CN106349261A - 荧光开关型bodipy类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了的一类基于BODIPY结构的荧光染料，其通过8-位较长柔性烷基链而非刚性的苯环连接，利用芳胺的PET机制达到荧光off的目的，进一步通过改变芳胺的电性特别是氮原子的电性等方法达到荧光on的效果。

Description

荧光开关型BODIPY类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光染料及其制备方法和用途，特别是一类具有荧光开关性质的BODIPY类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料(BODIPY)是一类新颖的荧光基团(结构如下式AⅠ)，高吸光系数、高量子产率、最大发射波长>500nM及易于多样性衍生化等特性使其成为最常用的荧光染料之一。同时BODIPY类结构具有脂溶性强、对溶剂极性和pH(2-9)敏感性低、化学稳定性和光稳定性好、光学性质稳定，应用到生物体系中发现其具有良好的生物兼容性，组织及细胞渗透性等优势，这些优势使BODIPY在生物及化学领域具有广泛的用途。

目前开关型BODIPY类探针分子的结构特点主要是8-位引入取代苯基作为淬灭基团，调节不同的取代基以到达分子识别的目的(如下式AⅡ)。基于BODIPY类荧光化合物的优良性质和应用前景，开发新结构的开关型BODIPY类荧光化合物具有重要价值。

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)是一种以记忆和认知障碍为主要临床症状的神经退行性疾病。在病理学中，淀粉样蛋白肽(β-Amyloid，Aβ)聚集后沉积在大脑边缘和大脑皮层形成的老年斑(senile plaques，SP)是AD最典型的病理特征之一。目前老年斑主要通过体外脑切片荧光染色进行观察，主要采用荧光染料为ThT和ThS。染色老年斑的染料需要满足两个条件：1、对Aβ具有高亲和力；2、染色的老年斑与周围组织具有高对比度。ThT或ThS染色老年斑的操作是：脑片与染料共孵育10min，用20％的乙醇溶液洗去过量的染料，PBS洗去乙醇，固定脑片。操作中乙醇洗涤的效果对脑片染色观察的结果有显著的影响，洗涤不足，脑片中背景荧光太强，不利于分辨老年斑；洗涤过多，脑片 中老年斑区域荧光暗淡，部分老年斑无法有效被观察。我们认为寻找对Aβ具有更高亲和力，染色老年斑具有更高对比度的荧光染料对老年斑脑片染色具有重要的意义。

发明内容

本发明涉及一类基于BODIPY结构的荧光染料，其通过8-位较长柔性烷基链而非刚性的苯环连接，利用芳胺的PET机制达到荧光off的目的，进一步通过改变芳胺的电性特别是氮原子的电性等方法达到荧光on的效果。同时本发明提供了这类荧光染料的合成方法，通过简便反应即可高产率的获得具有结构多样性和功能多样性的荧光探针分子。这是一类结构新颖的off-on探针，同时我们发现此类探针对小鼠脑片的老年斑具有优异的染色效果。

本发明的一个目的是提供一类具有荧光淬灭现象的新结构化合物，化合物的8-位由脂肪链组成，其结构如通式Ⅰ所示。

本发明的另一个目的是提供上述化合物的制备方法及其在老年斑染色中的应用。

根据本发明的目的，本发明提供了一类如通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物，该类化合物具有荧光自淬灭的性质：

其中，

R₁为氢或C₁-C₆烷基；

R₂，R₃，R₄，R₅，R₆各自独立选自：氢、C₁-C₆烷基、-NH₂、-OH、C₁-C₆烷基取代的氨基或-O(C₁-C₆)；

“-”为负电荷，“+”为正电荷。

优选的，

R₁为氢或甲基；

R₂，R₃，R₄，R₅，R₆各自独立选自：氢、甲基、-NH₂、-OH、-N(CH₃)₂或-OCH₃。

根据本发明的另一个目的，本发明提供了通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物的制备方法：

包括以下步骤：

(a)化合物2与化合物1发生Friedel–Crafts反应，再向反应溶液中加入三氟化硼-乙醚复合物和碱，得到化合物3；

(b)化合物3经氧化剂氧化得到化合物4；

(c)化合物4与化合物5在还原剂的作用下经还原胺化得到通式I的化合物；

其中，R₁，R₃，R₄，R₅，R₆的定义如前。

上述步骤(a)中，化合物2首先与化合物1经过两次Friedel–Crafts反应，再向反应液中加入三氟化硼-乙醚复合物和碱。一般而言，该反应可在加热条件下进行，例如加热至50-70℃，使用的碱是本领域技术人员公知的，例如三乙胺，二异丙基乙胺，吡啶，碳酸钾等，优选的是三乙胺或二异丙基乙胺。

上述步骤(b)中，化合物3经氧化剂氧化得到化合物4。一般而言，该反应在0℃到室温下进行，氧化剂为本领域技术人员所公知的，例如Dess-Martin 氧化剂，三氧化硫-吡啶复合物，二甲亚砜-草酰氯体系，吡啶铬酰氯，二氧化锰等，优选的是Dess-Martin氧化剂或三氧化硫-吡啶复合物。

上述步骤(c)中，化合物4与化合物5经过还原剂的还原胺化得到化合物通式I。一般而言该反应在弱酸或者中性条件下反应，所述弱酸为本领域技术人员所公知的，例如乙酸，丙酸等。所述的还原剂是本领域技术人员所公知的，例如氰基硼氢化钠，三乙酰氧基硼氢化钠，硼氢化钠等，优选的是氰基硼氢化钠。一般而言该反应在室温条件下进行。

根据本发明的另一个目的，本发明提供了上述通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物在老年斑染色中的应用，具体的，提供了上述通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物作为荧光探针在老年斑染色中的应用。

一种使用上述通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物对老年斑染色的操作可以为：将脑片与100μM通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物共孵育10min，固定脑片。脑片于激光共聚焦显微镜下观察老年斑染色的结果。

本发明的有益结果：

我们发现了一类新结构的BODIPY类化合物，其与Aβ纤维结合的Kd值高达3nM(文献报道ThT对Aβ结合的Kd值在200nM左右)，染色脑片后，在不需要乙醇清洗的操作下即可高对比度的观察到荧光染色的老年斑。这类荧光染料合成简单，相比于ThT染色老年斑，具有简便性好、重现性高和实用性强的特点。

附图说明：

图1：荧光探针2的紫外-可见吸收曲线(a)、荧光曲线(490nM激发)(b)及与不同浓度Aβ纤维结合时荧光强度的变化曲线(c)；

图2：用荧光探针2荧光染色12月龄APPsw/PS1De9转基因小鼠脑切片(大脑皮层)，染色结果及与Aβ抗体共定位结果见图2；其中，图2(a)为probe 2染色老年斑；图2(b)为抗体染色，一抗ab2454继而二抗Alexa 546；图2(c)为图2(a)与图2(b)合并。图2的放大率：左侧-10X，右侧-40X。Scale bar(比例尺)：200μm。

具体实施方式

下面的实施例用于具体地说明本发明化合物的制备，以及其作为开关型荧光探针分子的应用，但本发明并不局限于这些实施例。

核磁共振氢谱(¹HNMR)用BrukerAMX-400型、Gemini-300型或AMX–600型核磁共振仪记录，溶剂为氘代氯仿(CDCl₃)或氘代二甲基亚砜(DMSO-d6),一抗ab2454购自Cell Signaling Technology,Inc(CST)，二抗Alexa546购自Life Technology^TM。化学位移δ的单位为ppm，耦合常数J的单位为Hz。所用微波为CEM-discovery微波反应器。所有反应溶剂均按照常规方法进行纯化。柱层析用硅胶(200-300目)为青岛海洋化工分厂生产。薄层层析使用GF254高效板，为烟台化工研究所生产。制备型薄层层析板由自己制备，固定相采用GF254(HG/T2354-92)硅胶和羧甲基纤维素钠(800-1200)制备，分别为青岛海洋化工有限公司和中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。所有溶剂均为分析纯试剂，所用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。采用紫外荧光等方法显色。减压蒸除有机溶剂在旋转蒸发仪中进行。

制备实施例

实施例1

圆底烧瓶中加入2,4-二甲基-3-R-吡咯(2.2eq.)，溶于无水二氯甲烷，氮气保护，冰浴，用恒压低液漏斗滴入4-溴丁酰氯(1.0eq.)，滴加完成后加热回流反应8h，旋干二氯甲烷，加入甲苯和二氯甲烷(甲苯与二氯甲烷体积比＝19:1)，冰浴，加入三乙胺(7.0eq.)，用恒压低液漏斗滴入三氟化硼-乙醚络合物(7.0eq.)，滴加完成后，去除冰浴，室温反应10-20min，50℃加热反应3h，反应液冷却，倒入冰水中淬灭，二氯甲烷萃取，硫酸钠干燥，旋干溶剂，过柱纯化，获得产品，红棕色固体，产率30％，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.06(s,2H),3.78(t,J＝5.9Hz,2H),3.05–2.96(m,2H),2.53(s,6H),2.41(s,6H),1.89(s,1H),1.85–1.78(m,2H).

实施例2

圆底烧瓶中加入实施例1得到的产品(1.0eq.)，溶于无水二氯甲烷和无水二甲亚砜(DCM与DMSO体积比＝4:1)，氮气保护，冰浴，加入无水三乙胺(5.0eq.)，加入三氧化硫-吡啶复合物(3.0eq.)，撤出冰浴，室温反应30-60min，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取，硫酸钠干燥，旋干溶剂，过柱纯化，获得产品，红棕色固体，产率37％，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.91(s,1H),6.08(s,2H),3.33–3.24(m,2H),2.85–2.77(m,2H),2.54(s,6H),2.37(s,6H).

实施例3

圆底烧瓶中加入实施例2的产品(1eq.)，化合物5(1.3eq.)，溶于1，2-二氯乙烷：甲醇(体积比)＝5：1，加入氰基硼氢化钠(1.3eq.)，室温反应6-8h，旋干反应溶液，粗品过柱纯化得产品。

荧光探针1：

当化合物5为苯胺时，产物为棕红色固体，产率68％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.17(t,J＝7.8Hz,2H),6.71(t,J＝7.3Hz,1H),6.59(d,J＝8.0Hz,2H),6.02(s,2H),3.77(s,1H),3.30(t,J＝6.8Hz,2H),3.03–2.96(m,2H),2.51(s,6H),2.33(s,6H),1.96–1.85(m,2H).

荧光探针2：

当化合物5为N-甲基苯胺时，产物为棕红色固体，产率65％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.22(dd,J＝8.7,7.2Hz,2H),6.72–6.69(m,3H),6.02(s,2H),3.49(t,J＝6.9Hz,2H),3.01–2.97(m,2H),2.96(s,3H),2.50(s,6H),2.35(s,6H),1.94–1.86(m,2H).

测试荧光探针2的紫外-可见吸收曲线、荧光曲线(490nM激发)及与不同浓度Aβ纤维结合时荧光强度的变化曲线，结果见图1。

用荧光探针2荧光染色12月龄APPsw/PS1De9转基因小鼠脑切片(大脑皮层)，染色结果及与Aβ抗体共定位结果见图2；其中，图2(a)为probe 2染色老年斑；图2(b)为抗体染色，一抗ab2454继而二抗Alexa 546；图2(c)为图2(a)与图2(b)合并。图2的放大率：左侧-10X，右侧-40X。Scale bar(比例尺)：200μm。

荧光探针3：

当化合物5为4-羟基-3-甲氧基苯胺时，产物为棕红色固体，产率49％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.79(d,J＝8.4Hz,1H),6.24(d,J＝2.5Hz,1H),6.17(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),6.07(s,2H),3.87(s,3H),3.29(t,J＝6.9Hz,2H),3.11–3.04(m,2H),2.54(s,6H),2.41(s,6H),1.95(dt,J＝15.4,7.0Hz,2H).

荧光探针4：

当化合物5为对羟基苯胺时，产物为棕红色固体，产率54％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.73–6.66(m,1H),6.56–6.49(m,1H),6.04(s,1H),3.26(t,J＝6.8Hz,1H),3.06–3.00(m,1H),2.51(s,3H),2.37(s,3H),1.89(dd,J＝16.0,7.6Hz,1H).

荧光探针5：

当化合物5为间氨基苯胺时，产物为棕红色固体，产率45％。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ6.73(t,J＝7.6Hz,1H),6.22(s,2H),5.90–5.78(m,3H),5.39(s,1H),3.16(d,J＝4.9Hz,2H),3.02(s,2H),2.51(s,1H),2.40(s,6H),2.39(s,6H),1.78(s,2H).

荧光探针6：

当化合物5为邻二甲氨基苯胺时，产物为棕红色固体，产率39％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.83(ddd,J＝7.7,7.0,2.0Hz,1H),6.71(m,3H),6.04(s,2H),3.30(t,J＝6.9Hz,2H),3.16–3.06(m,2H),3.00(s,6H),2.50(s,6H),2.35(s,6H),2.02–1.95(m,2H).

荧光探针7：

当化合物5为邻苯二胺时，产物为棕红色固体，产率67％。¹H NMR(400MHz, CDCl₃)δ6.83(ddd,J＝7.7,7.0,2.0Hz,1H),6.71(dtd,J＝22.4,7.7,1.5Hz,3H),6.05(s,2H),3.32(t,J＝6.9Hz,2H),3.14–3.05(m,2H),2.52(s,6H),2.40(s,6H),2.03–1.95(m,2H).

荧光探针8：

当化合物5为2，6-二甲基苯胺时，产物为棕红色固体，产率:53％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.00(d,J＝7.6Hz,2H),6.84(t,J＝7.5Hz,1H),6.05(s,2H),3.15(t,J＝7.1Hz,2H),3.10–3.02(m,2H),2.52(s,6H),2.40(s,6H),2.29(s,6H),1.93–1.84(m,2H).

Claims (9)

1.一类如通式Ⅰ所示的BODIPY类化合物：

其中，

R₁为氢或C₁-C₆烷基；

R₂，R₃，R₄，R₅，R₆各自独立选自：氢、C₁-C₆烷基、-NH₂、-OH、C₁-C₆烷基取代的氨基或-O(C₁-C₆)；

“-”为负电荷，“+”为正电荷。

2.如权利要求1所述的BODIPY类化合物，其特征在于：

其中，

R₁为氢或甲基；

R₂，R₃，R₄，R₅，R₆各自独立选自：氢、甲基、-NH₂、-OH、-N(CH₃)₂或-OCH₃；

“-”为负电荷，“+”为正电荷。

3.权利要求1或2所述的BODIPY类化合物的制备方法，其反应路线为：

其中，

(a)化合物2与化合物1发生Friedel–Crafts反应，再向反应溶液中加入三氟化硼-乙醚复合物和碱，得到化合物3；

(b)化合物3经氧化剂氧化得到化合物4；

(c)化合物4与化合物5在还原剂的作用下经还原胺化得到通式I的化合物；

其中，R₁，R₃，R₄，R₅，R₆的定义同权利要求1。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)在50-70℃下进行；所述的碱选自三乙胺，二异丙基乙胺，吡啶或碳酸钾；优选的，所述的碱为三乙胺或二异丙基乙胺。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)在0℃到室温下进行；所述氧化剂选自Dess-Martin氧化剂，三氧化硫-吡啶复合物，二甲亚砜-草酰氯体系，吡啶铬酰氯或二氧化锰；优选的，所述氧化剂是Dess-Martin氧化剂或三氧化硫-吡啶复合物。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(c)在弱酸或者中性条件下反应，所述弱酸选自乙酸或丙酸。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(c)在室温条件下进行；所述的还原剂选自氰基硼氢化钠，三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠；优选的所述的还原剂是氰基硼氢化钠。

8.权利要求1或2所述的BODIPY类化合物在老年斑染色中的应用。

9.权利要求1或2所述的BODIPY类化合物作为荧光探针在老年斑染色中的应用。