CN106399188B - 萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种、使用及实验验证方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种，菌种的名称为：香坊肠杆菌，编号为：MF‑Ⅰ；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12367。本发明同时公开了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种的使用方法，本发明还同时公开了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种的实验验证方法，所述菌种在好氧条件下以萘作为碳源，通过共代谢降解氯仿；对于同时受萘及氯仿污染的水体，能够有效地降解萘和氯仿，以达到修复受萘及氯仿污染水体的目的。

Description

萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种、使用及实验验证方法

技术领域

本发明属于环境工程技术领域，具体涉及一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种、使用及实验验证方法。

背景技术

由于煤、石油、天然气、木材、作物秸秆等碳氢化合物的不完全燃烧或在还原性条件下发生热分解以及汽车、飞机等交通运输工具废气的排放和焦化煤气、石油工业、炼钢炼铁工厂的任意排放与垃圾渗透液、污水灌溉等，使得水体中普遍存在多环芳烃类污染物。

在辽宁、山东、陕西、重庆、湖北、河北等地均发生过石油天然气泄露事故，如2013年河北衡水的天然气泄漏和大连石油爆炸泄露。多环芳烃类物质不溶于或难溶于水体，易溶于苯类芳香性溶剂，一般漂浮或沉淀于水体中。多环芳烃类物质主要包括萘、菲、芘、蒽、苯并（a）芘等。

氯代烃是地下水系统中检测到的最普遍的污染物之一，氯代烃因含有卤代基团而难以被生物降解，是有毒有害的有机污染物，其具有高挥发性、脂溶性而易被皮肤吸收，被认为是“三致”物质，对人体的肝、肾、心血管和胃肠等器官都有极强的毒害作用。

在中国许多水体中同时检测到卤代烃和萘系物的存在，现在对于受到两类物质污染的水体，采用最多的方法是使用活性炭粉末进行吸附，但这种方法只是将污染物从一相转移到另一相，不能从根本上去除污染物。采用化学方法可以去除部分污染物而很难同时彻底去除上述两类物质，且经济费用较高。微生物处理技术能够有效的降低经济成本，适用范围广与此同时微生物还能够通过共代谢，同时有效去除上述两类物质。

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种的使用及实验验证方法，该菌种能够有效地降解萘和氯仿，达到净化水质的目的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明公开了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种，菌种的名称为：香坊肠杆菌（Enterobacter xiangfangensis），编号为：MF-Ⅰ；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年04月20日，保藏编号为CGMCC No.12367，并有存活证明。

所述菌种在好氧条件下以萘作为碳源，通过共代谢降解氯仿；对于同时受萘和氯仿污染的水体，能够有效地降解萘和氯仿，达到修复污染水体的作用。

本发明同时公开了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种的使用方法，将MF-I菌用富集培养基进行富集培养；将灭菌的富集培养基定量备用；将富集培养后的菌株接种至灭菌过的富集培养基中扩大培养，恒温振荡2~5天；将菌液在温度为4℃、转数为5000的高速离心机中离心10分钟，弃上清液，以pH=7.0磷酸盐缓冲液对沉淀清洗并离心，重复三次，在吸光度为600nm的紫外分光光度计下，以磷酸盐缓冲液调整菌悬液浓度为OD600=1.0。

优选的，所述的富集培养基由以下组分组成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g和水1L，富集培养基的pH为7。

本发明还同时公开了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种的实验验证方法，包括以下步骤：

1)配制培养基于血清瓶中并高压灭菌，消除培养基中本身的原著菌和空气中附着的杂菌，更好的让目标菌生长；

2)在血清瓶中添加萘和氯仿，调整萘和氯仿的浓度，确定萘和氯仿的最佳浓度；

3)在紫外灭菌后的洁净工作台上以菌株MF-Ⅰ菌悬液进行接种，以紫外分光光度仪进行测量以表征生物量，调整生物量到设计值，调节菌体浓度；

4)放入水浴振荡箱中进行以萘作为碳源共代谢降解氯仿的代谢降解反应，利用水温调节反应器皿的温度，使其保持恒定值；振荡使得微生物充分接触污染物物质，扩大接触面积。

优选的，步骤1）中所用培养基的化学组分为：Na₂HPO₄·12H₂O 1 g/L，K₂HPO₄ 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KNO₃ 0.5 g/L, CaCl₂ 0.001 g/L，微量元素1 ml/L。前两个组分组成缓冲溶液，调节反应过程中产生的少量酸，保持溶液pH的稳定；后几个组分分别为微生物提供生长代谢所必须的铵、镁、氮及钙元素，同时还为微生物的生长提供了所需的氢、磷、钾等元素。

优选的，所用的微量元素的化学组分为：FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.19g/L，MnSO₄ 7H₂O 0.1 g/L，ZnCl₂ 0.07 g/L，NiCl₂·6H₂O 0.024 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g/L，MnCl₂·4H₂O 0.006 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002 g/L。

优选的，步骤2）中萘和氯仿的浓度经过调整后，萘的浓度为20 mg/L，氯仿的浓度为20 µg/L。关于萘的浓度选择：在菌驯化阶段，加入萘的浓度分别为1mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L，经检测，萘的去除率均大于95%。去除率相差不大，故选用萘初始浓度较高的。关于氯仿的浓度选择：经实验证实，在共代谢碳源萘浓度为20 mg/L条件下，当氯仿的初始浓度设为10 µg/L、20µg/L、30µg/L时，氯仿的最终去除率分别为76.6%、44.5%和32.2%。在参考实际废水浓度并保证氯仿具有较高去除率的情况下，故选择氯仿为20 µg/L。

优选的，步骤3）中紫外分光光度仪的吸光度为600 nm，当吸光度为600nm时对菌浊度反应较敏感，吸光度达到最大。

优选的，步骤4）中的水浴振荡箱的温度为30℃，水浴振荡箱的转速为150 r/min。

本发明的优点是：本发明提供的MF-Ⅰ菌株在好氧条件下能够以萘作为碳源，通过共代谢降解氯仿。对于同时受萘和氯仿污染的水体，该菌种能够有效地降解萘和氯仿，达到修复污染水体目的。

附图说明

图1为利用萘作为碳源共代谢降解氯仿和利用萘作为碳源共代谢降解四氯化碳的降解曲线图；

图2为菌株MF-Ⅰ对浓度分别为10、20、30 µg/L的氯仿的降解曲线图；

图3为菌株MF-Ⅰ在氯仿浓度分别为0、10、20、30 µg/L条件下对20 mg/L的萘的降解曲线图；

图4为菌株MF-Ⅰ在不同浓度的氯仿和浓度为20 mg/L的萘的条件下的生长曲线图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步的说明：

本发明提供了一种萘作为碳源共代谢降解氯仿的菌种，菌种的名称为：香坊肠杆菌，编号为：MF-Ⅰ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12367，并有存活证明。

所述菌种在好氧条件下以萘作为碳源，通过共代谢降解氯仿；对于同时受萘和氯仿污染的水体，能够有效地降解萘和氯仿，达到修复污染水体目的。

具体使用方法：

首先将MF-I菌用富集培养基进行富集培养；将灭菌的富集培养基定量备用；将富集培养后的菌株接种至灭菌过的富集培养基中扩大培养，恒温振荡3天；将菌液在温度为4℃、转数为5000的高速离心机中离心10分钟，弃上清液，以pH=7.0磷酸盐缓冲液对沉淀清洗并离心，重复三次，在吸光度为600nm的紫外分光光度计下，以磷酸盐缓冲液调整菌悬液浓度为OD600=1.0。

所述富集培养基由以下组分组成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g和水1L，富集培养基的pH为7。

具体实验验证方法：

1)配制培养基于血清瓶中并高压灭菌；

2)在血清瓶中添加萘和氯仿，调整萘和氯仿的浓度；

3)在紫外灭菌后的洁净工作台上以菌株MF-Ⅰ菌悬液进行接种，以紫外分光光度仪进行测量以表征生物量，调整生物量到设计值；

4)放入水浴振荡箱中进行以萘作为碳源共代谢降解氯仿的代谢降解反应。

所用培养基具体的成分为Na₂HPO₄·12H₂O 1 g/L，K₂HPO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KNO₃ 0.5 g/L, CaCl₂ 0.001 g/L,微量元素1mL/L。

其中，所用的微量元素的化学组分为：FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.19g/L，MnSO₄ 7H₂O 0.1 g/L，ZnCl₂ 0.07 g/L，NiCl₂·6H₂O 0.024 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g/L，MnCl₂·4H₂O 0.006 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002 g/L。

具体方法为：配制50 ml培养基于120 ml血清瓶中以Teflon丁基塞与铝盖双重密封并对其进行高压灭菌，添加萘与氯仿，使得萘浓度为20 mg/L，氯仿浓度为20μg/l；在紫外灭菌后的洁净工作台上以菌株MF-Ⅰ菌悬液进行接种，以紫外分光光度仪在吸光度在600 nm（OD₆₀₀）下进行测量以表征生物量，调整生物量到设计值，放入温度为30℃、转速为150r/min的恒温水浴振荡箱中进行以萘作为碳源共代谢降解氯仿的代谢降解反应。

如图1所示，在两个培养瓶中，一个培养瓶加入萘和氯仿，另一个培养瓶中加萘和四氯化碳，两个培养瓶中萘的浓度一致，氯仿和四氯化碳的浓度也一致，反应一段时间后，观察两个培养瓶中不同物质的剩余量。通过图1可知，萘的去除率均大于95%，氯仿的去除率为42.6%，四氯化碳的去除率仅为7.26%，这是由于当萘消耗完后，共代谢停止，符合共代谢原理，故选用以萘作为碳源共代谢降解氯仿。

本发明提供的MF-Ⅰ菌株在好氧条件下能够以萘作为碳源，通过共代谢降解氯仿。对于同时受萘和氯仿污染的水体，该菌种能够有效地降解萘和氯仿，达到修复污染水体目的。

试验例1 菌株MF-Ⅰ对萘降解最佳条件的确定

以L₉ (3⁴)正交实验表进行实验。正交实验在120 ml的顶空中进行，其中包括50 ml反应体系及70 ml顶空容量为菌株降解供氧。反应体系中的各组分及反应条件均按正交实验表调配及进行，反应瓶以Teflon丁基塞与铝盖双重密封，Rpm=150，实验时间为36 h。表1-1为正交实验因素及水平。

通过ANOVA方法就行统计分析。在表1-2中列出菌株MF-Ⅰ对于萘的最佳降解条件，菌株MF-Ⅰ在30℃，pH=7.0，初始接种量为15%并且表面活性剂为SDS时，为最佳的反应状况。

表1-1 萘的正交实验因素及水平

因素	设计号	水平1	水平2	水平3
					温度（℃）	A	25	30	35
pH	B	6.5	7	7.5
					接种量(OD<sub>600</sub>=0.5)	C	5%	10%	15%
表面活性剂	D	Tween-80	不添加	SDS

表1-2 萘的最佳降解条件

因素	最佳水平
		A: 温度	30℃
B: pH	7.0
		C:接种量	15%
D: 表面活性剂	SDS

试验例2 氯仿初始浓度对菌株MF-Ⅰ共代谢降解的影响

菌株MF-Ⅰ对于浓度分别为10μg/l、20μg/l、30μg/l的氯仿的降解曲线图如图2所示；氯仿的初始浓度分别为0µg/l、10μg/l、20μg/l、30μg/l时，菌株MF-Ⅰ对浓度为20 mg/L浓度的萘的降解曲线如图3所示；菌株MF-Ⅰ在不同浓度的氯仿和浓度为20 mg/L的萘的条件下的生长曲线如图4所示。

图2显示菌株MF-Ⅰ在碳源萘浓度为20 mg/L时对不同浓度氯仿的共代谢，氯仿为10µg/L时，菌株MF-Ⅰ对于氯仿的共代谢降解率最高达到67.6%，而在30 µg/L时，菌株MF-Ⅰ对于氯仿的共代谢降解率最低只为32.2%。由此可见氯仿的浓度对于菌株MF-Ⅰ共代谢氯仿有着较大影响。图3显示不同浓度的氯仿对于菌株MF-Ⅰ对萘的降解产生了一定影响。随着氯仿浓度的升高，菌株对于萘的降解受到了一定的抑制，但其对于萘的降解率均在8小时内到达95%以上。图4为菌株MF-Ⅰ在20 mg/L浓度的萘作为碳源的情况下，不同浓度的氯仿对于菌株的生长曲线影响，氯仿的加入对菌株的生长产生一定的抑制。随着氯仿浓度的升高，其对菌株MF-Ⅰ的生长产生的抑制增强。

综上所述，菌株MF-Ⅰ对于受萘和氯仿共同污染的水体能够起到很好的降解效果。在实际工程中受萘和氯仿共同污染的水体可以先经过化学氧化或者物理方法预处理后，运用该菌种作为后续处理工艺，可以达到很好的去除效果。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (4)

1.一株香坊肠杆菌菌株（Enterobacter xiangfangensis）MF-Ⅰ，其保藏编号为CGMCCNo.12367。

2.如权利要求1所述的一种香坊肠杆菌菌株MF-Ⅰ的使用方法，其特征在于，所述的使用方法为：将MF-I菌用富集培养基进行富集培养；将灭菌的富集培养基定量备用；将富集培养后的菌株接种至灭菌过的富集培养基中扩大培养，恒温振荡2~5天；将菌液在温度为4℃、转数为5000的高速离心机中离心10分钟，弃上清液，以pH=7.0磷酸盐缓冲液对沉淀清洗并离心，重复三次，在吸光度为600nm的紫外分光光度计下，以磷酸盐缓冲液调整菌悬液浓度为OD600=1.0。

3.如权利要求2所述菌株的使用方法，其特征在于，所述的富集培养基由以下组分组成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g和水1L，富集培养基的pH为7。

4.如权利要求1所述一种香坊肠杆菌菌株MF-Ⅰ的应用，其特征在于，所述应用为：通过香坊肠杆菌菌株MF-Ⅰ共代谢实现去除水环境中萘和氯仿。

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