CN106434661A - 一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子及其应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子及其应用。一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子，所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子为小分子单链DNA，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，全长为12bp。一种调节铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换的细菌表面相关结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与细菌表面相关结合蛋白组成的分子组件，可以有效调控铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间的切换，为药物消除铜绿假单胞菌持留态细胞提供相关靶位点。

Description

一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子及其应用
技术领域
本发明涉及一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
持留菌是某个细菌群体在致死浓度抗菌药物压力情况下，以一定比例随机表型异化的小亚群。表现为临时休眠状态或缓慢生长状态，可耐受致死浓度的抗菌药物，但这种抗菌药物耐受性不能遗传。当致死浓度抗菌药物的压力消失后，持留菌又会迅速恢复为正常细胞，对抗菌药物敏感。由于持留菌对抗菌药物具有高耐受性，残存的持留菌在体内抗菌药物浓度降低或免疫力下降时可以再次引起感染。由此清除持留菌对于有效控制感染具有重要意义。随着学科的交叉与研究的深入，持留菌逐渐被医学微生物学、环境微生物学和微生物生态学等各领域研究者所关注，不同的持留菌形成机制被不断发现。
毒素‐抗毒素(Toxin‐Antitoxin)系统(TA系统)是目前研究较为清楚的持留菌形成机制，它可以改变细胞某些主要的生命活动状态，抑制某些大分子的合成，从而使细胞处于持留态。此外，可诱发细胞形成持留态的因素还包括DNA损伤、高温及酸压力、呼吸抑制、化学信号响应等。研究发现，不同细菌的持留菌形成机制不尽相同，而且同种细菌的持留菌形成机制也非单一。通过各领域研究学者的不断深入研究，不同持留菌形成机制被发现。但是目前尚未发现可以完全清除持留菌的抗菌药物或其他手段，可见有效控制持留菌感染面临严峻考验。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子。
本发明还要解决的技术问题是提供一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子的应用。
本发明最后解决的技术问题是提供与上述铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子结合的细菌表面相关蛋白及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子，所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子为小分子单链DNA，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，全长为12bp。
所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子优选5’末端磷酸化或5’末端未磷酸化；5’末端磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子简称为P‐poly(C)；5’末端未磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子简称为poly(C)。
poly(C)：5’‐CCCCCCCCCCCC‐3’
P‐poly(C)：PO4 3‐5’‐CCCCCCCCCCCC‐3’
本发明所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子在控制铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换中的应用。
本发明所述的应用，优选5’末端磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合，铜绿假单胞菌就会由正常细胞转变为持留态细胞；当5’末端未磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合时，铜绿假单胞菌会由持留态细胞变为正常细胞；所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共含有352个氨基酸。
一种调节铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换的细菌表面相关结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码所述的细菌表面相关结合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因全长为1059bp，G+C含量为65.72％。
所述的细菌表面相关结合蛋白作为治疗靶点在控制铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换中的应用，所述的5’末端磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合或所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白空载时，铜绿假单胞菌就会由正常细胞转变为持留态细胞；当所述的5’末端未磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合时，铜绿假单胞菌会由持留态细胞变为正常细胞；所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种调控铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换的试剂，包括所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子。
本发明所述的应用均不涉及疾病的治疗方法，仅限用于非疾病治疗方法以外的应用，如科研方面。
有益效果：
1.构建铜绿假单胞菌胞外小分子单链DNA文库，筛选得到有效控制铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞相互切换的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子。
2.通过双向凝胶电泳得到铜绿假单胞菌表面相关结合蛋白，与上述铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子构成持留菌调控分子组件，有效控制铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞的相互切换。
3.该铜绿假单胞菌表面相关结合蛋白共352个氨基酸，由1059bp(从起始密码子到终止密码子)编码而成，其G+C含量为65.72％。
4.由铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与细菌表面相关结合蛋白组成的分子组件，可以有效调控铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间的切换，为药物消除铜绿假单胞菌持留态细胞提供相关靶位点。
5.基于铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子单链DNA 5’末端磷酸化/去磷酸化的持留态快速切换方法也可以直接用于制备相应药物消除铜绿假单胞菌持留态细胞。
附图说明
图1胞外小分子单链DNA与细菌表面相关结合蛋白构成的分子组件调控铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞相互切换的效果图。
图2胞外小分子单链DNA 5’末端磷酸化/去磷酸化调控铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞相互切换的效果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：铜绿假单胞菌胞外小分子单链DNA的获取
1.1.培养至稳定期(培养约33h)的铜绿假单胞菌菌液离心获取上清液，上清液经0.22μm聚四氟乙烯滤膜(购自Whatman)过滤去除残余菌体。
1.2经蛋白酶K(protein K，购自宝生物工程(大连)有限公司)在37℃处理2h以去除上清液中所含有的蛋白质。
1.3上述所获得的产物经超滤离心管(购自Millipore公司)离心去除大分子双链DNA和残余大分子蛋白质，获取超滤后的渗滤液。
1.4超滤后的渗滤液经脱氧核苷酸双链酶(Exonuclease III，购自宝生物工程(大连)有限公司)和RNA酶(RNase，购自宝生物工程(大连)有限公司)在37℃处理1h，由此去除渗滤液中的残余双链DNA和RNA。
1.5采用酚‐氯仿抽提及乙醇沉淀的方法获得铜绿假单胞菌胞外小分子单链DNA，将其以20ng/ul的浓度溶解在无菌水中。
实施例2：铜绿假单胞菌胞外小分子单链DNA文库构建，获得持留菌调控因子
2.1上述所得的铜绿假单胞菌胞外小分子单链DNA在脱氧核苷酸末端转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，购自宝生物工程(大连)有限公司)作用下，使其3’末端加上poly(A)。
2.2以oligo(dT)为引物，采用Ex Taq DNA聚合酶(Ex Taq DNA polymerase，购自宝生物工程(大连)有限公司)通过PCR的方式获得上述片段的互补链，从而获得双链DNA片段。
2.3将上述双链DNA片段与pMD 19‐T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)在16℃条件下过夜酶联，酶联产物经PCR清洁回收试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris‐HCl(pH8.0)中。
2.4制备大肠杆菌DH 5α高效电转感受态细胞，具体方法参照J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
2.5清洁回收的酶联产物以电转化的方式转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞，具体方法参照J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。涂布含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃培养24h后，分离纯化所获得的克隆子。
2.6插入片段的核苷酸序列由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。
2.7英潍捷基(上海)贸易有限公司合成各克隆子所获得的核苷酸序列，并测试上述所获得的多条胞外小分子单链DNA对铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞相互切换的有效性，从而获得铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子。筛选铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子的方法为将所得胞外单链小分子DNA加回已水洗的铜绿假单胞菌中，测试其持留菌比例。若处理组持留菌比例与铜绿假单胞菌未水洗原始菌液持留菌比例相同，我们既可确定该处理组所添加的胞外单链小分子DNA为铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子。经筛选铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
实施例3：铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白的获取
3.1英潍捷基(上海)贸易有限公司合成核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示3’末端具有Cy5荧光基团标记的铜绿假单胞菌持留菌控制因子。
3.2上述合成产物与等体积磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.0)重悬的铜绿假单胞菌(水洗两遍)37℃作用20min。
3.3上述作用产物离心后将菌体水洗以去除多余荧光标记调控因子。
3.4等体积磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.0)重悬上述菌体，采用终浓度为1％的甲醛交联15min，再用终浓度为0.125mol/L甘氨酸终止交联5min。
3.5上述产物重悬于等体积磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.0)，超声破碎。离心后沉淀以10μg/μl的浓度溶于含2％Triton X‐100的磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.0)，即为我们所获得的铜绿假单胞菌细胞膜总蛋白。
3.6铜绿假单胞菌细胞膜总蛋白跑双向电泳，蛋白质通过等电点和分子量彼此分开。经荧光凝胶扫描及银染方式，我们获得铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白。其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，编码该结合蛋白的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
实施例4：铜绿假单胞菌形成持留态相关分子组件的功能研究
4.1培养至稳定期(约33h)的铜绿假单胞菌菌液离心弃上清，菌体经无菌水充分水洗2遍。等体积LB重悬菌体。
4.2通过4.1所获得的菌液加终浓度为5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀释涂布LB平板，从而获得该处理(即图1中的水洗菌)下铜绿假单胞菌持留态细胞所占比例。对照组为未去除上清的原始铜绿假单胞菌菌液(即图1中的原始菌)。
4.3通过4.1所获得的菌液，加入终浓度为10μmol/L的poly(C)，室温作用10min后，终浓度为5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀释涂布LB平板，从而获得该处理(即图1中的水洗菌+poly(C))下铜绿假单胞菌持留态细胞所占比例。
4.4通过4.1所获得的菌液，加入终浓度为10μmol/L的P‐poly(C)，室温作用10min后，加入终浓度为5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀释涂布LB平板，从而获得该处理(即图1中的水洗菌+P‐poly(C))下铜绿假单胞菌持留态细胞所占比例。
结果如图1所示，当铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白空载或与5’末端磷酸化的P‐poly(C)结合时，铜绿假单胞菌就会由正常细胞转变为持留态细胞，此时持留菌比例较高；当细胞表面结合蛋白与5’末端未磷酸化的poly(C)结合时，铜绿假单胞菌会由持留态细胞变为正常细胞，此时持留菌比例较低。
实施例5：铜绿假单胞菌胞外小分子单链DNA 5’末端磷酸化/去磷酸化的持留态快速切换功能研究
5.1培养至稳定期(约33h)的铜绿假单胞菌菌液经T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide kinase，购自宝生物工程(大连)有限公司)37℃处理30min，即通过T4多聚核苷酸激酶作用使得DNA 5’末端磷酸化。然后加入终浓度为5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀释涂布LB平板，从而获得该处理下铜绿假单胞菌持留态细胞所占比例(即图2中的原始菌+磷酸化酶)。对照组为原始铜绿假单胞菌菌液(即图2中的原始菌)。
5.2通过4.1所获得的菌液，分别加入终浓度为10μmol/L的poly(C)和P‐poly(C)，室温作用10min后，经T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase，购自宝生物工程(大连)有限公司)和碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase(calf intestine)，购自宝生物工程(大连)有限公司)在37℃条件下分别处理30min后，加入终浓度为5mg/L氧氟沙星，37℃、250rpm作用3h。稀释涂布LB平板，从而获得两种处理(即图2中的水洗菌+poly(C)+磷酸化酶组和水洗菌+P‐poly(C)+磷酸化酶)下铜绿假单胞菌持留态细胞所占比例。
结果如图2所示，当调控铜绿假单胞菌形成持留态的相关分子组件中胞外小分子DNA5’末端含有磷酸基团时，铜绿假单胞菌就会由正常细胞转变为持留态细胞，此时持留菌比例较高；当组件中胞外小分子DNA5’末端没有磷酸基团时，铜绿假单胞菌会由持留态细胞变为正常细胞，此时持留菌比例较低。

Claims (8)

1.一种铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子，其特征在于所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子为小分子单链DNA，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子，其特征在于所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子5’末端磷酸化或5’末端未磷酸化。
3.权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子在控制铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于5’末端磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合，铜绿假单胞菌就会由正常细胞转变为持留态细胞；当5’末端未磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合时，铜绿假单胞菌会由持留态细胞变为正常细胞；所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种调节铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换的细菌表面相关结合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.编码权利要求5所述的细菌表面相关结合蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.权利要求5所述的细菌表面相关结合蛋白作为治疗靶点在控制铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换中的应用，其特征在于权利要求2中所述的5’末端磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与权利要求5所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合或权利要求5所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白空载时，铜绿假单胞菌就会由正常细胞转变为持留态细胞；当权利要求2中所述的5’末端未磷酸化的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子与权利要求5所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白结合时，铜绿假单胞菌会由持留态细胞变为正常细胞；所述的铜绿假单胞菌细菌表面相关结合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种调控铜绿假单胞菌持留态细胞与正常细胞之间切换的试剂，其特征在于包括权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌持留态细胞调控因子。
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