CN106442523A - 一种精确测定菊花花药开裂程度的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精确测定切花菊花药开裂程度的方法及其应用，属于菊花遗传育种及生殖生物学领域。该方法包括：(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于玻璃载玻片上；(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像；(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式计算出花药开裂程度。本发明针对品种间散粉量、散粉速度差异极大的切花菊，提供了一种精确测定菊花花药开裂程度的方法，为研究菊花花药开裂程度遗传规律、发掘控制花药开裂程度的有关基因奠定了基础。

Description

一种精确测定菊花花药开裂程度的方法及应用

技术领域

本发明涉及菊花杂交育种、生殖生物学领域，该方法采用蒸馏水、蔗糖溶液、氯化钠溶液这三种不同渗透势的溶液滴入菊花单个花药之上，借助显微镜拍照、录像的方法，通过计算不同区域的花粉数来精确计算菊花花药的开裂程度。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)是一种重要的观赏植物，属中国十大传统名花和世界四大切花之一，其品种繁多，花色花形多变，观赏价值高。切花菊尤其是切花小菊因为其花色花型丰富、着花繁密、开花整齐及花期长等特点在世界切花生产中占有重要地位。但是切花小菊品种大量散粉时造成的花粉污染却降低了其观赏品质和观赏寿命，并且可能影响观赏者的呼吸道健康。在百合的商业化生产中，生产者会选择人工去除百合花药，此举虽然费时费力且会增加成本，但总体看来利大于弊。究其根本原因，百合花药去除较易且去除后不影响观赏价值。然而，菊花花序含有几十甚至上百个管状花，其数量庞大，加之尺寸微小且人工去雄不仅严重影响其观赏价值，而且操作起来非常困难，故人工去除菊花花药的方法不可行。因此，通过育种手段培育不散粉菊花新品种是解决菊花花粉污染的根本途径。菊花散粉量及花粉污染程度与其花药开裂程度密切相关，理论上花药开裂程度越大菊花散粉量就越大，花粉污染也就越严重。目前判断菊花花药开裂程度主要是通过主观观察法判断花药表面的花粉量或者通过计算散粉后的花药样品空腔面积占花药内腔总面积的比值来衡量花药开裂程度，这两种方法均存在一些不足之处。首先，对于第一种方法：主观性太强，不同观察者在观察同一品种同一发育时期花药表面花粉量时对花药开裂程度的判断经常存在差异。其次，菊花花药含花粉量对花药开裂程度的判断有较大影响，如两个菊花品种同一发育时期可能花药表面花粉量一样，主观观察法则认为这两个品种花药开裂程度一样；但如果这两个品种花药含花粉量不一样，那么通过主观观察法判断的结果则不正确。对于第二种方法：首先，各品种切花菊花药内花粉并非紧密地将花药内腔填充满，即花粉发育完全但未开裂的花药内本身就具有一定的空隙；其次，在不同品种的切花菊花药内，上述空隙面积也具有多态性，从而第二种方法所测值存在固有误差，而且也无法用于切花菊品种间花药开裂程度差异的精确评判。因此，有必要发明一种精确测定菊花花药开裂程度的方法，以加快推动不散粉菊花新品种培育的步伐。

发明内容

本发明的目的是提供一种精确测定切花菊花药开裂程度的方法及其应用。首先，该方法用数值精确地对花药开裂程度进行量化，为进一步探索菊花花药开裂机制和遗传规律、及花药开裂关键基因的定位与挖掘奠定了坚实基础。其次，该方法可以检测到传统方法无法鉴别到的花药开裂点，并且可以检测到所有的开裂处，为进一步构建花药开裂的数理模型提供了重要基础。最后，该方法对花药样品不产生机械伤害，保证所测值的客观准确性。

本发明的目的通过以下技术方案实现的：

一种精确测定切花小菊花药开裂程度的方法，包括以下步骤：

(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于载玻片上；

(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；

(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像，达到稳态后拍照；

(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式(I)计算出花药开裂程度；

其中，Adl:花药开裂程度；Ot:花药外花粉粒数；M:该品种平均花药含粉量。

该方法所测量的范围是取自发育成熟但顶部未破裂的管状花的花药，如附图1中3的全部的全部管状花的花药，或4、5中内轮未破裂的管状花的花药)花药，只需统计“花药外的花粉粒数”；对于取样自已经散粉或已经完成散粉的管状花(如：附图1中4、5的外轮已经破裂的管状花，或6中全部管状花)花药，则不适用于此方法。

通过移液枪等精密微量液体转移设备精确滴加定量渗透液于花药鲜样上，所述的渗透液为去离子水、7.2％的蔗糖溶液或7.2％的NaCl溶液。研究表明优选去离子水为最佳渗透液。

步骤(1)中所述对管状花进行解剖的过程为：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住且镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将被花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上，整个操作过程中不可撕裂花药壁。

步骤(1)中每个载玻片上放置不超过5个花药鲜样。

步骤(2)为对即将滴加渗透液液滴的花药鲜样进行显微拍照，拍摄其处理前的特写，物镜为10X/0.25；然后将物镜换成低倍镜(4X/0.10)，调节焦距及视野，使得相机获取的图像视野清晰明亮，花药处于视野中央，开始录像；10s后，滴加15μL渗透液于花药鲜样上。

步骤(4)中达到稳态后，对液面区域进行拍照(低倍物镜4x/0.10)，由于整个液面区域面积较大，一般一个视野并不能包含整个液面区，因此要求拍摄多张照片且要求每张照片内散布的花粉成像清晰，若个别区域花粉密集，则采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄保证后续的花粉数目清点工作可以顺利进行；滴加液体前和达到稳态后的花药特写照片都采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄。

步骤(4)中所述花粉粒的计数方法为：借助计算机或者具备触控功能的平板电脑设备清点拍摄的照片中散布到花药外的花粉粒数目得到Ot值。所述花粉粒计数方法的具体步骤为：同一花药的多张视野照片导入电脑设备，选择一张对焦清晰的照片，然后用鼠标或者触控笔对视野进行区域划分，分区域清点每个区域的花粉数目，计数过的花粉用鼠标或者触控笔点上一点以着色，以免混淆，最后累加所有区域花粉总数，得到该样品的Ot值。

上述的方法在精确测定切花小菊花药开裂程度中的应用。

本发明选择选取3个花药开裂程度不同的切花菊品种进行花药开裂程度的精确测定：a.以切花菊品种‘南农红橙’作为高散粉量、花药开裂程度高的品种样本；b.以切花菊品种‘南农红点点’为散粉量中等、花药开裂程度中等的品种样本；c.以切花菊品种‘Qx-115’为不散粉(花药内有花粉)、花药不开裂的品种样本；证明该方法为菊花花药开裂程度提供了精确的度量，且使用范围为高开裂程度至未开裂的花药。

本发明精确测定切花小菊花药开裂程度的方法具体包括以下步骤：

(1)在室温15℃，室内相对湿度为45％的无风实验室内，获取新鲜切花菊的待测管状花置于载玻片上，使用解剖针与镊子对管状花进行解剖：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住即可，不可过分用力(不过分用力的标准是镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形)；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，道口长度约为整个管状花长度的2/3；然后解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将为花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上。注意整个操作过程中不要撕裂花药壁。将单个花药鲜样均匀放置在干净载玻片(一般规格：25.6mm×76mm×1.2mm)上，一个载玻片上放置不超过5个花药。

(2)对即将滴加渗透液液滴的花药鲜样进行显微拍照，拍摄其处理前的特写，物镜为10X/0.25。将物镜换成低倍镜(4X/0.10)，调节焦距及视野，使得相机获取的图像视野清晰明亮，花药处于视野中央，此时开始录像；10s后，用移液枪滴加15μL去离子水于花药鲜样上。

(3)借助光学显微镜，用录像的形式记录花粉粒随液流散出花药的全过程，录像过程中需要不断调节焦距，确保大部分花粉粒成像清晰。达到稳态后，对液面区域进行拍照(低倍物镜4X/0.10)。体系稳定的标准是花药内外的花粉粒不再发生移动。由于整个液面区域面积较大，一般一个视野并不能包含整个液面区，因此要求拍摄多张照片且要求每张照片内散布的花粉成像清晰，若个别区域花粉密集，则采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄保证后续的花粉数目清点工作可以顺利进行。滴加液体前和达到稳态后的花药特写照片都采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄。

(4)根据(3)中录像及照片得到达到稳态后花药外花粉粒数；通过公式(注：Adl:花药开裂程度；Ot:花药外花粉数；M:该品种平均花药含粉量)计算出花药开裂程度Adl。花粉粒计数的方法为：借助计算机或者具备触控功能的平板电脑设备清点拍摄的照片中散布到花药外的花粉粒数目得到Ot值。具体步骤为：同一花药的多张视野照片导入电脑设备，选择一张对焦较为清晰的照片(标准为：该视野内，成像清晰的花粉粒数目比例最高)，然后用鼠标或者触控笔对视野进行区域划分，分区域清点每个区域的花粉数目，计数过的花粉用鼠标或者触控笔点上一点以着色，以免混淆。最后累加所有区域花粉总数，得到该样品的Ot值。

本研究通过移液枪精确滴加一定量的不同渗透势的液体于单个花药上，用显微摄录的方法对花粉从开裂的花药中散出的过程进行全程高清录像，待体系稳定^[1]后，在对整个液面区域进行显微拍照，最终计算出散布至花药外的花粉数量及花药内部残余的花粉数量，通过公式计算出花药开裂程度值。该方法为菊花花药开裂程度提供了精确的度量，且使用范围为高开裂程度至未开裂的花药。

本发明的有益效果：

本发明针对品种间散粉量、散粉速度差异极大的切花菊，提供了一种精确测定菊花花药开裂程度的方法，为研究菊花花药开裂程度遗传规律、发掘控制花药开裂程度的有关基因奠定了基础。同时，该发明还具有如下两个重要特征：1)该方法可以将花药开裂程度量化，使得对花药开裂程度的衡量科学化；2)该方法在检测过程中未对花药样品做任何预处理，而是直接对鲜样进行处理检测；因此，使用该方法进行检测不会对样品造成机械损伤，从而能够客观真实地测出样品的开裂程度；3)该方法可以形象直观地检测到花药鲜样的所有裂口。

附图说明

图1为‘南农红橙’花序6个开花阶段

其中，阶段1：花序边花尚未展开；阶段2：花序边花刚开始展开；阶段3：花序刚开早期，管状花表面尚未散粉；阶段4：花序盛开中期，1-3伦管状花表面有大量花粉；阶段5：花序盛开后期，一半以上管状花表面有大量花粉；阶段6：花序盛开末期，几乎所有管状花表面有大量花粉。

图2为头状花序管状花排列模式的数学模型

其中，左图：每个顺逆时针螺旋线围成的方格内长有一个管状花；右图：每个圆点(黑、白、灰色)代表一个管状花，同一颜色并位于同一圆周上的属于同一轮管状花。

图3为‘南农红橙’管状花剥取模式图

其中，同一圆周上的实心圆点代表同一轮管状花；①代表1轮即最外轮管状花，②代表2轮即次外轮管状花，依次类推。

图4为同一液面区拍摄的多个视野图(A、B、C)

图5为花粉密集处的高倍率物镜照片

其中，圈处花粉粒较为密集，采用高倍率物镜(10X/0.25)进行拍摄

图6为滴加液体前花药特写照片(物镜为10X/0.25)

图7为达到稳态后花药特写照片(物镜为10X/0.25)

图8为对屏幕进行分区计算花药外花粉数

其中，相邻区域清点，笔记宜采用不同颜色以避免混淆；计数过的花粉粒可点上一点以着色

图9为不同渗透液测定‘南农红橙’开花阶段3各轮管状花花药开裂程度(％)

其中，①、②、③、④、⑤、⑥分别代表图3中所标注相应位置的管状花。同一折线拐点附近不同字母表示在95％水平上有显著性差异。

图10为不同渗透液测定‘南农红点点’开花阶段3各轮管状花花药开裂程度(％)

其中，①、②、③、④分别代表图3中所标注相应位置的管状花。同一折线拐点附近不同字母表示在95％水平上有显著性差异。

图11为传统方法检测花药开裂程度

图12为‘南农红橙’开花阶段3第2轮管状花花药花粉散出过程

其中，A～F分别代表滴加液滴后4s，8s，12s，16s，20s，24s的视频截图

图13为‘南农红点点’开花阶段3第1轮管状花花药花粉散出过程

其中，A～F分别代表滴加液滴后10s，20s，30s，40s，50s，60s的视频截图

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供了利用液流检测菊花花药开裂程度的方法，分别以‘南农红橙’、‘南农红点点’、‘Qx-115’开花阶段3为例，在室温15℃，室内相对湿度(RH)为45％的无风实验室内完成，其具体实施示例如下：

1.管状花的剥离

分别选取‘南农红橙’、‘南农红点点’和‘Qx-115’开花阶段3的2个花序为实验材料(图1)。菊花为头状花序，其管状花排列顺序符合头状花序排列基本特征(图2)。按图3的模式对3个品种开花阶段3的花序进行剥取管状花：对于每一个品种，最外轮(1轮)随机取9个管状花，次外轮(2轮)随机取管状花9个，次次外轮(3轮)随机取管状花9个，以此类推直至中心管状花。

2.管状花的解剖与花药切片的制作

2.1管状花的解剖

使用解剖针与镊子对管状花进行解剖：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住即可，不可过分用力(不过分用力的标准是镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形)；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，道口长度约为整个管状花长度的然后解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将为花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上。注意整个操作过程中不要撕裂花药壁。

2.2花药切片的制作

将单个花药鲜样均匀分布于在洁净玻片(规格：25.6mm×76mm×1.2mm)上，一个载玻片上放置的花药数目不宜超过5个，注意使得花药平躺于载玻片上。

3.液体的滴加及显微摄录

3.1溶液配制

分别配置7.2％的蔗糖溶液和7.2％的NaCl溶液：用天平分别称量7.2g蔗糖和7.2g的NaCl，溶于去离子水中，分别配成100ml的溶液待用。

3.2滴加液体

对即将滴加渗透液液滴的花药鲜样进行显微拍照，拍摄其处理前的特写，物镜为10X/0.25；然后将物镜换成低倍镜(4X/0.10)，调节焦距及视野，使得相机获取的图像视野清晰明亮，花药处于视野中央，开始录像；10s后，滴加渗透液于花药鲜样上。

首先用移液枪吸取15μl去离子水，滴加于花药鲜样之上，在显微镜下观察花粉粒随着液流散出花药的全过程，并对该过程进行高清显微录像。注意不断调节焦距与视野，力求整个过程中花药始终处于最佳视野范围且成像清晰。待体系稳定后，结束录像。注意，体系稳定的标准是花药内外的花粉粒不再发生移动。滴加7.2％蔗糖溶液和7.2％NaCl操作程序同滴加去离子水。

3.3稳态拍照

显微摄录使用日本OLYMPUS CX41RF生物光学显微镜及日本Canon 5D Mark-iii数码单反相机(相机机身通过转接器连接在显微镜相机接口上)进行：

达到稳态后，对整个液面区域进行显微拍照(目镜始终为：WHB10X/20；物镜：4X/0.10)。由于整个液面区域面积较大，一般一个视野并不能包含整个液面区，因此要求拍摄多张照片且要求每张照片内散布的花粉成像清晰(图4)，若个别区域花粉密集，则采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄(图5，图中椭圆形圈处花粉粒较为密集)保证后续的花粉数目清点工作可以顺利进行。滴加液体前和达到稳态后的花药特写照片都采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄(图6、图7)。

4.花药开裂程度的测定

花药开裂程度的计算公式为：

Adl(Anther Dehiscence Level):花药开裂程度；

Ot(Outer Pollen Quantity):花药外花粉数；

M(Mean pollen quantity per anther):该品种平均花药含粉量。

4.1各参数的测定

借助iPad Pro^[2]和Apple Pencil^[3]清点拍摄的照片中散布到花药外的花粉粒数目得到Ot值(图8)。具体步骤为：同一花药的多张视野照片导入iPad Pro，选择一张对焦较为清晰的照片(标准为：该视野内，成像清晰的花粉粒数目比例最高)，然后用Apple Pencil对视野进行区域划分(图8)，分区域清点每个区域的花粉数目，计数过的花粉用ApplePencil点上一点以着色(图8)，以免混淆。最后累加所有区域花粉总数，得到该样品的Ot值。

4.2数据计算及分析

通过Microsoft Office Excel 2016及IMB SPSS Stastics 23分析计算所得Adl值。

5.结果分析

5.1使用不同渗透液分别测定‘南农红橙’、‘南农红点点’和‘Qx-115’开花阶段3各轮管状花花药开裂程度

5.1.1‘南农红橙’(开花阶段3)

表1不同渗透液测定‘南农红橙’开花阶段3各轮管状花花药开裂程度(％)

注：①、②、③、④、⑤、⑥分别代表图3中所标注相应位置的管状花。同一列数字后面相同字母表示在5％水平上没有显著性差异。

使用3种不同渗透势的液体来处理鲜样都可以显著区别每一轮管状花内花药的开裂程度，如在使用去离子水时，①～⑥位置管状花花药开裂程分别为84.8％、69.0％、48.6％、17.7％、10.9％、0(表1)。使用Duncan’s新复极差检验得出：同一渗透液测量不同轮数(位置)的管状花花药开裂程度值之间具有显著差异(图9)。此外，使用三种渗透液测定的结果Duncan’s新复极差检验得出没有显著差异，如用去离子水、7.2％的蔗糖溶液和7.2％的NaCl溶液测定位置①管状花花药开裂程度分别为84.8％、84.6％、85.0％，这说明这三种方法均可以用来测定花药开裂程度(表1)。

5.1.2‘南农红点点’(开花阶段3)

表2不同渗透液测定‘南农红点点’开花阶段3各轮管状花花药开裂程度(％)

注：①、②、③、④、⑤、⑥分别代表图3中所标注相应位置的管状花。同一列数字后面相同字母表示在5％水平上没有显著性差异。

使用3种不同渗透势的液体来处理‘南农红点点’不同部位管状花的花药鲜样也可以显著区别每一轮管状花内花药的开裂程度，如在使用去离子水时，①～④位置管状花花药开裂程分别为46.1％、10.9％、4.2％、0(表2)。使用Duncan’s新复极差检验得出：同一渗透液测量不同轮数(位置)的管状花花药开裂程度值之间具有显著差异(图10)。此外，使用三种渗透液测定的结果Duncan’s新复极差检验得出没有显著差异，如用去离子水、7.2％的蔗糖溶液和7.2％的NaCl溶液测定位置①管状花花药开裂程度分别为46.1％、46.9％和47.0％，这说明这三种方法均可以用来测定花药开裂程度(表2)。

5.1.3‘Qx-115’(开花阶段3)

3种渗透液对‘Qx-115’(开化阶段3)①～⑥轮管状花花药的测定值均为0；说明，‘Qx-115’在开花阶段3时期，各轮管状花内花药均未发生开裂。

对以上2个品种测量结果分析，去离子水方法测定结果的平均标准误分别为1.6和1.7，均是三种渗透液中最小的，说明用去离子水方法测定结果精确度要高于其他两种渗透液。此外，与其他两种方法相比，去离子水使用方便、成本更低，因此去离子水为最佳渗透液。

5.2去离子水方法与传统观察法结果比较

5.2.1传统花药开裂程度测定方法概述

传统花药开裂程度测定方法主要基于镜检，从已完成散粉的管状花中剥取花药，在光学显微镜下观察，计算花药空腔的面积占整个花药面积的比例(图11)，以此来衡量花药开裂程度。

5.2.2本方法特的独到之处

本方法可以将花药开裂程度精确量化；同时，在显微镜下清晰直观地看出花粉粒经花药壁向外散出的过程(图12、图13)，从而可以确定花药壁开裂的具体位置，能为今后进一步构建花药开裂的数学模型打下基础。

5.2.3本方法与传统方法的比较

传统方法的取样要求较高，须采集已经散粉完全的管状花内的花药进行测定。换言之，对于那些刚开始散粉或者花药壁已经开裂但尚未散粉的花药无法测定其花药开裂程度。而该方法能够测定出取样自管状花未破裂的花药壁未开裂至完全开裂的所有花药的开裂程度，因此对测量对象的取样要求比传统方法低，且测量较传统方法较快捷(无需等待至样品花序散粉)，同时较传统方法而言，也减少了诸如环境温度、湿度对样品花药开裂程度产生的影响。

综上所述，本方法测得的开裂程度值为该品种切花菊花序不同位置管状花花药的实时开裂程度值，并能够测定出花药壁刚发生开裂到花药壁完全开裂的花药之间不同开裂程度的花药的开裂程度。再者，本方法可避免传统方法测量的不足。因此，本方法是一种较传统方法有着诸多优越特性的新方法。

总结

由以上实例可以看出：同一花序各轮管状花花药的开裂程度由外轮向内轮呈明显的递减趋势。通过该方法可以精确确定同一花序不同轮数间管状花内花药的开裂程度。去离子水为最佳渗透液。

因此，该方法可以用于同一花序同一轮管状花内花药开裂程度的动态实时测定。同样，该方法可以明显区分出花药开裂程度高、花药开裂程度中等/较低、花药不开裂的品种；同时，该方法也可以运用于观察同一品种不同开花时期的花序不同部位管状花花药的开裂程度。该方法将开裂程度量化，为描述这一性状提供了科学的依据，也为探究切花菊花药开裂程度的遗传规律、发掘控制花药开裂程度的相关基因及蛋白提供了重要基础，从而为培育观赏价值高但不散粉的切花菊新品种奠定了坚实基础。另一方面，该方法为进一步构建切花菊花药开裂的数理模型提供了基础，从而使得用更为精确的数学模型来度量花药开裂过程奠定了基础。最后，通过该法可以直观地看出花药壁破裂的具体位置，为进一步阐明切花菊花药开裂机制提供一定基础。

注解：

[1]：体系达到稳定的标准是花药内的花粉粒不再发生移动。

[2]、[3]：对显微镜下拍摄的照片中的花粉进行计数推荐使用具备精确触控功能的触摸设备，其高精度触摸屏使得操作过程中不易重复计数，且快速直观。

Claims (9)

1.一种精确测定切花小菊花药开裂程度的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获取待测样品的管状花，并对管状花进行解剖，获得花药鲜样，置于载玻片上；

(2)将步骤(1)中的载玻片迅速置于显微镜下开始拍照和录像，然后滴加渗透液至花药鲜样上；

(3)对步骤2)中花粉粒从开裂的花药中散出过程进行全程显微录像，达到稳态后拍照；

(4)根据录像及照片，统计达到稳态后花药外花粉粒数，然后通过公式(I)计算出花药开裂程度；

$Adl=\frac{Ot}{M}\×100\%---\left(I\right)$

其中，Adl:花药开裂程度；Ot:花药外花粉粒数；M:该品种平均花药含粉量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过精密微量液体转移设备精确滴加定量渗透液于花药鲜样上，所述的渗透液为去离子水、7.2％的蔗糖溶液或7.2％的NaCl溶液；优选为去离子水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对管状花进行解剖的过程为：用镊子轻轻夹着花药，让其固定住且镊子未使得管状花外壁发生凹陷变形；然后用解剖针在管状花头部纵切一刀，解剖针尖压住被切开的管状花切口的一端，再用镊子将被花药包围着的柱头取出置于载玻片上，用解剖针将柱头剔除，再将花药彼此分离并置于干净载玻片上，整个操作过程中不可撕裂花药壁。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：每个载玻片上放置不超过5个花药鲜样。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)为对即将滴加渗透液液滴的花药鲜样进行显微拍照，拍摄其处理前的特写，物镜为10X/0.25；然后将物镜换成低倍镜(4X/0.10)，调节焦距及视野，使得相机获取的图像视野清晰明亮，花药处于视野中央，开始录像；10s后，滴加15μL渗透液于花药鲜样上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：达到稳态后，对液面区域进行拍照，由于整个液面区域面积较大，一般一个视野并不能包含整个液面区，因此要求拍摄多张照片且要求每张照片内散布的花粉成像清晰，若个别区域花粉密集，则采用高倍物镜进行拍摄保证后续的花粉数目清点工作可以顺利进行；滴加液体前和达到稳态后的花药特写照片都采用高倍物镜(10X/0.25)进行拍摄。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述花粉粒的计数方法为：借助计算机或者具备精确触控功能的平板电脑设备清点拍摄的照片中散布到花药外的花粉粒数目得到Ot值。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述花粉粒计数方法的具体步骤为：同一花药的多张视野照片导入电脑设备，选择一张对焦清晰的照片，然后用鼠标或者触控笔对视野进行区域划分，分区域清点每个区域的花粉数目，计数过的花粉用鼠标或者触控笔点上一点以着色，以免混淆，最后累加所有区域花粉总数，得到该样品的Ot值。

9.权利要求1-8中任一所述的方法在精确测定切花小菊花药开裂程度中的应用。