CN106290894A - 一种基于nk1r蛋白的白血病检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于NK1R蛋白的白血病检测试剂盒。具体地，本发明涉及：检测受试者中NK1R表达水平的方法；受试者中NK1R的表达水平在白血病病人检测中的用途；以及涉及一种试剂盒产品，其包括作为活性成分的NK1R的抗体和包括涉及该产品的说明书。

Description

一种基于NK1R蛋白的白血病检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基于神经激肽1受体(NK1R)的一种白血病检测试剂盒的开发与应用。具体地，本发明涉及：检测受试者中NK1R表达水平的方法；受试者中NK1R的表达水平在白血病病人检测中的用途；以及涉及一种试剂盒产品，其包括作为活性成分的NK1R的抗体和包括涉及该产品的说明书。

背景技术

癌症是一类严重危害人类健康的疾病，目前全球癌症死亡人数高于艾滋病、结核病和疟疾死亡人数的总和，已成为全球头号杀手。2015年6月2日，美国临床肿瘤学会议落幕，根据世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》，2012年全球癌症患者和死亡病例均有所增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。该报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。而白血病是一类造血系统的恶性疾病，是国内十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤发病率的第六位，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中分别占男性的第6位和女性的第8位，在儿童及35岁以下的死亡率中占第1位。WHO预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1％的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快，估计到2030年全球将可能有7500万人遭受癌症的折磨，将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人，这一数字对许多国家的健康护理体系来说是难以承受的。

神经激肽受体(Neurokinin Receptors)是由七个疏水跨膜区构成的G蛋白偶联受体家族成员，有三种亚型，分别为神经激肽受体1，神经激肽受体2和神经激肽受体3。神经激肽受体1在中枢和外周的神经元、血管内皮细胞、肌肉和不同类型的免疫细胞呈现特异性表达。神经激肽受体2主要在外周表达，在中枢只有在特定脑区有表达。相反，神经激肽受体3主要在中枢神经系统表达，在外周的表达被限制在特定的组织中。

由于神经激肽1受体的序列已经明确，神经激肽1受体的商业化抗体已成熟，该抗体的产生对于研究基于神经激肽1受体的相关疾病提供了诸多便利。目前还未见关于神经激肽1受体作为试剂盒在白血病检测领域的相关研究报道。

发明内容

为了向在正常体检中的人们提供检测发现白血病可能性的新途径或提供更广泛的选择，本发明的发明人研究发现：与健康人相比，神经激肽1受体在白血病患者外周血白细胞中呈现高表达。

因此，本发明一方面提供了一种检测受试者可能患白血病的方法，其包括在所述受试者施中检测神经激肽1受体的表达水平。

本发明的另一方面提供了神经激肽1受体的抗体在制备用于检测受试者是否患有白血病或是否具有患有白血病风险的试剂盒中的用途。优选地，所述的检测是通过检测受试者外周血中神经激肽1受体表达水平而进行的。示例性地，如果受试者周血中神经激肽1受体表达水平是正常对照组的1.3-100倍或更高，则可以判定该受试者患有白血病或具有患有白血病风险。例如，本发明所述的高表达是指是对照组(健康组)表达水平的1.3倍、1.31倍、1.32倍、1.33倍、1.34倍、1.35倍、1.36倍、1.37倍、1.38倍、1.39倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍或更高。

本发明的再一方面提供了一种检测受试者是否患有白血病或是否具有患有白血病风险的试剂盒，其包括作为活性成分的神经激肽1受体的抗体；以及包括该涉及抗体产品的说明书。

在本发明中，其中所述的神经激肽1受体的抗体是指与神经激肽1受体特异性结合的抗体，例如特异性与神经激肽1受体结合的单克隆抗体或者多克隆抗体。

对于本发明所述的受试者，其优选为哺乳动物，更优选为人。

本发明的发明人出乎意料的发现，受试者外周血中神经激肽1受体的表达水平与该受试者是否患有白血病或者是否具有患白血病的风险显著相关。例如，如果受试者外周血中神经激肽1受体的表达水平相对健康受试者是高表达的，则可诊断为该受试者患有白血病或者具有患白血病的风险。这对于早发现白血病并进行及时治疗赢得了时间。

示例性地，本发明的试剂盒、检测或者用途可以作为诊断白血病的辅助手段。也就是说，医生或者其他医务人员可以结合受试者其他的理化指标或影像结果给出受试者的诊断结果。

如本文所使用的，“包含”、“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

附图说明

图1为受试者外周血中神经激肽1受体表达水平的代表性Western blotting图片，其中P代表patient，指白血病患者；V代表volunteers，指健康志愿者。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例

1.材料和方法

1.1细胞株及抗体

人慢性粒性白血病细胞K562购自中国医学科学院肿瘤细胞库。神经激肽1受体的兔源一抗抗体购自巴傲德生物科技有限公司，使用时按1：1000比例稀释，辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔的二抗购自巴傲德生物科技有限公司，使用时按1：5000稀释。内参抗体GAPDH同样购自巴傲德，使用时按1：10000稀释。

1.2白血病病人和正常人血液样品

白血病病人外周血取自浙江省人民医院血液科。正常人外周血取自浙江省中医院下沙院区体检中心。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

将K562细胞培养于含10％FBS(Fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium)培养基中(含谷氨酰胺、10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每3天传代一次，取对数生长期细胞制备蛋白样品并于-80度保存，用于与白血病病人蛋白样品以及健康志愿者蛋白样品一起做Western blotting检测。

1.2.2全血样品中白细胞分离方法

将正常人或白血病患者的外周血样4℃,450g(约2300rpm)离心10min，取血清于干净的1.5mL的EP管中，于—80℃下保存；往剩余血红色沉淀中加约3倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒摇匀后，冰上裂解15min，其间轻轻涡旋混匀两次；再4℃450g离心10min以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。重复此步骤1-2次直到得到白色沉淀。再加1mL PBS，450g，4℃离心5min，弃上清，重复1-2次。再按所得的白细胞的量加适量的RIPA全细胞裂解液(含有10mM的PMSF10％)。在震动器上剧烈震荡后，于冰上充分裂解30min，再于—80℃下保存后与K562细胞蛋白样品同时做Western blotting检测。

2.实验结果

神经激肽1受体(NK1R)在正常体检志愿者和白血病患者外周血白细胞中的表达水平

Western blotting检测结果显示：正常志愿者外周血白细胞中

NK1R呈现低水平的表达或不表达，而相比于正常志愿者，白血病患者外周血白细胞中NK1R呈现高表达(见图1)。

表1综合了所研究的26例白血病病人的相关资料，包括患者年龄、性别、白血病分型，以及外周血白细胞中NK1R的表达水平，如图1中P2是V1的1.43倍，P3是V1的1.39倍，P8是V3的3.38倍，P8是V4的2.89倍，P8是V5的2.59倍，P8是V6的3.28倍，P8是V7的3.49倍，P9是V3的8.70倍，P9是V4的7.46倍，P9是V5的6.66倍，P9是V6的8.44倍，P9是V7的8.99倍，P20是V8的2.75倍，P20是V9的1.42倍，P20是V10的2.21倍，P20是V11的2.14倍，P20是V12的1.41倍，P20是V13的1.55倍，P21是V8的3.50倍，P21是V9的1.81倍，P21是V10的2.81倍，P21是V11的2.72倍，P21是V12的1.80倍，P21是V13的1.97倍。

从表1中可以看出NK1R在白血病患者中呈现高阳性率的检出，阳性率高达73.1％。

表1：所检测的34例白血病病人中神经激肽1受体的表达水平

由此可见，将NK1R的抗体做成一种ELISA试剂盒，利用该试剂盒来在体检中检测受试者外周血中NK1R的表达水平，通过该检测可以高准确率的检测出受试者是否患有白血病的可能性。

本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。

Claims (10)

1.特异性结合神经激肽1受体的抗体在制备用于检测受试者是否患有白血病或是否具有患有白血病风险的试剂盒中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，所述的检测是通过检测受试者外周血中神经激肽1受体表达水平而进行的。

3.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的受试者为哺乳动物。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述的哺乳动物为人。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

6.检测受试者是否患有白血病或是否具有患有白血病风险的试剂盒，其包括作为特异性结合神经激肽1受体的抗体。

7.根据权利要求6中所述的试剂盒，其中所述的受试者为哺乳动物。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述的哺乳动物为人。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的试剂盒，其中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其进一步包含该试剂盒的使用说明书。