CN106459899A - 负载有异源因子的细胞外基质移植物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了生物活性组合物，制备生物活性组合物的方法和使用此类生物活性组合物治疗患者的方法。在一些形式中，本公开内容的生物活性组合物包含胶原性生物材料和施加于胶原性生物材料的哺乳动物血小板的生物活性级分。

Description

负载有异源因子的细胞外基质移植物
本申请要求于2014年3月25日提交的美国临时专利申请系列No.61/970,344和于2014年3月28日提交的美国临时专利申请系列No.61/971,504的优先权的权益，每个申请名称为负载有异源因子的细胞外基质移植物，并且其每一篇通过引用整体并入本文。
背景
本发明总体上涉及医学或研究组合物的领域，并且在某些方面，涉及负载有可源自动物血小板产品的生物活性物质的基质，及其制备方法和用途。
用于治疗性治疗的组织衍生的组合物的施用正变成日益普遍的治疗模态。动物血小板裂解物组合物(诸如人血小板裂解物(hPL))已作为潜在的治疗剂或体外试剂材料出现。已知血小板裂解物含有各种生长因子。尽管已经提出了用于生产和使用血小板裂解物组合物的各种产品和方法，但是需要另外的替代方案和/或改进。
概述
在某些方面，本公开内容提供了独特的负载生物活性的基质组合物以及制备或使用此类组合物的方法。根据本公开内容的一些形式，此类组合物包含已经用哺乳动物血小板的生物活性级分处理的胶原性生物材料。因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了包含胶原性细胞外基质材料和施加于胶原性细胞外基质材料的哺乳动物血小板的生物活性级分的组合物。在一种形式中，哺乳动物血小板是人血小板。根据某些发明变体，生物活性级分包括TGF-β、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种。在一些形式中，生物活性级分具有小于约20,000ng/mL的纤维蛋白原含量。在一个方面，胶原性细胞外基质材料包括对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖(例如包括肝素)和/或纤连蛋白。在这方面，可以处理源组织以除去组织的天然细胞，以形成作为无细胞基质的胶原性细胞外基质材料，同时以例如以本公开内容中指定的量保留对于源组织中而言是天然的硫酸化糖胺聚糖和/或纤连蛋白。有利地非共价结合来自血小板的生物活性级分的生物活性因子(诸如生长因子)的胶原性细胞外基质材料的使用在胶原性细胞外基质材料的植入部位提供了活性形式的因子。与在不存在胶原性细胞外基质材料的情况下施用相同量的生物活性因子相比，生物活性因子的结合可提供对来自植入部位的生物活性因子的迁移的抗性和/或增强生物活性因子在植入部位的局部生物作用。这进而可以提供许多益处，这些益处可包括使用较低剂量的生物活性因子，同时在植入部位实现相同的生物效应的能力。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于制备生物活性组合物的方法，所述方法包括将哺乳动物血小板的生物活性级分施加于胶原性细胞外基质材料。在某些方面，所述方法还包括在施加哺乳动物血小板的生物活性级分之后漂洗胶原性细胞外基质材料，以从胶原性细胞外基质材料中除去一部分所施加的生物活性级分；和/或将所述生物活性组合物包装在无菌容器中；和/或在施加哺乳动物血小板的生物活性级分之后并且可能在将生物活性组合物包装在无菌容器中之前干燥(优选通过冷冻干燥)胶原性细胞外基质材料。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于制备组合物的试剂盒，其中试剂盒包括胶原性细胞外基质材料(例如具有本文所述的胶原性细胞外基质材料的任何特征或特征组合)和哺乳动物血小板的生物活性级分(例如具有本文所述的哺乳动物血小板的生物活性级分的任何特征或特征组合)。胶原性细胞外基质材料和/或哺乳动物血小板的生物活性级分可以是干燥(优选冷冻干燥的)形式，在该情况下，试剂盒可任选地还包括用于重构胶原性细胞外基质材料和/或哺乳动物血小板的生物活性级分的液体介质。试剂盒可以具有包装试剂盒的组分的包装。可将胶原性细胞外基质材料和哺乳动物血小板的生物活性级分各自无菌地密封在其自身的容器中，和/或其中试剂盒还可包括至少一个容器(例如注射器或用于混合或润湿的桶)，用于组合胶原性细胞外基质材料与哺乳动物血小板的生物活性级分。在用于制备组合物的相关方法中，可从试剂盒的包装中取出胶原性细胞外基质材料和哺乳动物血小板的生物活性级分，并将其组合以形成组合物，例如使用本文所述的任何组合方法。
在另一个实施方案中，本公开内容显示了治疗人类患者的方法，所述方法包括向患者施用本文公开的组合物，或通过本文公开的任何实施方案的方法制备的组合物。
根据本文的描述，其它实施方案以及特征和有利方面对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。
附图概述
图1举例说明了用于制备人血小板浓缩组合物的液体生物活性级分的方法。
图2是在无菌包装中的本公开内容的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。
图3a是表示从实施例2中测试的生物材料提取的VEGF的量的图表。
图3b是表示从实施例2中测试的生物材料提取的1ml HPL中存在的VEGF的百分数的图表。
图4a是表示从实施例2中测试的生物材料提取的TGF-β的量的图表。
图4b是表示从在实施例2中测试的生物材料中提取的1ml HPL中存在的TGF-β的百分数的图表。
图5a是表示从实施例2中测试的生物材料中提取的PDGF-BB的量的图表。
图5b是表示从实施例2中测试的生物材料中提取的1ml HPL中存在的PDGF-BB的百分数的图表。
图6a是表示使用实施例2中测试的生物材料制备的样品的MTT吸光度的图表。
图6b是表示以完全培养基样品的吸光度的百分数表示的使用实施例2中测试的生物材料制备的样品的MTT吸光度的图表。
详述
为了促进对本发明的原理的理解，现在将参考某些实施方案，并且将使用特定语言来对其进行描述。然而，应当理解，并不意图由此限制本发明的范围。如本发明所涉及的领域内的技术人员通常会想到的，设想了所描述的实施方案中的任何改变和进一步的修改，以及本文所描述的本发明的原理的任何进一步的应用。
本公开内容尤其涉及生物活性组合物，制备生物活性组合物的方法和使用此类生物活性组合物治疗患者的方法。在一些形式中，本公开内容的生物活性组合物包含胶原性生物材料和施加于胶原性生物材料的哺乳动物血小板的生物活性级分。在一些形式中，胶原性生物材料包含胶原性细胞外基质(ECM)组织材料。在一些形式中，哺乳动物血小板的生物活性级分包含血小板裂解物组合物。在某些实施方案中，血小板裂解物组合物包含人血小板裂解物(hPL)组合物。
用于本文的哺乳动物血小板的生物活性级分可以以任何合适的方式制备。现在转到图1，其显示了用于从血小板浓缩组合物制备生物活性级分的一种说明性方法100。该方法包括以下步骤：获得血小板浓缩物01，冷冻血小板浓缩物02，解冻血小板浓缩物03，将凝固剂添加至血小板浓缩物04，将凝块固体与液体分离05，用第一深度过滤器过滤液体06，用第二深度过滤器过滤液体07，用无菌过滤器过滤液体08，和包装液体09。下面的讨论在一些方面扩展了这些描述的一般步骤中的每一个的选项；然而，应当理解，并非所有所描述的一般步骤都是本文所有实施方案所需要的，并且包括对应于一个、一些或所有所描述的步骤的特征的新颖方法被预期作为本文的实施方案。
用作所公开方法的源材料的血小板浓缩组合物和生物活性级分可以以任何合适的方式获得。如本文所用，术语血小板浓缩物是指含有已经从血源浓缩的血小板的液体组合物。血源优选是人血液，诸如全人外周血，但在其它实施方案中，非人哺乳动物血液可用作源，例如包括犬科动物、猫科动物或马科动物的血。血小板浓缩物优选包括血小板和血浆蛋白，并且可由通过单采血液成分术从人供体的全外周血获得的血小板单位提供。设想了来自人或其他物种例如哺乳动物物种(包括上述那些哺乳动物)的全血，也可用作如本文所述待进行处理的血小板浓缩物的来源。在某些实施方案中，可将来自不同人(或相同物种的不同动物)的血小板和/或血液单位在加工过程中的某一点汇集以获得生物活性级分。在今天的典型实践中，每个人供体的经单采血液成分术的血小板单位具有约100至约500mL，更典型地约100至400mL的体积，并且在单采血液成分术过程期间，含有约100至500x 109个血小板以及与血小板一起分离的血浆。捐赠的经单采血液成分术的人血小板单位具有相对短暂的保健设施保质期(通常约5天)。在本文的方法中使用的血小板单位可以是从保健设施获得的最近过期的经单采血液成分术的人血小板单位，并且可任选在任何合适的温度例如约-20℃下冷冻储存，随后用于制备如本文所述的生物活性级分。
在制备生物活性级分中，可通过合适的方法释放血小板的内容物。在一些模式中，通过使血小板经历至少一个冻融循环以释放血小板内容物，以及任选的多个冻融循环(例如2或3个冻融循环)来裂解血小板。在使用冻融循环时，可以在任何合适的温度下冷冻血小板浓缩物。在一些方面，将血小板浓缩物在约-10℃至约-80℃的温度下冷冻。在具体的优选实施方案中，将血小板浓缩物在约-20℃冷冻。为了裂解血小板，将冷冻的血小板浓缩物例如在37℃水浴中或通过其他有效方式解冻，以形成“原始”血小板裂解物组合物。原始血小板裂解物含有裂解的血小板膜和从裂解血小板释放的生长因子和其它物质。当被解冻的血小板浓缩物含有与血小板一起的血浆时，血小板裂解物也将含有血浆，包括其中的血浆蛋白。用于释放血小板内容物的其它技术，例如用凝血酶活化，可用于本文的某些方面。然而，用于裂解血小板的冻融或其它机械技术被认为是有利的，因为它们不需要向血小板浓缩物中添加非天然蛋白质-凝血酶，所述添加既增加成本，又导致下游加工材料中存在至少一些凝血酶。
原始血小板裂解物含有来自血小板浓缩物起始材料的多种生长因子。这些可包括例如转化生长因子β1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、基质细胞衍生因子-1α和血管内皮生长因子。
转化生长因子β1(TGF-β1)是一种多功能肽，其在许多细胞类型中控制增殖、分化和其他功能。表皮生长因子(EGF)刺激细胞增殖、分化和存活。碱性成纤维细胞生长因子(FGF-b)促进血管生成(angiogenesis)，并结合广泛刺激各种细胞的肝素。血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)是调节细胞生长和分裂并促进血管生成的二聚糖蛋白。血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)是调节细胞生长和分裂并促进血管生成的二聚糖蛋白。基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)激活白细胞并促进血管生成。血管内皮生长因子(VEGF)有助于血管发生(vasculogenesis)和血管生成。
在某些实施方案中，原始血小板裂解物包括以下生长因子及其量(基于原始未稀释的血小板浓缩物的体积)：
约50,000至约150,000pg/ml TGF-β1，优选约70,000至约120,000pg/ml TGF-β1；和/或
约100至600pg/ml EGF，优选约200至约600pg/ml EGF；和/或
约5至约250pg/ml FGF-b，优选约50至200pg/ml FGF-b；和/或
约500至约20,000pg/ml PDGF-AA，优选约5000至约15000pg/ml PDGF-AA；和/或
约1000至约20,000pg/ml PDGF-BB，优选约2000至约15000pg/ml PDGF-BB；和/或
约400至1100pg/ml SDF-1α，优选约500至约1000pg/ml SDF-1α；和/或
约10至约800pg/ml VEGF，优选约100至约600pg/ml VEGF。
在优选形式中，原始血小板裂解物还包括源自血小板浓缩物起始材料中的血浆的一种或多种组分，包括例如纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠、钙和/或胆固醇。在优选形式中，原始血小板裂解物包括以下组分和量：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1.5至2.5g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约40至200mg/dL的甘油三酯，优选约50至120mg/dL的甘油三酯；
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖；
约5至12mg/dL的钙，优选约6至10mg/dL的钙；和/或
约100万-350万ng/mL的纤维蛋白原，优选约150万-250万ng/mL的纤维蛋白原。
原始血小板裂解物还可含有其它生物活性物质，例如一种或多种白细胞介素，干扰素和/或肿瘤坏死因子。这些白细胞介素，干扰素和/或肿瘤坏死因子可包括例如白细胞介素(IL)-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的一种、一些或全部。
在本文的某些实施方案中，处理原始血小板裂解物以除去颗粒物质，例如离心，并灭菌以用作血小板裂解物产物。此类灭菌可以例如包括将耗尽了颗粒物质的原始血小板裂解物通过无菌过滤器。
在本文的一些实施方案中，处理原始血小板裂解物以回收其具有降低的纤维蛋白原浓度的级分。纤维蛋白原可通过任何合适的技术除去，包括例如通过转化成纤维蛋白，导致形成固体凝块材料，可将其与液体生物活性级分分离。此类向纤维蛋白的转化可通过加入凝固剂来诱导。根据实施所公开的方法的一些形式，可向原始血小板裂解物中加入凝固剂，例如氯化钙盐。说明性地，可将氯化钙盐以约0.1g/升与2g/升的原始血小板裂解物之间的量添加至原始血小板裂解物中。在优选实施方案中，每升原始血小板裂解物中添加约0.4g至约0.7g氯化钙盐。可将组合的血小板裂解物与氯化钙或其它凝固剂置于摇床上或以其它方式搅拌，以确保凝固剂与浓缩物充分混合。然后使得到的混合物形成固体凝块材料，在某些实施方案中持续至少约8小时，或至少约12小时，通常在约8小时至约36小时的范围内的时间段。在优选形式中，至少主要量(超过50％)的所得凝固材料，以及可能至少80％或至少90％的所得凝固材料由基本上均匀的凝块凝胶构成。此类基本上均匀的凝块凝胶可在整个材料中表现出一致的凝胶相，其中液体夹带在连续纤维蛋白基质内。凝固材料的这些优选形式不同于凝固的血小板浓缩物材料(其中大量离散的固体凝块颗粒悬浮在液相中，这对于随后的基于离心机的分离技术来说是期望的)。
在凝块形成之后，可将液体材料与固体凝块材料分离。任何合适的技术可用于该目的。在优选形式中，将凝结材料在两个或更多个表面之间压制以将凝结的固体与液体分离。在其中凝固材料表现出如本文所讨论的基本上均匀的凝块凝胶的形式的情况下，此类压制可在压缩和浓缩凝胶的纤维蛋白基质的同时从凝胶材料压出液体。压制凝固材料可以以一些形式在柔性容器(诸如塑料袋)中进行。凝块凝胶可以例如通过手来手动压制或通过强制施加器具压到袋或其他柔性容器的一个区域(例如端部)来进行压制，并且从固体纤维蛋白基质压出的液体可以聚集在袋或其它柔性容器的另一个区域(例如端部)。第二袋或其他容器可以在压制过程中或之后连接至其中发生压制的第一袋，并且液体材料可被输送至第二袋或其他容器。在其它模式中，凝块凝胶可在诸如斗的刚性容器中，并且可通过用手压或通过强制施加器具来从固体纤维蛋白基质压出液体并压缩和浓缩纤维蛋白基质。
在凝固和分离凝固的血小板浓缩物的液体和固体材料后，与凝固前的原始血小板裂解物相比，分离的液体具有降低的纤维蛋白原浓度。在优选形式中，原始血小板裂解物具有至少100万ng/mL，通常在约1,500,000至3,500,000(150万至350万)ng/mL的范围内的纤维蛋白原含量，并且在凝固和分离后，液体具有小于约50,000ng/mL，优选小于约20,000ng/mL，更优选小于约10,000ng/mL的纤维蛋白原含量。说明性地，该分离的液体可以具有在约500ng/mL至约20,000ng/mL，或约500ng/mL至约10,000ng/mL的范围内的纤维蛋白原含量。另外或可选地，该分离的液体可含有小于约5％的凝固前存在于血小板浓缩物中的纤维蛋白原，优选小于约2％，更优选小于约1％。同样，该分离的液体可构成原始血小板裂解物体积的至少约70％，优选至少约75％，并且通常在约75％至约90％的范围内。
在原始血小板裂解物凝固和液体固体/分离分离后回收的纤维蛋白原耗尽的液体生物活性级分含有来自原始血小板裂解物的多种生长因子。这些生长因子可包括TGF-β1、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。在某些实施方案中，该纤维蛋白原耗尽的液体生物活性级分包括来自原始血小板裂解物的以下生长因子及其量：
约50,000至约150,000pg/ml TGF-β1，优选约70,000至约120,000pg/ml TGF-β1；
约20至800pg/ml EGF，优选约400至约800pg/ml EGF；
约5至约250pg/ml FGF-b，优选约50至250pg/ml FGF-b；
约500至约25,000pg/ml PDGF-AA，优选约5000至约18000pg/ml PDGF-AA；和/或
约1000至约25,000pg/ml PDGF-BB，优选约2000至约18000pg/ml PDGF-BB；和/或
约400至1000pg/ml SDF-1α，优选约500至约900pg/ml SDF-1α。和/或
约10至约600pg/ml VEGF，优选约150至约450pg/ml VEGF。
在优选形式中，该纤维蛋白原耗尽的液体生物活性级分还包括源自血小板浓缩物起始材料中的血浆的一种或多种组分，包括例如球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠和/或钙。当氯化钙盐用于凝固原始血小板裂解物时，存在于分离的液体生物活性剂中的钙可来自裂解物和加入的钙盐二者中。在某些实施方案中，该分离的液体生物活性级分包括来自原始血小板裂解物的以下组分和量：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约40至70mg/dL的甘油三酯，优选约50至65mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
同样，在使用氯化钙盐作为原始血小板裂解物的凝固剂的情况下，该分离的液体生物活性级分可以以一些形式包括约15至35mg/dL，优选约15至25mg/dL的水平的钙。
本文的某些发明实施方案包括在凝固和液体/固体分离步骤之后过滤回收的液体生物活性级分，例如以除去悬浮的固体，诸如任何剩余的血小板碎片、细胞碎片和凝块固体。在优选的模式中，此类过滤包括通过至少一个深度过滤器，优选多个深度过滤器，诸如可能具有不同微米额定值的两个或三个深度过滤器处理液体生物活性级分。在这方面，如已知的和如本文所使用的，“深度过滤器”或“深度过滤”分别是指利用多孔过滤介质将颗粒保持在整个介质中而不是仅仅保持在介质的表面上的过滤器或过滤。另外，如已知的和如本文所使用的，应用于过滤器的“标称微米额定值”是指这样的粒度，在过滤器的整个额定容量内大于所述粒度的98％的所有悬浮固体将被除去。某些发明变型包括通过至少一个深度过滤器，随后通过至少一个无菌过滤器的过滤。另外的发明变型包括通过至少两个深度过滤器，随后通过至少一个无菌过滤器的过滤。在优选形式中，所使用的深度过滤器或多个深度过滤器具有带有正表面电荷的过滤介质。
在某些实施方案中，第一和第二深度过滤器用于液体生物活性级分的深度过滤。第一深度过滤器具有大于第二深度过滤器的标称微米额定值。在一些形式中，第一深度过滤器具有在约10与0.1微米之间的标称微米额定值。在优选实施方案中，第一深度过滤器具有在5与0.1微米之间，甚至更优选在约3与0.2微米之间的标称微米额定值。在某些实施方案中，第一深度过滤器具有纤维素膜以及由纤维素纤维和具有正表面电荷的无机助滤剂(诸如硅藻土)组成的过滤介质。
在某些实施例中，第二深度过滤器具有小于第一深度过滤器的标称微米额定值，例如在一些形式中小于约0.5微米。在优选实施方案中，第二深度过滤器具有在0.5与0.001微米之间，更优选在约0.1与0.001微米之间的标称微米额定值。在某些实施方案中，第一深度过滤器具有纤维素膜以及由纤维素纤维和具有正表面电荷的无机助滤剂(诸如硅藻土)组成的过滤介质。
在优选形式中，液体生物活性级分在深度过滤或其它过滤以除去悬浮固体后，仍含有来自原始血小板裂解物的多种生长因子。这些生长因子可包括TGF-β1、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。在某些实施方案中，该过滤的液体生物活性级分包括源自原始血小板裂解物的以下生长因子及其量：
约5000至约75,000pg/ml TGF-β1，优选约5000至约60,000pg/ml TGF-β1；
约20至300pg/ml EGF，优选约50至约250pg/ml EGF；
约5至约150pg/ml FGF-β，优选约30至130pg/ml FGF-b；
约200至约4000pg/ml PDGF-AA，优选约1000至约3000pg/ml PDGF-AA；
约50至约1000pg/ml PDGF-BB，优选约100至约500pg/ml PDGF-BB；
约100至700pg/ml SDF-1α，优选约300至约600pg/ml SDF-1α；和/或
约10至400pg/ml VEGF，优选约40至约200pg/ml VEGF。
在优选形式中，该深度过滤的或其它过滤的液体生物活性级分仍然还包括源自血小板浓缩物起始材料中的血浆的一种或多种组分，包括例如球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠和/或钙。再次地，当使用氯化钙盐来凝固原始血小板裂解物时，存在于过滤的液体生物活性剂中的钙可来自裂解物和添加的钙盐二者。在某些实施方案中，该过滤的生物活性液体级分包括源自原始血小板裂解物的以下组分和量：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
同样，当氯化钙盐用作原始血小板裂解物的凝固剂时，该分离的生物活性液体级分可以以某些形式包含约15至60mg/dL，优选约20至50mg/dL的水平的钙。
生物活性液体部分还可包括其它生物活性物质，例如一种或多种白细胞介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子。这些白细胞介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子可包括例如白细胞介素(IL)-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的一种、一些或全部。
如上所述，在本文方法的一些实施方案中，将液体生物活性级分通过至少一个无菌过滤器，优选是在通过一个或多个深度过滤器或其它过滤器以除去如上所述的悬浮固体之后。已知并且可以使用各种无菌过滤器和相关方法。待由无菌过滤器除去的示例性污染物包括例如：金黄色葡萄球菌(staphyloccus aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、生孢梭菌(clostridium sporogenes)、白色念珠菌(candida albicans)、黑曲霉菌(aspergillus niger)、支原体(mycoplasma)和/或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。可选择无菌过滤器以显示相对低的蛋白质结合。在无菌过滤之后，在优选形式中，无菌过滤的液体生物活性级分可具有与上文针对深度过滤或其它过滤的液体生物活性级分所述相同的组分，并且还具有在上文中针对深度或其他过滤的液体生物活性级分所指定的范围内的那些组分的水平。然而，应当理解，在无菌过滤期间可能发生一些或所有组分的水平的一定降低。
在某些优选实施方案中，可通过血小板裂解、纤维蛋白原耗尽以及深度或其它过滤(以除去悬浮颗粒)的上述步骤获得的无菌液体生物活性级分组合物包括：
为液体生物活性级分的低于20,000ng/mL，例如在约500ng/mL至约20,000ng/mL的范围内水平的纤维蛋白原；
为液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和
为液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
在一些形式中，本公开内容的液体生物活性级分组合物还具有以下特征：
小于约10EU/ml的内毒素水平；
小于约25mg/dL的血红蛋白；
约4至6g/dL的总蛋白；
约260至340mmol/kg的同渗浓度；和/或
6.8与7.8之间的pH。
这些特征可存在于原始血小板裂解物组合物(也可在通过离心或其它方式除去固体和灭菌之后)、在凝固和液体/固体分离(和可能的灭菌)之后回收的纤维蛋白原耗尽的液体生物活性级分，或在深度和/或其它过滤以除去悬浮固体(和可能的灭菌)之后的纤维蛋白原耗尽的液体生物活性级分中，如上所述。同样，因为优选的处理形式不需要使用去垢剂作为处理剂，所以这些组合物可以不含或基本上不含去垢剂残余物。
在一些操作模式中，用于制备本公开内容的纤维蛋白原耗尽的、经过滤的(诸如经深度过滤的)液体生物活性级分组合物的方法导致本文鉴定的生长因子、白细胞介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子的水平降低。作为实例，在某些实施方案中，进行纤维蛋白原耗尽级分的深度或其它过滤以除去悬浮固体，并导致：
TGF-β-1、EGF、FGF-b、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的一种、一些或全部的水平(例如以pg/ml计)的至少20％的降低；和/或
TGF-β-1的水平(例如以pg/ml计)的至少50％的降低；和/或
EGF的水平(例如以pg/ml计)的至少30％的降低；和/或
FGF-b的水平(例如以pg/ml计)的至少20％的降低；和/或
PDGF-AA水平(例如以pg/ml计)的至少50％的降低；和/或
PDGF-BB的水平(例如以pg/ml计)的至少50％的降低；和/或
SDF-1α的水平(例如以pg/ml计)的至少20％的降低；和/或
VEGF的水平(诸如以pg/ml计)的至少30％的降低。
此外或可选地，深度或其他过滤可导致白细胞介素-17(IL-17)的显著高水平去除。在某些实施方案中，在深度或其它过滤以去除颗粒后以及还可能在最终的灭菌的液体生物活性级分产物中的IL-17水平小于约1皮克/ml，更优选小于约0.75皮克/ml，甚至更优选小于约0.5皮克/ml。IL-17是也在触发其他炎性细胞因子的释放中级联的炎性细胞因子。可以使用如本文所述的具有低水平IL-17的优选产品，其具有很少或无源自IL-17的存在的炎症活性。
另外或可选地，去除纤维蛋白原耗尽级分中的悬浮固体的深度或其它过滤可得到这样的液体生物活性级分产物，其具有小于1000pg/ml PDGF-BB的浓度，小于3000pg/ml的PDGF-AA的浓度，至少5000pg/ml的TGF-β1的浓度，和/或小于300pg/ml的VEGF的浓度。这些值还可存在于在深度或其它过滤以去除悬浮固体后制备(诸如通过无菌过滤)的无菌产品中。
在一些形式中，可将本公开内容的液体生物活性级分组合物包装在无菌包装中用于储存或递送，例如用于以后应用于胶原性生物材料(例如在患者护理的场所或在运送至患者护理或其他用途的场所之前的另一制造步骤期间)。可以以其完全回收的浓度包装液体生物活性级分，或者其可以用水或水性介质稀释，以用于包装和以后使用，例如可以制备稀释至液体生物活性级分的原始浓度的90％至10％的稀释物，并且此类稀释的组合物以及它们在本文中指定的组分水平上的所得的相应降低形成本文公开的另外的实施方案。此类包装的一个实施方案示于图2中。根据实施本公开内容的一些形式，将组合物200储存在无菌介质瓶210中。无菌介质瓶可以例如具有在50mL至5000mL的范围内的体积容量。作为实例，可以使用60mL、125mL、250mL、500mL、1000mL或2000mL的瓶。在一些形式中，无菌介质瓶210的盖220受到收缩包装230保护。在一些形式中，将瓶收缩包装。在某些实施例中，瓶子用成品标签240标记。在一些形式中，将瓶子放置在具有干冰的产品盒中。
在某些实施方案中，可将本公开内容的液体生物活性级分组合物与其它成分组合以形成细胞培养基，所述培养基可施加于胶原性生物材料。此类细胞培养基包含与用于细胞培养的其它营养物或培养基(包括例如在已知的细胞培养基例如最低必需培养基(MEM)或Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM)中发现的那些)混合的本公开内容的液体生物活性级分)。配制根据本公开内容的细胞培养基以提供细胞生长或维持所需的营养物(例如生长因子等)，所述细胞包括例如干细胞和/或祖细胞，诸如间充质干细胞。在优选形式中，此类细胞培养基不含添加的肝素，并且仍然不含任何凝固物质(例如，如通过肉眼可见(无需放大)的凝块颗粒的出现所证明的)。
在其它实施方案中，可将本公开内容的液体生物活性级分组合物或其部分与胶原性生物材料组合用作治疗物质。例如，组合的生物活性组合物可以用作用于医疗治疗(包括治疗患病或受损组织诸如神经、腱、骨、肌肉、皮肤(例如伤口愈合)、结缔组织、眼和/或心血管(例如心脏或主动脉)组织)的治疗物质。本文所述的液体生物活性级分或包含其的组合物可通过任何合适的方法递送到这些组织或其它组织，所述方法包括例如注射(例如与呈悬浮颗粒和/或凝胶形式的胶原性生物材料组合)或其它手术植入。
现在转向讨论本公开内容的实施方案中用于的胶原性细胞外基质(ECM)材料，本发明的ECM材料可以源自任何合适的器官或其他组织来源，理想地含有显著胶原性结缔组织的器官或组织来源。可以使用人或其他动物组织来源。非人动物来源可以是温血脊椎动物，包括哺乳动物，其中牛、绵羊、山羊和猪来源是合适的。从这些组织来源获得的合适的ECM材料可包括粘膜下层、肾小囊膜、真皮胶原、硬膜、心包、阔筋膜、浆膜、腹膜或基膜层，包括肝基膜，所述ECM材料或其它合适的ECM材料可呈从哺乳动物或其他动物组织来源分离的脱细胞的胶原性组织膜形式。用于这些目的合适的粘膜下层材料包括例如肠粘膜下层，包括小肠粘膜下层、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层和子宫粘膜下层。应充分理解的是，在分离包括粘膜下层的ECM中，可能与源自一个或多个相邻组织层的材料一起保留来自源组织的原始粘膜下层的一些或全部。类似的原理适用于本文中所命名的其它富含胶原蛋白的层或其他组织-回收的ECM材料可包括原始存在于源组织中的一些或全部中的指定的组织，和/或可保持连接至最终经处理的ECM材料中的相邻组织。
本发明的经处理的天然来源的ECM材料通常包括丰富的胶原，最常见地构成基于干重计至少约80％的胶原重量。此类天然来源的ECM材料将大部分包括非随机取向(例如作为通常单轴或多轴但规则定向的纤维存在)的胶原纤维。当被处理以保留天然生物活性组分时，ECM材料可保留这些作为固体散布在胶原纤维之间、之上和/或之内的这些组分。用于本发明的特别期望的天然来源的ECM材料将包括显著量的此类散布的非胶原固体，其可在光学显微镜检查下被容易地确定。此类非胶原固体在某些发明实施方案中可以构成ECM材料的干重的显著百分比，例如在各种实施方案中为至少约1％，至少约3％和至少约5％的重量。
本发明中使用的含粘膜下层的ECM组织或其它ECM组织优选是高度纯化的，例如，如属于Cook等的美国专利No.6,206,931或属于Johnson的美国专利No.8,192,763(其各自通过引用整体并入本文)中所述的。因此，优选的ECM材料将表现出小于约12个内毒素单位(EU)/克，更优选小于约5EU/克，以及最优选小于约1EU/克的内毒素水平。作为另外的优选，粘膜下层或其他ECM材料可具有小于约1集落形成单位(CFU)/克，更优选小于约0.5CFU/克的生物负载。真菌水平理想地类似地低，例如小于约1CFU/克，更优选小于约0.5CFU/克。核酸水平优选小于约5μg/mg，更优选小于约2μg/mg，而病毒水平优选小于约50个噬斑形成单位(PFU)/克，更优选小于约5PFU/克。美国专利No.6,206,931或美国专利No.8,192,763中教导的粘膜下层或其它ECM组织的这些和另外的性质可以是本发明中使用的任何ECM组织的特征。
本发明的经处理的ECM材料也可以表现出血管生成特性，因此即使在不存在添加的来自血小板的生物活性级分的情况下，也能够有效地在移植有上述材料的宿主中诱导血管生成。在这方面，血管生成是身体籍以产生新血管以产生增加的对组织的血液供应的过程。因此，当与宿主组织接触时，血管生成材料促进或刺激新血管的形成。已经开发了测量响应于生物材料植入的体内血管生成的方法。例如，一种这样的方法使用皮下植入物模型来确定材料的血管生成特性。参见，C.Heeschen等，Nature Medicine 7(2001),No.7,833-839。当与荧光微血管造影技术组合时，该模型可提供血管生成进入生物材料的定量和定性测量。C.Johnson等，Circulation Research 94(2004),No.2,262-268。
制备用于本发明的医疗移植材料和方法的生物可重塑ECM材料是有利的。此类生物可重塑且促进细胞侵入和向内生长的材料提供了特别的有利方面。在本说明书中，生物可重塑材料可用于促进其中植入了本发明的医疗移植材料的部位内的细胞生长。
如上所述，经处理的粘膜下层(含粘膜下层)ECM材料和任何其它ECM材料可保留任何对于源组织是天然的各种生长因子或其他有益的生物活性组分。例如，粘膜下层或其它ECM可包括一种或多种天然生长因子，诸如碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF)。同样，本发明中使用的粘膜下层或其它ECM可包括其他天然生物材料，诸如蛋白聚糖、糖胺聚糖(GAG)和/或硫酸化糖胺聚糖(sGAG)，诸如肝素、硫酸乙酰肝素或透明质酸、纤连蛋白等。因此，一般来说，经处理的ECM材料可包括至少一种天然生物活性组分，其直接或间接诱导细胞反应，诸如细胞形态、增殖、生长、蛋白质或基因表达的变化。例如，在一些形式中，用于形成本发明的生物活性组合物的胶原性ECM材料包括对胶原细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖(例如包括肝素)，其水平为至少约500μg/克(干重)的胶原性ECM材料，或至少约1000μg/克(干重)的胶原性ECM材料。另外地或替代地，胶原性ECM材料可包括对于胶原性ECM材料的来源组织而言是天然的纤连蛋白。此类含天然sGAG和/或天然的含纤连蛋白的胶原性ECM材料可用作优选的，高度有效的基质，用于加载和保持由血小板的生物活性级分提供的外源生物活性因子，包括例如外源生长因子。已经发现，源自血小板的外源生长因子(包括例如VEGF、TGF-β和PDGF-BB)的量有效地非共价结合保留的天然sGAG和/或保留的天然纤连蛋白和/或已被处理以保持天然生物活性的胶原性ECM材料的其他天然组分。这使得此类胶原性ECM材料特别适用于与血小板的生物活性级分结合使用，并且可通过阻止因子从植入部位的迁移而有利于由血小板提供的生物活性因子的局部生物学作用。此类局部生物学作用可包括例如血管生成、细胞增殖和/或至植入部位的细胞募集。
在某些优选实施方案中，经处理的ECM材料将表现出其中以下非胶原组分以所述量存在的组分分布：
此外，除了天然生物活性组分的保留和外源生物活性物质在血小板的生物活性级分中的应用以外，还可将非天然生物活性组分(诸如通过重组技术或其它方法合成产生的那些组分)掺入粘膜下层或其他ECM材料。这些非天然生物活性组分可以是天然来源的或重组产生的蛋白质，其对应于天然存在于ECM组织中但可能来自不同物种的蛋白质(例如施加于来自其他动物(例如猪)的胶原ECM的人蛋白质)。非天然生物活性组分也可以是药物物质。可被掺入至本发明中使用的ECM材料中和/或上的示例性药物物质包括例如抗生素、血栓促进物质诸如凝血因子，例如凝血酶、纤维蛋白原等。这些物质可在即将手术之前作为预制步骤(例如通过将材料浸入含有合适的抗生素诸如头孢唑啉的溶液中)，或在材料移入患者体内期间或之后，施加于ECM材料。
可通过任何合适的方法将血小板的生物活性级分和/或任何其它生物活性组分的施加于粘膜下层或其它胶原性ECM组织。合适的方法包括例如喷雾、浸渍、浸泡等。此外，可将血小板的生物活性级分在任何合适的时间施加于胶原性ECM材料，包括例如在植入之前(诸如在制造步骤期间或现场护理时)或植入后。说明性地，在某些模式中，可首先在植入部位提供胶原性ECM材料，然后可将血小板的生物活性级分施用于胶原性ECM材料；或可在植入部位提供生物活性级分，然后可将ECM材料提供给该部位，以便接触生物活性级分和ECM材料。在任何或所有这些模式中，在优选实施方案中，ECM将非共价地结合来自生物活性级分的生物活性因子的量，例如通过特异性结合本文所讨论的胶原性ECM的天然非胶原性生物活性组分。这继而可以有助于将生物活性因子的量保持在植入部位持续比在ECM材料未被植入时更长的时间和/或增强由生物活性因子赋予的局部生物学作用。
在某些实施方案中，胶原性ECM材料将有利地携带显著负载的来自血小板的生物活性级分的生物活性因子。在优选方面，生物活性组合物包括由胶原性ECM材料携带的生物活性级分的VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB。在这方面，生物活性级分的VEGF可以基于干重至少500皮克、至少1000皮克或至少2000皮克/毫克胶原性细胞外基质材料的水平存在，在一些实施方案中该值在500至5000皮克/毫克或在1000至3000皮克/毫克的范围内；和/或TGF-β以基于干重至少50000皮克、至少100000皮克或至少200000皮克/毫克胶原性细胞外基质材料的水平存在，在一些实施方案中该值在50000至500000的范围内或在每毫克100000至500000皮克的范围内；和/或PDGF-BB以基于干重至少5000皮克、至少7000皮克、至少8000皮克或至少9000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在，其中在在一些实施方案中该值在5000至15000皮克/毫克或在7000至15000皮克/毫克的范围内。应当理解，生长因子的这些负载在本文公开的所有实施方案中并非都是需要的，并且可以以其它形式提供更高或更低的负载。
本发明的粘膜下层或其它ECM组织优选表现出小于约12个内毒素单位(EU)/克，更优选小于约5EU/克，以及最优选小于约1EU/克的内毒素水平。作为另外的优选，粘膜下层或其他ECM材料可具有小于约1个集落形成单位(CFU)/克，更优选小于约0.5CFU/克的生物负载。真菌水平理想地类似地低，例如小于约1CFU/克，更优选小于约0.5CFU/克。核酸水平优选小于约2μg/mg，更优选小于约1μg/mg，而病毒水平优选小于约50个噬斑形成单位(PFU)/克，更优选小于约5PFU/克。
在某些实施方案中，可结合ECM材料的一个或多个分离的单片的表面积考虑内毒素水平。在该情况下，一片ECM材料可以表现出小于约0.25EU/cm2的内毒素水平。在优选实施方案中，一片ECM材料表现出小于约0.2EU/cm2，小于约0.1EU/cm2，甚至小于约0.05/cm2的内毒素水平。在最优选实施方案中，一片ECM材料表现出小于约0.025EU/cm2的内毒素水平。包括多个粘结的或以其它方式连接的ECM材料片的多层ECM结构可基于整个多层结构的表面积表现出相似的内毒素水平。
可以以脱水或水合状态包装或以其他方式储存本发明的具有或不具有施加的血小板的生物活性级分或其他施加物质的胶原性ECM材料。本发明的医疗移植材料的脱水可通过本领域已知的任何方法实现。优选地，通过冻干或真空压制实现脱水，但是也可以使用其它技术，诸如空气干燥。当以干燥状态储存时，通常需要在使用之前再水合经处理的ECM材料。在这方面，任何合适的润湿介质可以用于再水合医疗材料，包括例如水或缓冲盐溶液。
在某些实施方案中，可交联胶原性ECM材料。增加材料内和/或材料的两个或更多个层之间的交联的量(或数量)可以用于增强其强度。然而，医疗移植物材料内的交联也可影响其生物可重塑性或其它生物活性特征。因此，在某些实施方案中，将提供基本上保持其天然交联水平的生物可重塑ECM材料，或者可明智地选择ECM材料内添加的交联的量和/或类型，以保持所需水平的生物可重塑性或其他生物活性特征。
为了在本发明中使用，可以通过光交联技术，或通过施加交联剂(诸如通过化学交联剂)或通过由脱水或其它方法诱导的蛋白质交联来实现经处理的ECM材料的任何引入的交联。可使用的化学交联剂包括例如醛诸如戊二醛、二酰亚胺诸如碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、核糖或其它糖、酰基-叠氮化物、磺基-N-羟基琥珀酰胺，或聚环氧化物化合物，包括例如聚缩水甘油醚诸如乙二醇二缩水甘油醚(可以商品名DENACOL EX810从Nagese Chemical Co.,Osaka,Japan获得)和甘油聚甘油醚(也可以商品名DENACOL EX 313从Nagese Chemical Co.获得)。通常，当使用时，聚甘油醚或其它聚环氧化物化合物每分子将具有2个至约10个环氧基团。优选地，用包含转谷氨酰胺酶的交联剂交联医疗移植物材料。
本发明中使用的胶原性ECM材料可以以各种物理形式提供，以适应各种医学、研究或其他应用。例如，胶原性ECM材料可以作为一个或多个片，糊剂、泡沫、非凝胶水溶液、粉末或凝胶提供。也考虑了这些形式的组合。在这方面，可在如本文所述处理ECM材料或与血小板的生物活性级分组合之前或之后获得ECM材料的构型。另外，可以以更大的体积尺寸制造ECM复合材料，然后将其分成更小的产品。此外，ECM材料可以以天然衍生的层形式提供，或者其本身可以是由天然来源的ECM材料制备的制品，诸如海绵或浇铸片材。
包括胶原性ECM材料和血小板的生物活性级分的本发明的生物活性组合物可广泛用于各种医学(包括兽医)应用。实例包括修复或重建组织，诸如神经组织、真皮组织(诸如在伤口愈合中，例如对外部真皮伤口包括但不限于溃疡(例如糖尿病或其他慢性溃疡)的应用)、心血管组织(包括血管组织和心脏组织)、心包组织、肌肉组织、眼组织、牙周组织、骨、结缔组织诸如腱或韧带，胃肠道瘘(例如被加工成插塞的形式以至少闭塞瘘诸如肛门直肠、直肠阴道或肠外瘘的主要开口)的治疗等。
在一个实施方案中，例如使用如美国专利No.5,275,826和5,516,533中所述的技术将ECM材料作为流化组合物提供。在这方面，ECM材料的溶液或悬浮液可通过粉碎和/或用蛋白酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)消化材料一段足以溶解材料并形成基本上均匀的溶液的时间来制备。ECM材料理想地通过撕裂、切割、研磨、剪切等来粉碎。在冷冻或冷冻干燥状态下研磨材料是有利的，但是也可通过将材料碎片的悬浮液在高速混合器中进行处理并且如果必要通过离心和倾析多余废物进行脱水来获得良好的结果。可以将粉碎的材料干燥(例如冷冻干燥)以形成粉末。此后，如果需要，可将粉末进行水合，即与水或缓冲盐水和任选的其它药学上可接受的赋形剂组合，以形成流体组织移植组合物(例如其在25℃下具有约2至约300,000cps的粘度)。较高粘度的移植组合物可具有凝胶或糊剂稠度。在这些形式中，可将血小板的生物活性级分在任何合适的点(包括例如在干燥粉碎和/或凝胶形式的ECM材料以形成粉末之前)与流化ECM组合物组合，和/或作为用于ECM粉末材料的再水化介质或作为其部分与流化ECM组合物组合。
包含ECM材料和血小板的生物活性级分的流化生物活性组合物可用作需要修复或增强的组织(诸如，骨或软组织)的可注射移植物，最常见地用于矫正创伤或疾病诱导的组织缺陷。本发明的流化组合物还有利地用作用于植入构建体的填充剂，其包含例如形成为用于化妆品或创伤治疗外科手术的密封(缝合)袋的一片或多片胶原性ECM材料。
在一个示例性颗粒制剂中，将如本文所述制备的较大ECM材料(例如通过切割)削减成小块，将其装入平底不锈钢容器中。将液氮引入容器中以冷冻标本，然后将其在冷冻状态下粉碎以形成粗粉末。此类处理可以例如使用手动心轴压机(arbor press)进行，其中圆柱形黄铜锭置于冷冻标本的顶部。锭用作标本与压机的心轴之间的界面。可定期向标本加入液氮以保持它们冷冻。
用于粉碎ECM材料标本的其它方法可用于产生可根据本发明使用的粉末或其它颗粒材料。例如，可以冷冻干燥ECM材料标本，然后使用手动心轴压机或其它研磨装置进行研磨。或者，可在高剪切混合器中处理ECM材料，以在脱水和干燥后产生颗粒材料。
使用预冷的研钵和杵进一步研磨ECM材料颗粒可用于产生一致的、更微细的产品。再次地，可根据需要使用液氮以在最终研磨期间保持固体冷冻颗粒。
为了制备另一种流化ECM材料，可通过金属丝网筛分ECM材料粉末，收集其，并将其经历蛋白水解消化以形成基本上均匀的溶液。例如，粉末可用1mg/ml胃蛋白酶(SigmaChemical Co.,St.Louis Mo.)和0.1M乙酸(用HCl调节至pH 2.5)在室温下消化48小时。在该处理之后，可用氢氧化钠(NaOH)中和反应介质以灭活消化活性。然后可通过溶液的盐沉淀来浓缩溶解的ECM材料，并将其分离以用于进一步纯化和/或冷冻干燥，以形成呈粉末形式的蛋白酶增溶的胶原性ECM材料。该ECM粉末形式还可包括血小板的生物活性部分(例如在干燥ECM材料以形成粉末之前或之后组合的)。
本发明的流化组合物在组织置换、增强和/或修复中有广泛的应用。流化组合物可用于诱导天然结缔组织或骨在现有缺陷的区域中再生长。通过将有效量的流化组合物注射至组织缺陷的部位或需要愈合的伤口的部位，可以容易地利用组合物的生物活性性质。
在整形外科应用中，可以例如使用美国专利No.5,641,518中描述的一般技术，将包括胶原性生物材料和血小板的生物活性级分的本发明的生物活性组合物用于修复骨组织。因此，可将粉末或其它颗粒形式的生物活性组合物植入损伤或患病的骨区域以进行修复。颗粒组合物可以单独使用，或与一种或多种另外的生物活性剂诸如生理上相容的矿物质、生长因子、抗生素、化学治疗剂、抗原、抗体、酶和激素组合使用。在某些形式中，颗粒形式的植入物将被压缩成预定的三维形状，其将被植入骨区域中，并且在用内源组织置换移植物期间将基本上保持其形状。
包括胶原性ECM材料和血小板的生物活性级分的本文中的生物活性组合物也可用作例如呈片状、糊状或凝胶状的细胞生长基质(可能与支持受试细胞例如真核细胞诸如间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、胎儿皮肤细胞、骨肉瘤细胞或腺癌细胞生长的营养物组合)(参见例如国际PCT申请公开No.WO 96/24661)。在优选形式中，底物组合物将支持人和/或其它哺乳动物细胞(包括干细胞，诸如间充质干细胞)的增殖和/或分化。
包括胶原性ECM材料和血小板的生物活性级分的本发明的生物活性组合物也可用于使用类似于在Ann.Plast.Surg.,1995,35:374-380；和J.Surg.Res.,1996,60:107-114中描述的那些技术的技术进行体壁修复，包括例如用于腹壁缺损诸如疝气的修复。在这样的应用中，本发明的优选医疗移植材料促进重塑组织中有利的组织、血管供应和一致性。在皮肤病学应用中，本发明的生物活性组合物可用于使用本领域和文献已知的一般移植技术(参见例如Annals of Plastic Surgery 1995,35:381-388)修复部分或完全厚度的伤口以及增大皮肤。另外，在烧伤治疗领域中，通常已知提供真皮替代物，可将培养的表皮移植物(优选地培养的表皮自体移植物或CEA)移植至其上。此类培养的移植物通常包括将角质形成细胞和/或成纤维细胞移植至真皮替代物上。根据本发明，包括胶原性ECM材料和血小板的生物活性级分的生物活性组合物可用作例如呈片状形式的真皮替代物，从而将CEA移植至材料上。
本发明的生物活性组合物还可在泌尿生殖应用中用于组织移植。例如，所述组合物可通过使用对应于美国专利No.5,645,860；Urology,1995,46:396-400；和J.Urology,1996,155:2098中一般性描述的那些技术的技术，用于膀胱修复以提供用于膀胱再生的支架。在流化形式中，本发明的生物活性组合物还可用于内窥镜注射方法以校正膀胱输尿管反流。在此类应用中，可例如在患者的输尿管口下方的区域中进行注射，以在注射部位诱导平滑肌生长和胶原形成。
通常，当被构造来用作组织移植物时，包含在本发明的材料中的ECM材料可包括一片或多片ECM材料片，其可被切割或以其它方式构造成用于其最终用途的期望尺寸。在许多情况下，移植材料的尺寸大于其所应用的组织缺陷。以该方式对医用移植物材料设定尺寸允许容易地附接至周围组织。
一旦ECM移植物材料(包括施加的血小板的生物活性级分)已被置于缺陷上、缺陷中或其周围，则可使用几种已知的合适的附接方法中的任何一种将材料附接至周围组织。合适的附接方法包括例如生物相容性粘合剂(例如，纤维蛋白胶)、钉合、缝合等。优选地，通过缝合将医疗移植材料附接至周围组织。存在各种用作缝合线的本领域目前可用的合成材料。例如，包括ProleneTM、VicrylTM、MersileneTM、PanacrylTM和MonocrylTM的缝合线预期用于本发明。其它缝合材料对于本领域技术人员是熟知的。因此，上述材料仅仅用作实例，因此决不是限制性的。
在其它领域中，包括胶原性ECM材料和血小板的生物活性级分的生物活性组合物可用于神经学应用中，例如用于需要硬膜替代物来修复由创伤、肿瘤切除或解压方法引起的缺陷的技术中。
在片状形式中，本发明的ECM材料可由单层或多层材料组成，其具有施加至其至少一部分和可能全部的血小板的生物活性级分。因此，在某些实施方案中，可使用ECM材料的单个分离层或多层ECM构建体。用于本发明的示例性多层ECM构建体可以例如具有层压在一起的两个至约十个分离的ECM层。
用于本发明的多层ECM构建体可以以任何合适的方式制备。在这方面，可使用用于将ECM层层压在一起的各种技术。这些技术包括例如在加热、非加热或冻干条件下使用粘合剂(adhesive)、胶水或其他粘合剂(bonding agent)的脱水热粘结、利用化学试剂或辐射(包括UV辐射)的交联，或这些技术彼此的任何组合或其它合适的方法。关于可用于本发明的多层ECM构建体的其它信息及其制备方法，可参考例如美国专利No.5,711,969、5,755,791、5,855,619、5,955,110、5,968,096和美国专利申请公开No.20050049638。
用于本发明的单层ECM或多层ECM构建体或其它生物相容性材料可在其结构中具有或缺少穿孔或狭缝，并且在某些实施方案中可具有例如美国专利申请公开No.20050021141中所述的网状结构。此类网状图案化结构可用于提供可高度变形以用于本发明的ECM或其它植入物节段。
在另外的实施方案中，可将本发明中使用的ECM经历使材料膨胀的方法。在某些形式中，此类膨胀材料可通过将ECM材料与一种或多种碱性物质受控接触直到材料膨胀，以及分离膨胀材料来形成。说明性地，接触可以足以将ECM材料膨胀至其原始总体积的至少120％(即1.2倍)，或在某些形式中膨胀至至少其原始体积的两倍。此后，可任选地例如通过中和和/或漂洗将膨胀材料与碱性介质分离。收集的膨胀材料可以以任何合适的方式用于医疗装置的制备。说明性地，可在具有所需形状或构造的移植物构建体的形成中使膨胀材料富含生物活性成分、干燥和/或模制等。在某些实施方案中，用膨胀的ECM材料形成的医疗移植物材料和/或装置可以是高度可压缩的(或可膨胀的)，以使得材料可以被压缩以用于诸如从管状递送装置的管腔内递送，在从装置展开时膨胀以便锚固在患者体内和/或使患者体内的管道闭合。
膨胀的ECM材料可以通过如上所述的经处理的ECM材料与水溶液或含有氢氧化钠的其它介质的受控接触来形成。材料的碱处理可引起材料的物理结构变化，这进而导致其膨胀。此类变化可包括材料中胶原的变性。在某些实施方案中，优选将材料膨胀至其原始总体积的至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，或至少约6倍或甚至更多倍。膨胀的大小与几个因素有关，包括例如在待膨胀的材料的处理中使用的碱性介质的浓度或pH、暴露时间和温度。
可被处理以制备膨胀材料的ECM材料可包括本文公开的那些或其它合适的ECM中的任何一种。典型的此类ECM材料将包括具有天然存在的分子内交联和天然存在的分子间交联的胶原原纤维网络。在如本文所述的膨胀过程后，天然存在的分子内交联和天然存在的分子间交联可以保留在经处理的胶原性基质材料中，足以将胶原性基质材料保持为完整的胶原性片材；然而，胶原性片材中的胶原原纤维可以变性，并且胶原性片材可具有大于原材料厚度的碱处理厚度，例如原始厚度的至少120％，或原始厚度的至少2倍。
说明性地，用于处理可重塑材料的碱性物质的浓度可以在约0.5至约2M的范围内，更优选约1M的浓度。另外，在某些实施方案中，碱性物质的pH可为约8至约14。在优选方面，碱性物质的pH为约10至约14，最优选约12至约14。
除了浓度和pH之外，如上所述，其它因素诸如温度和暴露时间将有助于膨胀的程度。在这方面，在某些变型中，胶原性材料暴露于碱性物质在约4至约45℃的温度下进行。在优选实施方案中，暴露在约25至约40℃的温度下进行，37℃是最优选的。此外，暴露时间可以为至少约1分钟至多约5小时或更长。在一些实施方案中，暴露时间为约1至约2小时。在特别优选的实施方案中，在约37℃的温度下将胶原性材料暴露于pH为14的1M NaOH溶液中，持续约1.5至2小时。这种处理导致胶原变性和可重塑材料的充分膨胀。可将材料的胶原基质的变性观察为材料的胶原填充特性的变化，例如原始材料的紧密结合的胶原性网络的实质性破坏。未膨胀ECM或其他胶原性材料可具有紧密结合的胶原性网络，当用肉眼或在中等放大倍数(例如100倍放大)下观察时，呈现基本上均匀的连续表面。相反，膨胀的胶原性材料可具有完全不同的表面，因为当在同一个放大倍数(例如约100倍)下观察时，表面不是连续的，而是在许多区域中存在胶原链或束，所述胶原链或束由链或束之间的材料中的实质性间隙隔开。因此，膨胀的胶原性材料通常表现为比相应的未膨胀的胶原性材料更多孔。此外，在许多情况下，可以例如通过测量相较于未经处理的原始材料对水或其它流体通过的渗透性增加，证明膨胀的胶原性材料具有增加的孔隙率。膨胀的ECM或其他胶原性材料的更多的泡沫和多孔结构可允许将材料浇铸或以其它方式制备成各种海绵或泡沫形状，以用于制备医疗材料和装置。其还可以允许制备高度可压缩且在压缩后膨胀的构建体。这样的性质可以是有用的，例如，当制备的医疗移植物材料被压缩并加载至用于递送至患者体内的展开装置(例如其腔)中，并且此后展开以在植入部位膨胀时。
在这样的碱处理之后，可将材料与碱性介质分离并处理以备进一步使用。说明性地，在进一步处理材料以形成本发明的医疗移植材料之前，可中和和/或用水漂洗收集的材料以从材料中除去碱度。
还可将本发明的生物活性组合物与一种或多种次级组分结合使用以构建各种医疗装置。在某些实施方案中，将生物活性组合物固定至可膨胀构件，诸如自膨胀或可强制膨胀的(例如球囊可膨胀的)支架或框架。本发明的此类装置可适于部属在心血管系统内，包括在动脉或静脉内。某些装置适于作为血管瓣膜，例如用于在动脉内经皮植入，或在腿或足的静脉内以治疗静脉功能不全。
可将用本发明的生物活性组合物制备的假体瓣膜装置作为无框瓣膜装置植入身体通道中，或者如上所述，可将ECM材料(具有施加的血小板的生物活性级分)附接至可膨胀的框架。可将生物活性组合物用于形成生物相容性覆盖物诸如套管和/或形成小叶或其它瓣膜结构(参见诸如WO 99/62431和WO 01/19285)。在形成瓣膜结构的一个模式中，可将呈片状形式的生物活性组合物以其籍以形成1个、2个或更多个小叶、尖顶、口袋或类似结构的方式附接至支架，所述小叶、尖顶、口袋或类似结构阻止在一个方向上相对于另一个方向的流动。在此类装置的具体应用中，将构造为血管瓣膜的此类装置植入以治疗人的静脉功能不全(例如在腿中发生的)。
根据某些发明变型，本公开内容包括制备生物活性组合物的方法，其包括将哺乳动物血小板的生物活性级分施加于胶原性细胞外基质材料。可以以任何合适的方式施加生物活性级分。在一些形式中，通过将胶原性ECM材料浸渍或浸泡在生物活性级分的液体组合物或包括生物活性级分的液体组合物中，或通过用生物活性级分的液体组合物或包括生物活性级分的液体组合物对胶原性ECM材料进行喷雾，来施加生物活性级分。
在某些实施方案中，在施加生物活性级分后漂洗胶原性ECM材料。根据实施所公开的方法的一些模式，漂洗胶原性ECM材料以从胶原性细胞外基质材料中除去一部分生物活性级分，例如通过此类漂洗从胶原性ECM材料除去一种生物活性因子的至少一部分，可能多种生物活性因子中的每一种的一部分。在某些形式中，漂洗将相对于其他生物活性因子优先地去除一种或一些生物活性因子，导致残留在胶原性ECM材料上的优先去除的生物活性因子的水平(例如以重量百分比计)的百分比降低得比其他生物活性因子大。这样，可实现经修饰的生物活性胶原性ECM材料的有利的组成谱。
在一些形式中，所公开的方法还包括干燥胶原性ECM材料。胶原性ECM材料可在施加生物活性级分之后干燥。在某些实施方案中，胶原性ECM材料在材料漂洗后干燥，而在其它实施方案中，胶原性ECM材料在不漂洗的情况下干燥。在一些形式中，将胶原性ECM材料(包括所施加的血小板的生物活性级分)冻干(诸如，在不漂洗的情况下或在漂洗之后，以去除所施加的血小板的生物活性级分的一部分)。
所公开的方法还可包括将生物活性组合物包装在无菌容器中。在一些形式中，生物活性组合物在干燥后包装。还设想可以分开包装生物活性级分，例如如图2中所示。在一些形式中，将生物活性级分和胶原性ECM材料分开无菌包装(以便在使用前组合)，例如包括在包括无菌包装的组分和其它可能组分的试剂盒中。试剂盒可以例如包括这样的包装，其含有在其自身的无菌容器中包含生物活性级分，和在其自身的无菌容器中的胶原性ECM材料。试剂盒中还可包括一个或多个混合或润湿容器，诸如注射器或桶或盘，以及可能需要重构或以其它方式湿润胶原性ECM材料和/或生物活性级分(例如，当以干燥形式(诸如冻干或空气干燥形式)包装任一种或两种时)的任何液体介质。另外或可选地，预期在使用中治疗患者时，可在给予患者之前将胶原性ECM材料、生物活性级分或其组合与来自待治疗患者的自体生物材料例如待治疗的患者的液体血液或液体血液级分(例如血清)组合。此类自体生物材料可向施用的组合物提供额外的生物活性物质，诸如自体生长因子或其他自体蛋白。
为了促进对本公开内容的方面及其特征和有利方面的进一步理解，提供以下具体实施例。应当理解，这些实施例是本公开内容的说明性的，而不是限制实施方案。
实施例
实施例1
人血小板裂解物组合物的制备
收集在5天保质期后刚过期的经疾病筛选的经单采血液成分术的人血小板单位(获自外周血)，并在-20℃下于冷冻器中冷冻直至使用。将许多单位(例如约10个单位)从冷冻器中取出并在室温下解冻，从而裂解血小板并形成“原始hPL”组合物。将来自所选单位的原始hPL合并至袋中。将氯化钙以0.7克/升(约6mM CaCl2)的水平添加至合并的原始hPL中，然后在室温下于摇床上与原始hPL充分混合2小时。混合后，使经CaCl2处理的原始hPL在室温下凝固过夜，在此期间从原始hPL的体积形成坚实的基本上均匀的凝固凝胶块。
在保持闭合的同时，用手手动压制含有原始hPL的凝胶块的袋子以从凝胶块压出液体。充分地进行该压制，以在袋的一端得到固体凝固块并在袋的与出口喷口相邻的另一端产生分开的液体体积。分开的液体代表原始体积的约75-80％的合并的原始hPL，并且固体凝块材料代表剩余部分。将液体从袋子转移至体积为100L的第二个冷藏袋中。进行足够数量的此种解冻-合并-凝固-压制运行以用液体填充冷藏的100L袋。
将100L袋中液体无菌地连接至过滤器串(filter train)并且通过其进行处理，所述过滤器链由第一深度过滤串(具有带有正表面电荷和3至0.2微米的标称微米额定值的过滤介质)和第二深度过滤器(具有带正表面电荷和0.1至0.001微米的标称微米额定值的过滤介质)构成。过滤以约100升/平方米的过滤器表面积/小时(“LMH”)的滤液通量速率进行。第一深度过滤器由Millistack Pod过滤器(Grade C0系列HC深度过滤器)提供，第二深度过滤器由Millistack Pod过滤器(Grade XO系列HC深度过滤器)提供，两者均可从MilliporeCorporation商购获得。这些过滤器中的每一个具有由纤维素的混合酯组成的膜和由纤维素纤维与无机助滤剂(硅藻土)组成的过滤介质。在处理100L袋的材料之前，用无菌蒸馏水灌注过滤器串。将离开过滤器串的hPL液体收集到第二100L袋中。
将第二100L hPL袋无菌地连接至无菌过滤器并通过其泵送至较小的容器例如100mL或500mL罐(例如Nalgene罐)中。这可在无菌填充条件下进行。可收缩包装罐以覆盖它们的封端，并且标记其。
根据本实施例生产的hPL产物具有如本文所述的组成谱，并且可用作细胞培养基的补充物，而不需要添加肝素以防止凝块形成。将该hPL产物加入细胞培养基中甚至不添加肝素的情况下得到基本上无凝块的培养基。如此所产生的细胞培养基在细胞(包括但不限于骨髓间充质细胞、脂肪细胞干细胞、胎盘来源的间充质干细胞和肌肉来源的干细胞或祖细胞)培养中表现出优异的性质，在优选用途中可获得的在给定的培养期后具有相对高的细胞计数或百分比汇合。
实施例2
利用人血小板裂解物处理的基质材料的分析
进行研究以分析不同生物材料递送人血小板裂解物的生长因子和细胞增殖能力的能力。所测试的生物材料是小肠粘膜下层(SIS，Cook Biotech Inc.-包括来源组织的显著保留的天然生物活性材料，包括sGAG、纤连蛋白)、真皮(LifeCell)、心包(Synovis)和可吸收的合成聚合物(Gore)。粘膜下层样品包含已被冻干和环氧乙烷灭菌的8层SIS构建体，得到片材构造，其中1cm2的片重约0.024克。对于每个测定，用无菌剪刀从每种测试材料切割6个测试样品(0.5cm×2cm条带)，并将其放入标记的无菌1.5ml Eppendorf管中。
ELISA测定
对于每个测定的每种测试材料，将1ml人血小板裂解物(HPL)添加至测试样品管的一半，以及添加至3个另外的空管(HPL对照样品)，以进行ELISA测试。将1ml的1×PBS添加至未接受HPL的其他样品管中作为未处理测试制品。将管置于管式旋转器上于室温下持续1小时。用无菌镊子从管中轻轻取出测试制品，并置于新的标记的1.5ml Eppendorf管中。将ELISA测试制品的先前测试制品管储存以用于耗尽样品。
向每个样品管(经处理的和未经处理的)中加入400μl的1×PBS。用晶体研磨机将样品研磨三次，每次30秒。然后将样品管以12,000rpm离心5分钟，然后将提取物转移至新的1.5ml Eppendorf管中，并在制冷器中储存过夜。第二天，按照来自R&D Systems的Quantikine ELISA测试的ELISA试剂盒方案的说明，在ELISA测试试剂盒方案之前或之内将HPL对照样品、耗尽样品和测试制品提取物稀释至适当的稀释度：TGF-β(#DB100B)，PDGF-BB(DBB00)和VEGF(DVE00)。TGF-β稀释度＝1:00(包括激活数)。VEGF稀释度＝无。PDGF-BB稀释度＝1:5。按照如下表1包括的板的图，将ELISA标准品、HPL对照样品、耗尽样品、经处理的测试样品提取物和未经处理的测试样品提取物一式两份铺板，按照试剂盒方案进行ELISA。
表1
上面详述的ELISA测定的结果示于图3a、3b、4a、4b、5a和5b中。图3a、4a和5a是表示从如上所述的测试生物材料提取的VEGF、TGF-β和PDGF-BB的量的图表。在每个测试中，使用1ml HPL与1cm2生物材料，因此结果表示pg/ml HPL和pg/cm2的生物材料。参考图3a，从SIS样品中提取53pg的VEGF，从真皮中提取3pg，从心包提取2pg，从合成的可吸收聚合物提取0pg。参考图4a，从SIS样品中提取6542pg的TGF-β，从真皮中提取793pg，从心包提取2128pg，从合成的可吸收聚合物提取11pg。参考图5a，从SIS样品中提取237pg的PDGF-BB，从真皮中提取198pg，从心包提取97pg，从合成的可吸收聚合物提取62pg。
图3b、4b和5b是表示结合至生物材料的所述生长因子(分别是VEGF、TGF-β和PDGF-BB)的百分数的图表。通过将通过如上详述的提取获得的平均量(pg)除以在1ml经历相同环境条件的HPL中检测到的平均量(pg)来计算百分数。参考图3b，从SIS样品中提取8.4％的VEGF，从真皮提取0.5％，从心包提取0.3％，从合成的可吸收聚合物提取0％。参考图4b，从SIS样品中提取6.8％的TGF-β，从真皮提取0.8％，从心包提取2.2％，从合成的可吸收聚合物提取0％。参考图5b，从SIS样品中提取4.6％的PDGF-BB，从真皮提取3.8％，从心包提取1.9％，以及从合成的可吸收聚合物提取1.2％。
设想通过增加或降低ECM材料体积与HPL的比例可优化被胶原性ECM材料保留的生长因子的量。进一步设想，被胶原性ECM材料保留的生长因子的量可因ECM材料和生长因子之间的强结合而超过提取的量。例如，已显示ECM组分诸如纤连蛋白强烈结合生长因子，这可能阻止它们被提取。
MTT增殖测定
进行MTT测定(ATCC MTT细胞增殖测定)以测量在完全培养基、5％HPL或无血清培养基中培养的一组细胞的生存力。如上所述制备生物材料样品。对于每个测定的每种测试材料，将1ml人血小板裂解物添加至测试样品管的一半。将1ml透明的SF-dMEM添加至未接受HPL的另外的样品管作为未经处理的测试制品。将管置于管式旋转器上于室温下持续1小时。用无菌镊子从管中轻轻取出测试制品，并置于新的标记的1.5ml Eppendorf管中。
向每个样品管(经处理的和未经处理的)中加入1ml澄清的SF-dMEM。将管在轨道式摇床(～100rpm)上温育24小时。将NIH 3T3细胞(每孔10,000个)在完全培养基中铺板在96孔板中。将板在37℃下用5％CO2培养过夜。最后三行的前三个孔(E1:H3)没有细胞用于平板吸收对照孔。使用多通道移液管对96孔板的孔进行抽吸，留下微量的培养基以防止细胞变干。向每个孔中添加100μl无血清培养基以漂洗出完全培养基。对于下表2中所示的每种对照溶液，对三个孔进行抽吸，并根据包括在下表3中的板的图向每个孔中加入100μl适当的溶液。对于每个测试和对照样品管，在平板上对3个孔进行抽吸，通过移液管上下吹吸混合试验样品管3次，将100μl的每种提取物转移至3个孔中的每一个(每个提取物一式三份)。
表2
阳性对照 完全培养基
HPL对照 无血清培养基中的5％的HPL
阴性对照 无血清培养基
板吸收对照 无细胞的无血清培养基
表3
将板在37℃下用5％CO2温育72小时。向每个孔中添加10μl MTT试剂，并将平板返回细胞培养培养箱中2-4小时，在此期间，定期在倒置显微镜下观察细胞是否存在细胞内点状紫色沉淀物。当紫色沉淀物在显微镜下清晰可见时，将100μl来自MTT试剂盒的去垢剂试剂添加至所有孔中并轻轻涡旋。将板盖上并在室温下不搅拌放置2-4小时。在96孔酶标仪中于570nm测量每个孔中的吸光度。对于真实的吸光度值，从板吸收对照(SF-dMEM，无细胞)的平均值中减去三次重复的孔读数的平均值。
上文详述的MTT测定的结果示于图6a和6b中。代谢活性是多少细胞仍然存活和具有功能的指标。图6a是表示如上详述的被给予完全培养基、无血清培养基、SIS、真皮、心包或合成的可吸收聚合物的样品的MTT吸光度的图表。图6b显示了作为完全培养基样品的吸光度的百分比的四种测试的生物材料的MTT吸光度。SIS样品显示0.181的MTT吸光度，完全培养基样品显示44.4％的MTT吸光度，而真皮、心包和合成样品的表现与无血清培养基类似。
某些实施方案的列表
以下提供了本文公开的一些实施例的枚举列表。应当理解，这是实施方案的非限制性列表，并且在上文的讨论中公开了其他实施方案。
1.一种组合物，其包含：
胶原性细胞外基质材料；和
施加于胶原性细胞外基质材料的哺乳动物血小板的生物活性级分。
2.实施方案1的组合物，其中所述哺乳动物血小板是人血小板。
3.实施方案1或2的组合物，其中所述生物活性级分包括TGF-β1，EGF，碱性FGF，PDGF-AA，PDGF-BB，SDF-1α和VEGF中的至少一种。
4.实施方案3的组合物，其中所述生物活性级分包括TGF-β1，EGF，碱性FGF，PDGF-AA，PDGF-BB，SDF-1α和VEGF。
5.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是人血液来源的血小板浓缩物的生物活性级分，所述血小板浓缩物含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含血小板浓缩物的天然组分，包括TGF-β1，EGF，碱性FGF，PDGF-AA，PDGF-BB，SDF-1α和VEGF中的至少一种以及纤维蛋白原，白蛋白，球蛋白。
6.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分的纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的水平存在。
7.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分基本上不含肝素。
8.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分还包括对于所述血小板来说是天然的IL-1b，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13，IL-17，IFNγ和TNF-α中的至少一种，并且优选包括它们中的每一种。
9.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述组合物包含：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
10.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-BB的浓度小于1000pg/ml。
11.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-AA的浓度小于3000pg/ml。
12.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的TGF-β1的浓度为至少5000pg/ml。
13.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的VEGF浓度小于300pg/ml。
14.任何前述实施方案的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分包括衍生自所述血小板的以下组分：
为所述液体生物活性级分的低于20,000ng/mL水平的纤维蛋白原；
为所述液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为所述液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为所述液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为所述液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为所述液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为所述液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和
为所述液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
15.任何前述实施方案的组合物，其中：
所述生物活性级分具有260-340mmol/kg的同渗浓度。
16.前述实施方案的任一项的组合物，其中：
所述生物活性级分具有在6.8至7.8的范围内的pH。
17.一种制备生物活性组合物的方法，其包括：
将哺乳动物血小板的生物活性级分施加于胶原性细胞外基质材料。
18.实施方案17的方法，其中所述哺乳动物血小板是人血小板。
19.实施方案17或18的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1，EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种。
20.实施方案17至19的任一项的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。
21.实施方案17至20的任一项的方法，其中所述生物活性级分是人血液来源的血小板浓缩物的生物活性级分，所述血小板浓缩物含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含血小板浓缩物的天然组分，包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种以及纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白。
22.实施方案17至21的任一项的方法，其中所述生物活性级分的纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的水平存在。
23.实施方案17至22的任一项的方法，其中所述生物活性级分基本上不含肝素。
24.实施方案17至23的任一项的方法，其中所述生物活性级分还包括对于血小板而言是天然的IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和TNF-α中的至少一种，并且优选包括它们中的每一种。
25.实施方案17至24的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述组合物包括：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
26.实施方案17至25的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-BB的浓度小于1000pg/ml。
27.实施方案17至26的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-AA的浓度小于3000pg/ml。
28.实施方案17至27的任一项所述的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的TGF-β1浓度为至少5000pg/ml。
29.实施方案17至28的任一项所述的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的VEGF浓度小于300pg/ml。
30.实施方案17至29的任一项所述的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分包括衍生自所述血小板的以下组分：
为所述液体生物活性级分的低于20,000ng/mL水平的纤维蛋白原；
为所述液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为所述液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为所述液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为所述液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为所述液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为所述液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和
为所述液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
31.实施例17至30的任一项所述的方法，其中：
所述生物活性级分具有260-340mmol/kg的同渗浓度。
32.实施例17至31的任一项所述的方法，其中：
所述生物活性级分具有在6.8至7.8的范围内的pH。
33.实施方案17至32的任一项的方法，其还包含在所述施加后干燥所述胶原性细胞外基质材料。
34.实施方案33的方法，其中所述干燥包括冻干。
35.实施方案17至34的任一项所述的方法，其还包括将所述生物活性组合物包装在无菌容器中。
36.实施方案17至35的任一项所述的方法，其还包括在所述施加之后漂洗所述胶原性细胞外基质，以从所述胶原性细胞外基质材料中除去所述生物活性级分的一部分。
37.实施方案36的方法，其中所述部分包括一定量的至少一种生长因子，并且优选包括多种生长因子。
38.实施方案36或37的方法，其还包括在所述漂洗后干燥所述胶原性细胞外基质材料。
39.实施方案38的方法，其中所述干燥包括冻干。
40.实施方案38或39的方法，其还包括在所述干燥后将生物活性组合物包装在无菌容器中。
41.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料包括胶原和非胶原组分。
42.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原细胞外基质(ECM)材料包括对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
43.实施方案42的组合物或方法，其中所述保留的天然硫酸化糖胺聚糖以每克胶原性细胞外基质材料至少约500微克的水平存在。
44.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料包括粘膜下层。
45.实施方案44的组合物或方法，其中所述粘膜下层是肠、膀胱或胃的粘膜下层。
46.实施方案45的组合物或方法，其中所述粘膜下层是小肠粘膜下层(SIS)。
47.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是猪、牛、羊或马的细胞外基质材料。
48.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片、凝胶、非凝胶水性组合物、颗粒材料或海绵的形式。
49.实施方案48的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片状形式。
50.实施方案49的组合物或方法，其中所述片状形式对于来源组织而言是天然的。
51.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约500μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
52.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约1000μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
53.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料具有来自施加于其的生物活性级分的生长因子，其中所述生长因子至少包括VEGF、TGF-β和PDGF-BB。
54.实施方案53的组合物或方法，其中：
VEGF以基于干重计至少500皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；
TGF-β以基于干重计至少50,000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；和/或
PDGF-BB以基于干重计至少5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在。
55.实施方案54的组合物或方法，其中：
所述VEGF的水平为基于干重计至少1000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平为基于干重计至少100000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB水平为基于干重计至少7000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
56.实施方案54或55的组合物或方法，其中：
所述VEGF的水平不超过基于干重计5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平不超过基于干重计500000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB的水平不超过基于干重计15000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
57.实施方案53、54、55或56的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料保留对胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的纤连蛋白。
58.实施方案57的组合物或方法，其中一定量的VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB结合至对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或纤连蛋白。
59.前述实施方案的任一项的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是从哺乳动物来源组织分离的脱细胞化胶原性组织膜。
60.一种治疗患者的方法，所述患者任选为人类患者，所述方法包括向所述患者施用任何前述实施方案的组合物，或通过任何前述实施方案的方法制备的组合物。
61.一种用于治疗患者的方法，其包括：
在植入部位提供包含胶原性细胞外基质材料和血小板的生物活性级分的生物活性组合物；和
将一定量的所述生物活性级分的至少一种生物活性因子结合至所述胶原性细胞外基质材料，以便阻止所述至少一种生物活性因子从所述植入部位迁移。
62.实施方案61的方法，其中所述结合在所述提供之前发生。
63.实施方案61的方法，其中所述结合在所述提供之后发生。
64.实施方案61至63的任一项的方法，其中所述至少一种生物活性因子包括VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB，并且所述结合抵抗VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB的迁移。
65.实施方案61至64的任一项的方法，其中所述哺乳动物血小板是人血小板。
66.实施方案61至65的任一项的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种。
67.实施方案66的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。
68.实施方案61至66的任一项的方法，其中所述生物活性级分是人血液来源的血小板浓缩物的生物活性级分，所述血小板浓缩物含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含血小板浓缩物的天然组分，包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种以及纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白。
69.实施方案61至68的任一项的方法，其中所述生物活性级分的纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的水平存在。
70.实施方案61至69的任一项的方法，其中所述生物活性级分基本上不含肝素。
71.实施方案61至70的任一项的方法，其中所述生物活性级分还包括对于所述对血小板而言是天然的IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和TNF-α中的至少一种，并且优选包括它们中的每一种。
72.实施方案61至71的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述液体生物活性级分包括：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
73.实施方案61至72的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-BB的浓度小于1000pg/ml。
74.实施方案61至73的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-AA的浓度小于3000pg/ml。
75.实施方案61至74的任一项所述的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的TGF-β1的浓度为至少5000pg/ml。
76.实施方案61至75的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的VEGF浓度小于300pg/ml。
77.实施方案61至76的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分包括衍生自所述血小板的以下组分：
为所述液体生物活性级分的低于20,000ng/mL水平的纤维蛋白原；
为所述液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为所述液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为所述液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为所述液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为所述液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为所述液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和
为所述液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
78.实施方案61至77的任一项的方法，其中：
所述生物活性级分具有260-340mmol/kg的同渗浓度。
79.实施方案61至78的任一项的方法，其中：
所述生物活性级分具有在6.8至7.8的范围内的pH。
80.实施方案61至79的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是猪、牛、羊或马的细胞外基质材料。
81.实施方案61至80的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片、凝胶、非凝胶水性组合物、颗粒材料或海绵的形式。
82.实施方案81的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片状形式。
83.实施方案82的方法，其中所述片状形式对于所述源组织而言是天然的。
84.实施方案61至83的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料以基于干重计至少约500μg/克的胶原性ECM材料的水平包含保留的对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的硫酸化糖胺聚糖。
85.实施方案61至84的任一项的方法，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约1000μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
86.实施方案61至85的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料包括施加于其上的生物活性级分的VEGF、TGF-β和PDGF-BB。
87.实施方案86的方法，其中：
VEGF以基于干重计至少500皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；
TGF-β以基于干重计至少50,000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；和/或
PDGF-BB以基于干重计至少5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在。
88.实施方案87的方法，其中：
所述VEGF的水平为基于干重计至少1000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平为基于干重计至少100000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB水平为基于干重计至少7000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
89.实施方案87或88的方法，其中：
所述VEGF的水平不超过基于干重计5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平不超过基于干重计500000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB的水平不超过基于干重计15000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
90.实施方案86、87、88或89的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料保留对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的纤连蛋白。
91.实施方案90的方法，其中所述结合包括VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB与对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或纤连蛋白的结合量。
92.实施方案61至91的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是从哺乳动物来源组织分离的脱细胞化胶原性组织膜。
93.一种用于制备组合物的试剂盒，其包含实施方案1至92的任一项中定义的胶原性细胞外基质材料和实施方案1至92的任一项中定义的哺乳动物血小板的生物活性级分；任选地其中所述试剂盒包括含有所述胶原性细胞外基质材料和哺乳动物血小板的生物活性级分的包装和/或其中所述胶原性细胞外基质材料和哺乳动物血小板的生物活性级分各自被无菌包封在其自己的容器中，和/或其中所述试剂盒还包括至少一个用于组合胶原性细胞外基质材料和哺乳动物血小板的生物活性级分的容器(例如，用于混合或润湿的注射器或桶)。
94.实施方案93的试剂盒，其中所述胶原性细胞外基质材料和/或哺乳动物血小板的生物活性级分呈干燥形式，优选冻干形式。
95.实施方案94的试剂盒，其中所述哺乳动物血小板的生物活性级分呈干燥形式，并且还包括无菌包封用于重构所述哺乳动物血小板的生物活性级分的液体介质的小瓶或其它容器。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求和上述实施例的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”和类似指示物应被解释为涵盖单数和复数。除非本文中另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。除非另有要求，本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、操作机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、操作机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的，应当理解，仅示出和描述了选定的实施方案，并且落入如本文或所附权利要求所限定的本发明的精神内的所有等同物、变化和修改期望被保护。

Claims (96)

1.一种组合物，其包含：
胶原性细胞外基质材料；和
施加于所述胶原性细胞外基质材料的哺乳动物血小板的生物活性级分。
2.权利要求1的组合物，其中所述哺乳动物血小板是人血小板。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述生物活性级分包括TGF-β1，EGF，碱性FGF，PDGF-AA，PDGF-BB，SDF-1α和VEGF中的至少一种。
4.权利要求3的组合物，其中所述生物活性级分包括TGF-β1，EGF，碱性FGF，PDGF-AA，PDGF-BB，SDF-1α和VEGF。
5.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是人血液来源的血小板浓缩物的生物活性级分，所述血小板浓缩物含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含血小板浓缩物的天然组分，包括TGF-β1，EGF，碱性FGF，PDGF-AA，PDGF-BB，SDF-1α和VEGF中的至少一种以及纤维蛋白原，白蛋白，球蛋白。
6.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分中的纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的水平存在。
7.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分基本上不含肝素。
8.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分还包括对于所述血小板来说是天然的IL-1b，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13，IL-17，IFNγ和TNF-α中的至少一种，并且优选包括它们中的每一种。
9.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述组合物包括：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
10.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-BB的浓度小于1000pg/ml。
11.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-AA的浓度小于3000pg/ml。
12.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的TGF-β1的浓度为至少5000pg/ml。
13.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的VEGF浓度小于300pg/ml。
14.权利要求1的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分包括衍生自所述血小板的以下组分：
为所述液体生物活性级分的低于20,000ng/mL水平的纤维蛋白原；
为所述液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为所述液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为所述液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为所述液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为所述液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为所述液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和
为所述液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
15.权利要求1的组合物，其中：
所述生物活性级分具有260-340mmol/kg的同渗浓度。
16.权利要求1的组合物，其中：
所述生物活性级分具有在6.8至7.8的范围内的pH。
17.一种制备生物活性组合物的方法，其包括：
将哺乳动物血小板的生物活性级分施加于胶原性细胞外基质材料。
18.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物血小板是人血小板。
19.权利要求17或18的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1，EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种。
20.权利要求17或18的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。
21.权利要求17或18的方法，其中所述生物活性级分是人血液来源的血小板浓缩物的生物活性级分，所述血小板浓缩物含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含血小板浓缩物的天然组分，包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种以及纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白。
22.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分中的纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的水平存在。
23.权利要求17或18的方法，其中所述生物活性级分基本上不含肝素。
24.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分还包括对于血小板而言是天然的IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和TNF-α中的至少一种，并且优选包括它们中的每一种。
25.权利要求17或18的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述组合物包括：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
26.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-BB的浓度小于1000pg/ml。
27.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-AA的浓度小于3000pg/ml。
28.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的TGF-β1浓度为至少5000pg/ml。
29.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的VEGF浓度小于300pg/ml。
30.权利要求21的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分包括衍生自所述血小板的以下组分：
为所述液体生物活性级分的低于20,000ng/mL水平的纤维蛋白原；
为所述液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为所述液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为所述液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为所述液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为所述液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为所述液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和
为所述液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
31.权利要求21的方法，其中：
所述生物活性级分具有260-340mmol/kg的同渗浓度。
32.权利要求31的方法，其中：
所述生物活性级分具有在6.8至7.8的范围内的pH。
33.权利要求17或18的方法，其还包含在所述施加后干燥所述胶原性细胞外基质材料。
34.权利要求33的方法，其中所述干燥包括冻干。
35.权利要求33的方法，其还包括将所述生物活性组合物包装在无菌容器中。
36.权利要求17或18的方法，其还包括在所述施加之后漂洗所述胶原性细胞外基质，以从所述胶原性细胞外基质材料中除去所述生物活性级分的一部分。
37.权利要求36的方法，其中所述一部分包括一定量的至少一种生长因子，并且优选包括多种生长因子。
38.权利要求36的方法，其还包括在所述漂洗后干燥所述胶原性细胞外基质材料。
39.权利要求38的方法，其中所述干燥包括冻干。
40.权利要求38的方法，其还包括在所述干燥后将所述生物活性组合物包装在无菌容器中。
41.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料包括胶原和非胶原组分。
42.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质(ECM)材料包括对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
43.权利要求42的组合物或方法，其中所述天然的保留的硫酸化糖胺聚糖以每克所述胶原性细胞外基质材料至少约500微克的水平存在。
44.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料包括粘膜下层。
45.权利要求44的组合物或方法，其中所述粘膜下层是肠、膀胱或胃的粘膜下层。
46.权利要求45的组合物或方法，其中所述粘膜下层是小肠粘膜下层(SIS)。
47.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是猪、牛、羊或马的细胞外基质材料。
48.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片、凝胶、非凝胶水性组合物、颗粒材料或海绵的形式。
49.权利要求48的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片状形式。
50.权利要求49的组合物或方法，其中所述片状形式对于来源组织而言是天然的。
51.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约500μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
52.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约1000μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
53.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料具有来自施加于其的生物活性级分的生长因子，其中所述生长因子至少包括VEGF、TGF-β和PDGF-BB。
54.权利要求53的组合物或方法，其中：
VEGF以基于干重计至少500皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；
TGF-β以基于干重计至少50,000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；和/或
PDGF-BB以基于干重计至少5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在。
55.权利要求54的组合物或方法，其中：
所述VEGF的水平为基于干重计至少1000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平为基于干重计至少100000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB水平为基于干重计至少7000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
56.权利要求54的组合物或方法，其中：
所述VEGF的水平不超过基于干重计5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平不超过基于干重计500000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB的水平不超过基于干重计15000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
57.权利要求53的组合物或方法，其中所述胶原性细胞外基质材料保留对胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的纤连蛋白。
58.权利要求57的组合物或方法，其中一定量的VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB结合至对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或纤连蛋白。
59.权利要求1的组合物或权利要求17的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是从哺乳动物来源组织分离的脱细胞化胶原性组织膜。
60.一种治疗患者的方法，所述患者任选为人类患者，所述方法包括向所述患者施用权利要求1的组合物，或通过权利要求17的方法制备的组合物。
61.一种用于治疗患者的方法，其包括：
在植入部位提供包含胶原性细胞外基质材料和血小板的生物活性级分的生物活性组合物；和
将一定量的所述生物活性级分的至少一种生物活性因子结合至所述胶原性细胞外基质材料，以便抵抗所述至少一种生物活性因子从所述植入部位迁移。
62.权利要求61的方法，其中所述结合在所述提供之前发生。
63.权利要求61的方法，其中所述结合在所述提供之后发生。
64.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述至少一种生物活性因子包括VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB，并且所述结合抵抗VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB的迁移。
65.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述哺乳动物血小板是人血小板。
66.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种。
67.权利要求66的方法，其中所述生物活性级分包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。
68.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述生物活性级分是人血液来源的血小板浓缩物的生物活性级分，所述血小板浓缩物含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含血小板浓缩物的天然组分，包括TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的至少一种以及纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白。
69.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述生物活性级分的纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的水平存在。
70.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述生物活性级分基本上不含肝素。
71.权利要求67的方法，其中所述生物活性级分还包括对于所述对血小板而言是天然的IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和TNF-α中的至少一种，并且优选包括它们中的每一种。
72.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述液体生物活性级分包括：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
73.权利要求67的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-BB的浓度小于1000pg/ml。
74.权利要求67的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的PDGF-AA的浓度小于3000pg/ml。
75.权利要求67的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的TGF-β1的浓度为至少5000pg/ml。
76.权利要求67的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分中的VEGF浓度小于300pg/ml。
77.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述生物活性级分是液体生物活性级分，并且其中所述生物活性级分包括衍生自所述血小板的以下组分：
为所述液体生物活性级分的低于20,000ng/mL水平的纤维蛋白原；
为所述液体生物活性级分的至少2mg/dL水平的白蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少1g/dL水平的球蛋白；
为所述液体生物活性级分的至少5000pg/ml水平的TGF-β1；
为所述液体生物活性级分的至少20pg/ml水平的EGF；
为所述液体生物活性级分的至少5pg/ml水平的FGF-β；
为所述液体生物活性级分的至少200pg/ml水平的PDGF-AA；
为所述液体生物活性级分的至少50pg/ml水平的PDGF-BB；
为所述液体生物活性级分的至少100pg/ml水平的SDF-1α；和为所述液体生物活性级分的至少10pg/ml水平的VEGF。
78.权利要求61至63的任一项的方法，其中：
所述生物活性级分具有260-340mmol/kg的同渗浓度。
79.权利要求78的方法，其中：
所述生物活性级分具有在6.8至7.8的范围内的pH。
80.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是猪、牛、羊或马的细胞外基质材料。
81.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片、凝胶、非凝胶水性组合物、颗粒材料或海绵的形式。
82.权利要求81的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料呈片状形式。
83.权利要求82的方法，其中所述片状形式对于所述源组织而言是天然的。
84.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料以基于干重计至少约500μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
85.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约1000μg/克的胶原性ECM材料的水平包含对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
86.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料包括施加于其上的生物活性级分中的VEGF、TGF-β和PDGF-BB。
87.权利要求86的方法，其中：
VEGF以基于干重计至少500皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；
TGF-β以基于干重计至少50,000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在；和/或
PDGF-BB以基于干重计至少5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料的水平存在。
88.权利要求87的方法，其中：
所述VEGF的水平为基于干重计至少1000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平为基于干重计至少100000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB水平为基于干重计至少7000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
89.权利要求87的方法，其中：
所述VEGF的水平不超过基于干重计5000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；
所述TGF-β水平不超过基于干重计500000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料；和/或
所述PDGF-BB的水平不超过基于干重计15000皮克/毫克的胶原性细胞外基质材料。
90.权利要求86的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料保留对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的纤连蛋白。
91.权利要求90的方法，其中所述结合包括VEGF、TGF-β和/或PDGF-BB与对于胶原性细胞外基质材料的来源组织而言是天然的肝素和/或纤连蛋白的结合量。
92.权利要求61至63的任一项的方法，其中所述胶原性细胞外基质材料是从哺乳动物来源组织分离的脱细胞化胶原性组织膜。
93.一种用于制备组合物的试剂盒，其包含胶原性细胞外基质(ECM)材料和哺乳动物血小板的生物活性级分。
94.权利要求93的试剂盒，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约500μg/克的胶原性ECM材料的水平包括对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
95.权利要求93的试剂盒，其中所述胶原性ECM材料以基于干重计至少约1000μg/克的胶原性ECM材料的水平包括对于所述胶原性细胞外基质材料的来源组织而言天然的保留的硫酸化糖胺聚糖。
96.权利要求93至95的任一项的试剂盒，其中所述生物活性级分包括VEGF、TGF-β和PDGF-BB。
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