在线监测站，以连续监测正在处理的流体中的细菌内生孢子计数。或者，系统20可离线实现，例如在实验室环境中，以周期性地确定离散流体样品中的细菌内生孢子计数。系统20被示出为包括待评价的含水液体源22，任选的冲洗流体源24，萌发流体源26和镧系元素离子源28。系统20还包含疏水性材料30。疏水性材料30可以接收来自液体源22的含水液体，来自源24的冲洗流体，来自源26的萌发流体，以及来自源28的镧系元素离子。例如，疏水性材料30和/或包含该材料的壳体可经由将流体输送到疏水性材料的导管而流体连接到不同的源。在其他实施例中，疏水性材料30和/或包含该材料的壳体可以通过手动转移接收流体，例如由实验室技术人员执行的手动转移。
在操作中，疏水性材料30可以从含水液体源22接收液体并从液体中捕获细菌内生孢子。当液体流动经过和/或穿过材料时，细菌内生孢子可疏水地结合并聚集在疏水性材料30的表面上。结果，已经穿过疏水性材料30的残留液体可以具有比来自源22的液体更低的内生孢子浓度(例如，可以基本上没有内生孢子)。这种具有减少的内生孢子数量的残留液体在穿过疏水性材料30或在循环回来穿过材料后可以被处置至排液装置32。
在终止来自液体源22的液体流之后，疏水性材料30可以具有收集并保持在其表面上的内生孢子。如果需要，疏水性材料30可以随后从冲洗流体源24接收冲洗流体。冲洗流体可以流动穿过疏水性材料30的表面和经过捕获在材料表面上的内生孢子上，例如帮助从内生孢子中除去光学干扰液体，为随后的光学分析做准备。已经穿过疏水性材料30并且含有残留载体液体(例如，光学干扰液体)的冲洗流体可以处置到排液装置32。在其他应用中，疏水性材料30在光学分析之前不用冲洗流体冲洗，因此，系统20不包括冲洗流体源24。
在终止来自冲洗流体源24(当使用时)的冲洗流体的流动之后，疏水性材料30可以接收来自萌发流体源26的萌发流体。在一个实施例中，萌发流体流动穿过疏水性材料30的表面并经过被捕获在材料的表面上的内生孢子，例如，收集在疏水性材料下游的储存器中。在另一个实施例中，将萌发流体引入含有疏水性材料30的壳体中，导致疏水性材料和其上收集的内生孢子部分或完全浸渍入萌发流体中。这可以允许由疏水性材料30捕获的内生孢子原位萌发，同时保留在材料的表面上。如上面关于图1所讨论的，内生孢子可以在萌发期间释放吡啶(-2,6-)二羧酸，增加萌发流体中吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度(例如，从为零的原始浓度)。
为了确定加入疏水性材料30中的萌发流体中的吡啶(-2,6-)二羧酸的浓度，以及作为结果，含水液体源22中的内生孢子的浓度，将镧系元素离子加入来自镧系元素离子源28的富含吡啶(-2,6-)二羧酸的萌发流体中。在一个实施例中，将镧系元素离子加入富含吡啶(-2,6-)二羧酸的萌发流体中，而疏水性材料30部分或完全浸渍在萌发流体中。在另一个实施例中，在例如通过将材料下游的流体排出、除去疏水性材料30之后，将萌发流体加入富含吡啶(-2,6-)二羧酸的萌发流体中。在另一个实施例中，镧系元素离子不与萌发流体分开添加，而是在被疏水性材料30接收之前与萌发流体混合，以便提供萌发流体和镧系元素离子两者的单一来源。镧系元素离子可以与从内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸结合以形成光学活性的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。
在图2的实施例中系统20还包含光学传感器34和控制器36。光学传感器34被构造为接收并光学分析包含由从疏水性材料30捕获的内生孢子产生的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的萌发流体。光学传感器34可包含一个或多个光学发射器和一个或多个光学检测器。在操作中，一个或多个光学发射器将光引导到包含镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体中，并且一个或多个光学检测器检测由流体产生的荧光发射，特别是包含在流体内的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物产生的荧光发射。引导到流体中的光可以通过激发镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的电子而产生荧光发射，使得分子发射能够被光学检测器检测到的能量(即，荧光)。在一些实施例中，一个或多个光学发射器以一个频率(例如，紫外线频率)将光引导到流体中，并使镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物以不同的频率(例如，可见光频率，不同的紫外线频率)发射光能量。
例如，光学传感器34可以包括发射紫外线(UV)光谱内的光的一个或多个光学发射器，例如在从大约250nm到大约300纳米的范围内的波长内。例如，一个或多个光学发射器可以在从270nm到280nm的波长内发射。响应于该发射的光，流体内的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物可以在450nm至650nm的波长下产生荧光发射。光学传感器34的一个或多个光学检测器可以检测由发荧光的镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物在这些波长发射的能量。
控制器36可以控制一个或多个光学发射器以将辐射引导到包含镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的流体中，并且还控制一个或多个检测器以检测由流体发射的荧光发射。在一些实施例中，控制器36(或系统20内的另一控制器)处理光检测信息以确定被分析的原始含水液体中的内生孢子的浓度或计数。例如，控制器36可以通过比较以下来确定被分析的含水液体中的内生孢子的浓度或计数：从具有未知浓度或计数的内生孢子的源液体制备的萌发流体、由一个或多个光学检测器检测的荧光发射的大小与从具有已知浓度或计数的内生孢子的萌发流体、由光学检测器检测的荧光发射的大小。未知流体可以使用与用于制备校准流体的方法相同或基本相同的方法来制备。例如，相同体积的未知源流体可以穿过疏水性材料30，如用于产生校准流体，随后使用相同体积的冲洗流体，萌发流体和镧系元素离子源。校准信息可以存储在与控制器36相关联的非暂时性计算机可读存储介质中。
在一些实施例中，控制器36管理系统20的整体操作。控制器36可以通信地耦合到系统20内的各种组件，例如经由有线或无线连接，以便发送和接收电子控制信号和在控制器36和通信耦合的组件之间的信息。例如，控制器36可以电子地开动系统20内的阀和/或控制泵，以控制不同流体向和从疏水性材料30的移动。控制器36可以包括处理器和存储器。存储器可以存储由控制器使用或生成的软件和数据。存储器可以包括计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)，只读存储器(ROM)，非易失性随机存取存储器(NVRAM)，电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)，嵌入式动态随机存取存储器(eDRAM)，静态随机存取存储器(SRAM)，闪速存储器，磁性或光学数据存储介质。存储器可以是或可以不是可移除的。在本公开中，处理器可以运行存储在存储器中的软件以执行归属于光学传感器34和控制器36的功能。处理器可以包括一个或多个处理器，例如一个或多个微处理器，数字信号处理器(DSP)，专用集成电路(ASIC)，现场可编程门阵列(FPGA)，可编程逻辑电路等，前述是单独的或以任何合适的组合形式存在。
如上面关于图1所讨论的，疏水性材料30可以与被分析的流体中存在的内生孢子疏水结合，以从内部流体的剩余部分浓缩和/或分离内生孢子。疏水性材料30可以具有各种不同的构造，并且可以用作其上捕获并萌发内生孢子的支撑表面。在一些实施例中，疏水性材料30是非多孔(例如，基本上无孔)材料。当这样构造时，含有内生孢子的流体可以穿过无孔材料的外表面并且被收集在肠内表面(enteral surface)上。在其他实施例中，疏水性材料30是具有空隙空间的多孔材料，液体可以通过该空隙空间穿过材料的横截面。在这些构造中，含有内生孢子的流体可以穿过疏水性材料的外表面和/或材料的内表面，所述表面结合并限定提供材料孔隙率的空隙空间。
多孔疏水性材料可用于增加可用于通过疏水性吸引将内生孢子从被分析的流体中捕获出来的表面积的量。通常，增加含有内含子的流体通过的疏水性材料30的表面积增加了流体中的内生孢子将疏水地结合到材料并与剩余流体分离的可能性。携带内生孢子的剩余部分可以由水和其它极性分子组成，可以继续流动穿过材料的孔或空隙空间，并在材料的相对侧排出。以这种方式，内生孢子可以粘附到限定疏水性材料30的各种孔的壁表面，而剩余的载流体流动穿过该材料，分离和集中内生孢子。
当使用多孔材料实现疏水性材料30时，材料的孔可以尺寸足够大以允许被分析的流体中的基本上所有(以及在其他实施例中，所有颗粒)流动穿过材料的孔。例如，疏水性材料30的孔可以大于通过疏水性吸引从被分析的流体捕获的内生孢子。换句话说，代替用作通过尺寸排阻分离内生孢子的过滤器，疏水性材料30的孔可以足够大以允许内生孢子穿过疏水性材料。疏水性材料30和内生孢子之间的疏水性吸引力可以将内生孢子结合到材料上，并且防止内生孢子通过材料的孔流出，即使内生孢子小于材料的孔。当这样构造时，疏水性材料30可以提供延伸通过材料的曲折(例如非线性)流体流动路径，并且具有相对高的表面积，流体在内生孢子捕获期间流动穿过该表面。
在一些实施例中，疏水性材料30具有大于被分析的流体中的细菌内生孢子的平均尺寸的平均孔径，例如为细菌内生孢子的平均尺寸的至少5倍、至少10倍、或至少100倍、或至少1000倍的平均孔径。在一些另外的实施例中，孔径的分布使得至少75％的孔为被分析的流体中的细菌内生孢子的平均尺寸的至少5倍(在一些实施例中至少10倍)，例如至少90％的孔、至少95％的孔或至少99％的孔为被分析的流体中的细菌内生孢子的平均尺寸的至少5倍(在一些实施例中至少10倍)。
疏水性材料30的孔的尺寸也可以根据被分析的流体内的内生孢子以外的颗粒的尺寸而变化，这将取决于被分析的流体的组成。在乳的情况下，例如，乳可以含有尺寸为约0.1微米的蛋白质胶束，0.2微米至15微米的脂肪球，0.6微米至1微米的内生孢子，1微米至5微米的细菌，和10微米至15微米的体细胞，以及其它颗粒。疏水性材料30可以具有尺寸大于流体中基本上所有颗粒的孔，以试图允许非内生孢子颗粒流动穿过材料而不堵塞孔。在一些实施例中，疏水性材料30具有大于被分析的流体中的颗粒的平均尺寸的平均孔径，例如平均孔径为流体中最小颗粒的平均尺寸的至少5倍(例如，颗粒的种类)、至少10倍、或至少100倍、或至少1000倍。在一些另外的实施例中，孔径分布使得至少75％的孔为被分析的流体中最小颗粒的平均尺寸的至少5倍(在一些实施例中至少10倍)，例如至少90％的孔，至少95％的孔或至少99％的孔为被分析的流体中最小颗粒的平均尺寸的至少5倍(在一些实施例中至少10倍)。在一个实施例中，至少95％的孔的范围是比被分析的流体中的最小尺寸类别的颗粒大10倍至大1000倍。
尽管疏水性材料30的孔的绝对尺寸可以基于所需的应用而变化，但是在一些实施例中，疏水性材料具有大于25微米、例如大于50微米、大于100微米、或大于125微米的平均孔径。在一些实施例中，疏水性材料的孔隙率为疏水性材料总体积的20％至材料总体积的70％。
疏水性材料30可以通过疏水性吸引从通过材料的流体中捕获并收集内生孢子。因此，疏水性材料30可以表现出足够的疏水性以选择性地与被分析的流体中的内生孢子结合，同时允许携带内生孢子的周围流体穿过疏水性材料而不结合。在一些实施例中，疏水性材料30具有足够的疏水性，使得存在于被分析的流体中的基本上所有的内生孢子在穿过材料时与疏水性材料结合。在不同的构造中，疏水性材料30可以在材料表面上捕获存在于被分析的流体中的大于30％的内生孢子、例如大于50％的内生孢子、大于70％的内生孢子、大于90％的内生孢子、或大于95％的内生孢子。穿过疏水性材料30的所得流体可以包含小于50％的存在于最初接触材料的原始流体中的内生孢子、例如小于40％的内生孢子、小于30％的内生孢子或小于10％的内生孢子。由疏水性材料捕获的内生孢子的百分比可以通过调节材料的疏水性和/或流体遇到的疏水性材料的量来改变。
因为疏水性材料排斥水，所以材料的疏水性可以通过放置在材料上的水微滴与材料的表面之间的接触角来表征。例如，疏水性材料30的水接触角可以通过将一微滴水置于材料的表面上并测量液滴和/或测量在液体-表面界面处形成的润湿角来确定。用于测量水接触角的一种标准方法是通过测量卧滴的最大高度和宽度。基于液滴高度与液滴宽度的比率，根据已知的方程计算液滴和表面之间的接触角。在一些实施例中，疏水性材料30显示出与水的接触角大于80度，例如大于90度的接触角。
疏水性材料30可以由各种不同的材料构成。可用于制造疏水性材料30的实施例材料包括但不限于聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(例如)，乙烯丙烯二烯(EPDM)，丁腈橡胶(例如Buna-N)，聚对苯二甲酸乙二醇酯，脂族聚酰胺(例如尼龙)，芳族聚酰胺织物(例如)和不锈钢。例如，疏水性材料30可以由烧结金属粉末或多孔塑料形成。疏水性材料30可以或可以不进行表面处理以增加材料的疏水性。
疏水性材料30可以具有任何所需的尺寸和形状。通常，疏水性材料30的尺寸将基于要分析的流体的量而变化，对于较大体积的流体使用较大体积的疏水性材料。疏水性材料30可以实现为平面材料片(例如，盘)，材料球，材料圆柱体(例如环(annulus))或任何其它期望的形状。在一些实施例中，疏水性材料30被实现为含有内生孢子的流体通过和/或穿过的单一结构(例如，片)。在其他实施例中，可以紧邻使用多个疏水结构，例如，以提供含有内生孢子的流体流动穿过的疏水性材料的填充床、柱或筒。
一般来说，前述实施例描述了使用疏水性材料从流体样品中浓缩和/或分离细菌内生孢子，然后萌发和光学分析以确定流体样品中内生孢子的浓度或计数。被描述为适于从流体捕获和收集内生孢子的疏水性材料可以用于除了通过光学分析定量内生孢子之外的其它应用中。例如，疏水性材料可以用于制造设备中，以通过使流体穿过疏水性材料来纯化含有内生孢子的流体。疏水性材料可捕获流体中的内生孢子并净化流体以用于下游加工或销售。例如，疏水性材料可以除去流体中存在的大于80％的内生孢子、例如大于90％的内生孢子或大于99％的内生孢子。在这样的应用中，可以周期性地冲洗疏水性材料以除去捕获的内生孢子并重新打开表面区域以用于内生孢子结合。在其他实施例中，疏水性材料可以在实验室环境中用于从流体样品中浓缩和/或分离细菌内生孢子，而不随后萌发和/或光学分析捕获的内生孢子。相反，浓缩和/或分离的内生孢子可用于进行其他类型的实验室分析。
此外，虽然前述实施例描述了使用疏水性材料通过疏水性吸引从通过材料的流体中捕获和收集内生孢子，但是在其他实施例中，可以从流体样品中分离内生孢子，而不依赖于疏水性吸引力。例如，基于尺寸排阻，机械过滤器可用于从周围流体中分离内生孢子。在这些实施例中，机械过滤器可以或可以不由疏水性材料制成。
以下实施例可提供关于根据本公开的系统和技术的额外细节。
实施例1
将含有不同细菌内生孢子计数的各种乳溶液穿过具有约50％孔隙率(例如，从25％空隙空间至75％空隙空间)的疏水性材料。使50毫升乳穿过疏水性材料，随后两次连续冲洗，每次50毫升水。随后，将2毫升L-丙氨酸(10mM)型萌发流体加入疏水性材料中，并在75摄氏度的温度加热15分钟。然后将铽试剂加入萌发流体中以形成铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。通过将光发射到流体样品中并产生和检测来自流体的荧光发射，对含有铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的萌发流体进行荧光分析。
图3是显示实施例乳样品的光学响应的图。图的X轴是乳样品中的内生孢子计数水平。Y轴是从乳样品产生的含有铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的萌发流体的光学响应，以相对荧光单位计。
实施例2
为了评价疏水性材料孔径对内生孢子捕获的影响，制备具有不同平均孔径的疏水性材料，包括平均孔径为65微米的孔径和平均孔径为125微米的孔径。随后，将50毫升内生孢子计数为1×102的乳穿过各疏水性收集材料。认为内生孢子的尺寸范围为约0.7微米至约1微米。从疏水性收集材料排出的残留乳再循环穿过材料，使得乳穿过疏水性材料三次。图4是显示在该过程之后捕获的内生孢子的数量与疏水性材料的表面积的图。较大的表面积对应于具有小的平均孔径的疏水性材料。测试显示，在第三次通过乳后，疏水性材料捕获约50％的孢子至约70％的孢子。
图5是在将乳穿过材料三次之后，在1毫米的分辨率下疏水性材料之一的显微照片。该图显示了材料的总体结构和实施例孔结构的相对尺寸。图6是图5的显微照片的100倍放大图，显示了粘附到材料表面的内生孢子50。图像表明内生孢子通过疏水性吸引而不是机械尺寸排阻(例如过滤)被捕获。
在该实施例中，随后用50毫升水冲洗疏水性材料。测试显示，在冲洗后，大于约99％至约99.9％的内生孢子保持粘附于疏水性材料的表面。

Claims (26)

1.一种方法，包括：
使含有细菌内生孢子的流体穿过疏水性收集材料，和通过疏水性吸引在疏水性收集材料上疏水性结合并收集细菌内生孢子，其中所述疏水性收集材料包含平均孔径大于所述细菌内生孢子的平均尺寸的多孔材料，所述含有细菌内生孢子的流体以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发荧光的波长重叠的波长发荧光；
冲洗所收集的细菌内生孢子以除去所收集的细菌内生孢子中的以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发荧光的波长重叠的波长发荧光的残余流体；
冲洗所收集的细菌内生孢子之后，从收集的细菌内生孢子释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)；
将镧系元素源加入从收集的细菌内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸以形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物；和
基于镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的光学响应确定流体中的细菌内生孢子的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述流体包括含水液体。
3.权利要求1的方法，其中所述疏水性收集材料的平均孔径为所述细菌内生孢子的平均尺寸的至少5倍。
4.权利要求1的方法，其中使含有细菌内生孢子的流体穿过疏水性收集材料包括使含有细菌内生孢子的流体穿过多孔材料，使得细菌内生孢子聚集在多孔材料上，而基本上所有剩余的流体穿过多孔材料。
5.权利要求1的方法，其中所述疏水性收集材料包括孔隙率为所述疏水性收集材料的总体积的20％至所述疏水性收集材料的总体积的70％的多孔材料。
6.权利要求1的方法，其中所述疏水性收集材料表现出大于90度的与水的接触角。
7.权利要求1的方法，其中所述疏水性收集材料包括至少一种聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚四氟乙烯和不锈钢。
8.权利要求1的方法，其中冲洗收集的细菌内生孢子包括用至少1.5倍于穿过疏水性收集材料的含有细菌内生孢子的流体的体积冲洗收集的细菌内生孢子。
9.权利要求1的方法，其中从收集的细菌内生孢子释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)包括将萌发流体加入收集的细菌内生孢子。
10.权利要求9的方法，其中将萌发流体加入收集的细菌内生孢子包括加入为穿过疏水性收集材料的含有细菌内生孢子的流体体积的五分之一的萌发流体体积。
11.权利要求10的方法，其中所述镧系元素源包括铽，并且将镧系元素源加入从收集的细菌内生孢子释放的吡啶(-2,6-)二羧酸包括将铽加入到萌发流体中，使得镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物包括铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物。
12.权利要求11的方法，其中基于镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的光学响应确定流体中的细菌内生孢子的浓度包括将光引导到含有铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物的萌发流体中，从而从铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物产生荧光发射并检测由铽-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发射的荧光发射。
13.权利要求1的方法，其中流体包括含水乳制品。
14.权利要求1的方法，其中细菌内生孢子包括以下的至少一种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)，魏登施泰芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)，脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，难辨梭菌(Clostridiumdifficile)和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。
15.一种系统，包括：
待评价的含有细菌内生孢子的含水液体，其中所述含有细菌内生孢子的含水液体以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发荧光的波长重叠的波长发荧光；
萌发流体；
镧系元素源；
冲洗流体；
疏水性收集材料，其包含平均孔径大于所述细菌内生孢子的平均尺寸的多孔材料且被构造成接收含水液体并借助疏水性结合从其中捕获细菌内生孢子，接收冲洗流体以从所捕获的细菌内生孢子中冲洗掉残余含水液体，所述残余含水液体以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发荧光的波长重叠的波长发荧光，接收冲洗流体之后，接收萌发流体以从捕获的细菌内生孢子释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并接收镧系元素源从而在萌发流体中形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物；和
光学传感器，其构造成将光能发射到萌发流体中，从而从镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物产生光发射，检测由镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发射的光发射，并由此确定含水液体中的细菌内生孢子的浓度。
16.权利要求15的系统，其中疏水性收集材料的平均孔径为细菌内生孢子的平均尺寸的至少5倍。
17.权利要求15的系统，其中疏水性收集材料表现出大于90度的与水的接触角。
18.权利要求15的系统，其中疏水性收集材料包括至少一种聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚四氟乙烯和不锈钢。
19.权利要求15的系统，其中疏水性材料包括片和柱中的至少一种。
20.权利要求15的系统，其中镧系元素源包括铽。
21.一种方法，包括：
使含水液体通过多孔疏水性收集器，从而通过多孔疏水性收集器和细菌内生孢子之间的疏水性吸引，将存在于含水液体中的细菌内生孢子捕获在多孔疏水性收集器的表面上，其中所述多孔疏水性收集器的平均孔径大于所述细菌内生孢子的平均尺寸，和所述含有细菌内生孢子的含水液体以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发荧光的波长重叠的波长发荧光；
用光学惰性液体冲洗多孔疏水性收集器，以从在多孔疏水性收集器上捕获的细菌内生孢子中除去以与镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物发荧光的波长重叠的波长发荧光的残余含水液体；
冲洗多孔疏水性收集器之后，将萌发流体加入多孔疏水性收集器，以从捕获在多孔疏水性收集器上的细菌内生孢子中释放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)；
提供镧系元素源以在萌发流体中与吡啶(-2,6-)二羧酸形成镧系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸络合物，其中吡啶(-2,6-)二羧酸从捕获在多孔疏水性收集器上的细菌内生孢子释放；和
对萌发流体进行荧光分析以确定含水液体中细菌内生孢子的浓度。
22.权利要求21的方法，其中使含水液体穿过多孔疏水性收集器包括使体积X穿过多孔疏水性收集器，冲洗多孔疏水性收集器包括用范围是至少1.5倍X的体积的光学惰性液体冲洗多孔疏水性收集器，并且将萌发流体加入多孔疏水性收集器包括添加体积为0.01至0.2倍X的萌发流体。
23.权利要求21的方法，其中多孔疏水性收集器的平均孔径为细菌内生孢子的平均尺寸的至少5倍。
24.权利要求21的方法，其中多孔疏水性收集器的孔隙率为多孔疏水性收集器的总体积的20％至多孔疏水性收集器的总体积的70％，并且多孔疏水性收集器包括至少一种聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚四氟乙烯和不锈钢。
25.权利要求21的方法，其中镧系元素源包括铽，并且细菌内生孢子包括以下的至少一种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)，魏登施泰芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)，脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，难辨梭菌(Clostridium difficile)和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。
26.权利要求21的方法，其中含水液体包括从人类可消费的食品或饮料获得的液体。
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