CN106282235A - 含有人slc3a2基因的慢病毒载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有人SLC3A2基因慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：用PCR方法扩增人SLC3A2基因，利用基因工程技术将目的基因SLC3A2序列片段连接到LV5载体上，构建其基因重组载体，然后进行病毒包装，最后用荧光定量PCR进行病毒滴度的测定。将含人基因SLC3A2慢病毒载体与宁乡花猪精子细胞在不同条件下进行孵育，利用免疫荧光法和半定量PCR法检测SLC3A2的表达情况。本发明的有益效果为：插入的基因能够在体内稳定表达，生物安全性较高，是制备转基因小型猪动物模型的一项关键技术。
Description
技术领域
本发明涉及DNA遗传工程和小型猪转基因工程领域，尤其涉及一种含有人SLC3A2基因的慢病毒载体的构建方法。
背景技术
转基因动物模型在了解人类疾病的发病过程中起着重要的作用，在开发新型药物中也同样有不容忽视的作用。经典的转基因小鼠模型在生物医学的研究历程中有重要的作用。然而，小鼠和人类在包括生理特性和基因表达等许多方面是不同的。因此，小鼠模型在某些情况下不能充分模仿人类基本疾病类型，所以大型动物模型仍然是迫切需要的。在过去20年，转基因小型猪越来越成为研究人类疾病和其他生物学应用的重要动物模型。
病毒载体是提高转基因表达的一个有效途径。慢病毒可以感染分裂和非分裂细胞。并且可以将外源DNA插入到感染细胞的基因组中。慢病毒使插入的基因序列容量较大，而且这类病毒载体插入的基因能够避免基因沉默并且能在体内稳定表达，能在整合酶基因突变丧失功能时整合，所以生物安全性较高。研究发现，慢病毒载体转染细胞后比逆转录病毒的致癌性低。腺病毒载体携带的目的基因不会整合到宿主细胞的基因组中，且在传代的细胞中将基因信息丢失，同时一些腺病毒基因产物也会致细胞凋亡。研究表明慢病毒载体和逆转录病毒一样能在体外感染雄性小鼠生殖系细胞。另一项研究报道，采用慢病毒载体感染生殖干细胞产生的转基因大鼠，并且稳定遗传到了F2代。迄今为止，已经由慢病毒转基因产生的各种转基因动物包括小鼠、鱼、猪、非人灵长类动物等。相比传统的原核DNA显微注射或体细胞克隆，慢病毒基因转移的效果要高4到8倍，并且在90％以上的第一代转基因动物上都能检测到转基因表达。因此，开发一个可用于转基因小型猪开发的新载体及其构建方法将是解决生产实践中育种时间长的有效方法。
溶质转运蛋白(SLC)基因家族中的SLC3A2、SLC7A1、SLC12A8、SLC22A16、SLC22A 1、SLC22A 2、SLC22A 3基因及其编码的蛋白质可参与多胺的跨膜物质转运。SLC3A2和GGTL3B可与细胞内CT120A相互作用，可能拥有与氨基酸转运及谷胱苷肽代谢有关的重要的生理功能。CT120是在染色体17p13.3高频突变区通过电子克隆及RACE方法克隆并鉴定出的一个人新基因，是一个与乳腺癌及肺癌等发生发展相关的细胞生长重要调节因子。
发明内容
本发明的目的是一种含有SLC3A2基因的慢病毒载体及其构建方法，以解决针对目的基因生长功能的实践验证和转基因小型猪开发新方法的问题。
本发明的第一个方面提供一种含有SLC3A2基因的慢病毒载体，其中SLC3A2基因如序列表中序列1所示，该基因编码的氨基酸序列如序列2所示。
本发明的另一个方面提供含有SLC3A2基因的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(A)用PCR方法扩增SLC3A2基因；
(B)将目的基因SLC3A2克隆到慢病毒载体中；
(C)制备感受态细胞；
(D)将步骤(B)制备的慢病毒载体转化感受态细胞；
(E)从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆；
(F)纯化提取的质粒，将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。
上述构建方法的详细操作过程如下：
PCR方法扩增SLC3A2基因：oligo设计，目的基因SLC3A2序列片段根据编号NM_001012662.2设计，上下游引物分别加上NotI和BamHII及保护碱基，用于载体的亚克隆。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。将oligo溶解成50μM，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix。用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，用Y164-1和Y164-62进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。第一轮PCR可得到混有目的基因的非单一条带的PCR产物混合物，然后再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。PCR反应完成后，利用电泳并切胶回收SLC3A2基因片段。
目的基因SLC3A2克隆到载体LV5中：用NotI和BamHI对SLC3A2基因片段进行酶切，37℃酶切2小时；用NotI和BamHI对载体LV5进行酶切，37℃酶切2小时；电泳后，用NA凝胶回收试剂盒回收SLC3A2基因片段和载体LV5；用T4 DNA ligase连接双酶切得到的SLC3A2基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时。
制备感受态细胞：从-70℃冰箱保存的细菌接种到固体培养基LB中，然后在37℃培养箱培养20h；在平板上挑取一个单菌落直径约2mm，再接种到一个1L烧瓶其中含有100mlLB培养基，接着在37℃剧烈振荡培养3h；将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的1.5ml EP管中，冰上放置10min后，使培养基冷却到0℃。同时用另一管作转化的阴性对照；然后在4℃，13000rpm，30s条件下离心；将培养液，管反转1min，尽量使管培养液倒干净；添加前的0.1mol/L cach500μL冷却，在冰上5min重悬沉淀；再次在4℃，13000rpm，30s条件下离心；接着倒出培养液，最后的培养液通过把EP管倒置将其流尽；加200μl提前冰预冷0.1mol/LCach，重悬沉淀后置于冰上30min；所得产物可用于转化。
将连接产物转化感受态细胞：从-70℃冰箱中取出感受态细胞，将装有其离心管冰上放置4min，待细胞解冻后，加入10μl连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30min；将离心管放到42℃的水浴锅中放好的试管架上，在90s后，取出离心管；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3min；向每支离心管加入800μl不含抗生素的LB培养基，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45min使细菌复苏；取200μl培育后的细胞均匀涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液体消失后，将平板倒置放置于37℃培养箱中，培养16h。
从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆：从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Kanamycin)LB培养基的试管中；将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时；将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒。
纯化提取的质粒：进行琼脂糖胶/溴化乙锭电泳分析PCR产物；确定PCR产物反应的量，将样品转至干净的EP管，加4倍体积的Buffer CP；涡旋，使之彻底混匀，收集完全后，可短暂离心；将DNA结合柱放入已准备好的2ml的收集管；将上述样品放在DNA结合柱中，在室温条件下，离心10000g，1min；弃液体，再将DNA结合柱放到同样的收集管中；加700μl稀释过的DNA Wash Buffer混匀，在室温条件下，10000g，离心1min；弃液体，重复(7)；弃去液体，将结合柱在13000g条件下离心2min；将DNA结合柱放入一个干净的1.5ml EP管中，加30μl Elution Buffer到DNA结合柱基质使其侵没湿润，室温下静置1min，在13000g离心1min。丢弃DNA结合柱，将液体收集到1.5mlEP管中，—20℃保存；收集并鉴定。
将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。
酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。
重组质粒测序验证并大量抽提：取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，将测序结果与目的基因序列进行比对，插入序列100％匹配，证明重组载体构建成功。
慢病毒包装及病毒滴度检测：感染前一天，取293T细胞传代进入24孔板，每孔细胞接种细胞数为1*105个。培养基用正常的DMEM+10％FBS即可；分别吸取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一个细胞培养孔中，不需要换细胞液。病毒可以先稀释，再加入；2天后，丢掉细胞上清。将细胞收集下来，293T细胞基因组。以得到的基因组为模板，定量其中的内参基因BAC和病毒序列WPRE，通过相对定量的方法用2-ΔΔCt法计算病毒基因组数和细胞基因组数的比例。每个样品每个基因重复测两次；引物序列和2-ΔΔCt法；如当定量PCR的Ct值大于30，说明病毒基因组很少，数据的偏差会较大，所以这样的数据不采用；因为使用Taqman探针，故不进行熔解曲线分析。
引物序列：人基因组特异引物和探针(BAC)，5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(forward primer)，5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(reverse primer)，5’-VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’(probe)，病毒基因组特异引物和探针(WPRE)，5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(forward primer)，5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(reverse primer)，5’-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3’(probe)。
附图说明
图1SLC3A2 PCR产物电泳图。
M:DNA Marker；1，2，3，4：均为两次PCR后产物。
图2SLC3A2基因全长测序部分结果。
图3重组载体LV5质粒图谱。
图4重组质粒酶切鉴定图。
M:DNA Marker；1：LV5-SLC3A2双酶切鉴定。
图5LV5-SLC3A2双酶切鉴定测序结果。
图6慢病毒载体与精子孵育不同时间SLC3A2的表达水平。
与1h比较，**P<0.01。
M：DNA Marker；1：慢病毒载体与精子孵育1h；2慢病毒载体与精子孵育2h；3:慢病毒载体与精子孵育3h；4：慢病毒载体与精子孵育4h。
图7免疫荧光检测慢病毒载体与精子孵育不同时间SLC3A2的表达。
A,B：慢病毒载体与精子孵育1h；C,D:慢病毒载体与精子孵育2h；E,F:慢病毒载体与精子孵育3h；G,H：慢病毒载体与精子孵育4h。A,C,E,G在光学显微镜下观测(20×)，B,D,F,H在波长为570nm的荧光显微镜下观察(20×)。
图8不同浓度慢病毒载体与精子孵育后SLC3A2的表达水平。
与104IU/ml比较，**P<0.0。
M：DNA Marker；1：0IU/ml慢病毒载体；2：104IU/ml慢病毒载；3:105IU/ml.慢病毒载体；4：106IU/ml慢病毒载体。
图9免疫荧光检测不同浓度的慢病毒载体与精子孵育后SLC3A2的表达水平。
A,B：0IU/ml慢病毒载体；C,D：104IU/ml慢病毒载体；E,F:105IU/ml.慢病毒载体；G,H：106IU/ml慢病毒载体。A,C,E,G在光学显微镜下观测(20×)，B,D,F,H在波长为570nm的荧光显微镜下观察(20×)。
图10检测不同温度下慢病毒载体与精子孵育SLC3A2的表达水平。
M：DNA Marker；1：17℃慢病毒载体与精子孵育；2：25℃慢病毒载体与精子孵育；3:37℃慢病毒载体与精子孵育。
图11在不同温度条件慢病毒载体与精子孵育SLC3A2的表达水平
A,B：17℃慢病毒载体与精子孵育；C,D：25℃慢病毒载体与精子孵育；3:E,F 37℃慢病毒载体与精子孵育。A,C,E在光学显微镜下观测(20×)，B,D,F在波长为570nm的荧光显微镜下观察(20×)。
图12不同浓度Polybrene与慢病毒载体和精子共孵育SLC3A2的表达水平。
与5μg/mL polybrene比较，**P<0.01。
图13不同浓度Polybrene对慢病毒载体和精子共孵育的影响。
A,B：0μg/mL polybrene；C,D：5μg/mL polybrene；E,F:10μg/mL polybrene；G,H：15μg/mLpolybrene。A,C,E,G在光学显微镜下观测(20×)，B,D,F,H在波长为570nm的荧光显微镜下观察(20×)。
图14慢病毒载体与精子孵育不同时间对精子活力的影响。
和1h组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图15不同浓度的慢病毒载体与精子孵育对精子活力的影响。
与104IU/ml比较，**P<0.01。
图16在不同温度下慢病毒载体与精子孵育对精子活力的影响。
与17℃组比较，*P<0.05。
图17不同浓度Polybrene与慢病毒载体和精子共孵育对精子细胞活力的影响。
与5μg/mL polybrene比较，**P<0.01。
具体实施方式
PCR方法扩增SLC3A2基因：oligo设计，目的基因SLC3A2序列片段根据编号NM_001012662.2设计，上下游引物分别加上NotI和BamHII及保护碱基，用于载体的亚克隆，SLC3A2基因的碱基序列如下：
引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。
将oligo溶解成50μM，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligomix。
用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR体系如下：
反应条件
用Y164-1和Y164-62进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。
PCR体系如下：
反应条件
第一轮PCR可得到混有目的基因的非单一条带的PCR产物混合物，然后再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。条带大小约在2000bp左右，没有非特异性条带产生。而目的基因片段大小为1896bp(图1)。PCR反应完成后，利用电泳并切胶回收SLC3A2基因片段。
目的基因SLC3A2克隆到载体LV5中
用NotI和BamHI对SLC3A2基因片段进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
用NotI和BamHI对载体LV5进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收SLC3A2基因片段和载体LV5。
用T4 DNA ligase连接双酶切得到的SLC3A2基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时，连接体系如下：
制备感受态细胞：从-70℃冰箱保存的细菌接种到固体培养基LB中，然后在37℃培养箱培养20h；在平板上挑取一个单菌落直径约2mm，再接种到一个1L烧瓶其中含有100mlLB培养基，接着在37℃剧烈振荡培养3h；将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的1.5ml EP管中，冰上放置10min后，使培养基冷却到0℃。同时用另一管作转化的阴性对照；然后在4℃，13000rpm，30s条件下离心；将培养液，管反转1min，尽量使管培养液倒干净；添加前的0.1mol/L cach500μL冷却，在冰上5min重悬沉淀；再次在4℃，13000rpm，30s条件下离心；接着倒出培养液，最后的培养液通过把EP管倒置将其流尽；加200μl提前冰预冷0.1mol/LCach，重悬沉淀后置于冰上30min；所得产物可用于转化。
将连接产物转化感受态细胞：从-70℃冰箱中取出感受态细胞，将装有其离心管冰上放置4min，待细胞解冻后，加入10μl连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30min；将离心管放到42℃的水浴锅中放好的试管架上，在90s后，取出离心管；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3min；向每支离心管加入800μl不含抗生素的LB培养基，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45min使细菌复苏；取200μl培育后的细胞均匀涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液体消失后，将平板倒置放置于37℃培养箱中，培养16h。
从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆：从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Kanamycin)LB培养基的试管中。将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒：:挑取单菌落，在到含有抗生素的培养液中培养，37℃摇床培养过夜；室温下，1000g离心1min，留4.5ml菌液，弃液体；添加250μl Solution I用微型移液枪混匀(使细胞完全悬浮)；加250μl Solution II轻轻反转5次，不可剧烈振动，培养2min；加入350μl Solution III立即翻转，充分混匀，直到有白色絮状沉淀产生；在室温，13000g的条件下离心10min，待有白色贴壁沉淀生成，马上在14000g条件下离心15min；去上清液，吸到结合柱中，并置于2ml的收集管中，不要吸入沉淀，在室温下离心1000g，1min；弃液体，再放置到2ml收集管中，加500μl Buffer HB，在室温条件下离心，10000g，1min；弃液体，方知道2ml收集管中，加700μl DNA wash Buffer(稀释)。在室温条件下离心10000g，1min，弃液体；重复一次；离心DNA结合柱2min，13000g，甩干结合柱基质使其干燥，使残余液体不下来；结合柱放在1.5mlEP管中，加50μl Elution Buffer即无菌去离子水到结合柱的基质上，在室温条件下静置1min，然后离心，13000g，1min；收集鉴定：DNA纯度＝A260×50×稀释倍数μg/ml。
纯化提取的质粒：进行琼脂糖胶/溴化乙锭电泳分析PCR产物；确定PCR产物反应的量，将样品转至干净的EP管，加4倍体积的Buffer CP；涡旋，使之彻底混匀，收集完全后，可短暂离心；将DNA结合柱放入已准备好的2ml的收集管；将上述样品放在DNA结合柱中，在室温条件下，离心10000g，1min；弃液体，再将DNA结合柱放到同样的收集管中；加700μl稀释过的DNA Wash Buffer混匀，在室温条件下，10000g，离心1min；弃液体，重复(7)；弃去液体，将结合柱在13000g条件下离心2min；将DNA结合柱放入一个干净的1.5ml EP管中，加30μl Elution Buffer到DNA结合柱基质使其侵没湿润，室温下静置1min，在13000g离心1min。丢弃DNA结合柱，将液体收集到1.5mlEP管中，—20℃保存；收集并鉴定：DNA纯度＝A260×50×稀释倍数μg/ml。
将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下：
酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。
重组质粒测序验证并大量抽提：取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，将测序结果(图2)与目的基因序列进行比对，插入序列100％匹配，证明重组载体构建成功(图5)。对酶切重组载体LV5-SLC3A2鉴定：酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。双酶切后得到一条约为10000bp左右的条带，和2000bp左右的条带，且没有其他非特异性条带(图4)。经过胶回收，纯化产物，测序结果显示，2000bp左右的条带即为目的基因条带。
慢病毒包装及病毒滴度检测：感染前一天，取293T细胞传代进入24孔板，每孔细胞接种细胞数为1*105个。培养基用正常的DMEM+10％FBS即可；分别吸取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一个细胞培养孔中，不需要换细胞液。病毒可以先稀释，再加入；2天后，丢掉细胞上清。将细胞收集下来，293T细胞基因组：收集细胞在1.5mlEP管中，在室温条件下，12000g条件下离心15min；弃去上清后，加入400μl 1M Tris-HCl，200ul EDTA，100μl 10％SDS，10μl蛋白酶K工作液，混匀后，在37℃温育过夜；取出EP管冷却至室温后，充分混匀振荡后加400μl苯酚氯仿异戊醇溶液；混匀后，在12500pm，室温条件下，振荡1h；取出EP管，上下颠倒混匀3min，然后在室温条件下，10000g离心6min；小心吸取上清至另一EP管；加500μlNaCl和2倍体积无水乙醇；充分混匀后可见白色沉淀，并挑出至另一EP管；用75％乙醇洗涤2次；室温干燥10min，直至没有乙醇为止；加50μl无菌水溶解，放置到—20℃冰箱保存。
滴度报告：
吸取3组慢病毒上清液，经过荧光定量PCR测定，C值分别为16.24，1.21，0.21。经过计算得到慢病毒载体滴度分别为3.03×108IU/ml，2.06×108IU/ml，1.02×108IU/ml；平均滴度为2.03×108IU/ml。结果如下表所示。
表1 慢病毒载体滴度测定
以得到的基因组为模板，定量其中的内参基因BAC和病毒序列WPRE，通过相对定量的方法用2-ΔΔCt法计算病毒基因组数和细胞基因组数的比例。每个样品每个基因重复测两次。
引物序列和2-ΔΔCt法；如当定量PCR的Ct值大于30，说明病毒基因组很少，数据的偏差会较大，所以这样的数据不采用；因为使用Taqman探针，故不进行熔解曲线分析。
2-ΔΔCt法：假设每次扩增的效率都是一致的，那么：NCt＝N0*(1+E)Ct
N0：初始模版荧光值NCt：经过Ct个循环扩增后的的荧光值，即阈值，我们假定它不变E：目的片断的扩增效率
两边同时取对数，得：Log(NCt)＝Ct*Log(1+E)+Log(N0)；Ct＝-Log(N0)*1/Log(1+E)+Log(N Ct)/Log(1+E)。式中，Log(N Ct)/Log(1+E)为常数，Log(N0)为自变量，Ct为应变量。以Ct对Log(N0)作图,-1/Log(1+E)为其斜率。设斜率为S，得：S＝-1/Log(1+E)。E＝10-1/S–1
引物序列：
人基因组特异引物和探针(BAC)，
5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(forward primer)
5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(reverse primer)
5’-VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’(probe)
病毒基因组特异引物和探针(WPRE)：
5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(forward primer)
5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(reverse primer)
5’-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3’(probe)。
反应体系
反应条件
宁乡花猪精子与SLC3A2慢病毒载体孵育法：收集精液5ml，添加5ml SFM/BSA后，在37℃条件下培养5min，在25℃，800g条件下离心10min，弃去上清后，在17℃，800g条件下离心10min，彻底干净的弃去上清后，用5ml SFM/BSA将精子重悬浮，用细胞计数板将精子细胞计数，每次进行下一步实验的精子数量约为1×109个/ml。
根据不同分组条件，对精子进行孵育。
将不同浓度(104IU/ml，105IU/ml，106IU/ml)慢病毒载体与精子细胞在17℃条件下孵育2h；将105IU/ml慢病毒载体与精子细胞在17℃条件下，分别孵育不同时间(1h，2h，3h，4h)；105IU/ml慢病毒载体与精子细胞分别在不同温度(17℃，20℃，25℃，37℃)下孵育2h；不同浓度(0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL)的Polybrene分别添加105IU/ml慢病毒载体和精子细胞在17℃条件下孵育2h。
用PCR检测精子与慢病毒载体孵育后SLC3A2的表达
根据SLC3A2设计引物，引物由华大基因公司合成
将提取的DNA在如下反应体系中检测。
反应条件如下
将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察结果。
免疫荧光法检测精子与慢病毒载体孵育后SLC3A2的表达：提前用多聚赖氨酸处理6孔板，以备后续实验；用1ml与慢病毒载体孵育后的精子细胞悬液放入6孔板中，用甲醇固定30min；吸去上清，用PBS洗涤3次；接着用1％BSA的PBS溶液封闭，在4℃冰箱过夜；吸取上清后，用1：1000稀释后的VGV抗体工作液，孵育1h；去掉上清后，用PBS洗涤3次；在倒置荧光显微镜下观察；用image J图像分析软件处理。
慢病毒载体与精子孵育不同时间SLC3A2的表达
慢病毒载体与精子孵育1h组，并没有检测到目的基因，而在2h组，SLC3A2的表达明显增加。并且2h，3h，4h检测到的目的基因水平都没有差异。在1h，2h，3h，4h各组都能观察到红色荧光。而2h，3h，4h各组与1h组相比，相对荧光密度提高，有显著性差异(P<0.01)。如图6，7。
不同浓度慢病毒载体与精子孵育后SLC3A2的表达水平
通过PCR检测如图8，在0IU/ml慢病毒载体与精子孵育后，没有目的基因条带出现，而在与104IU/ml慢病毒载体孵育后，有条带出现；在105IU/ml和106IU/ml慢病毒载体与精子孵育后，目的基因水平明显高于104IU/ml时，没有显著差异。在荧光下观察时如图9，0IU/ml慢病毒载体与精子孵育后，没有荧光。104IU/ml、105IU/ml和106IU/ml各组，均有有红色荧光出现；106IU/ml和105IU/ml组的相对荧光密度都高于104IU/ml组，且有显著性差异(P<0.01)。
不同温度下慢病毒载体与精子孵育SLC3A2的表达水平
分别在17℃，25℃，37℃条件下慢病毒载体与精子孵育，目的基因的水平并没有明显差异如图10所示。在荧光显微镜观察，慢病毒载体与精子孵育在不同温度下，相对荧光密度也没有明显差异(图11)。
不同浓度Polybrene与慢病毒载体和精子共孵育SLC3A2的表达水平
在0μg/mL和5μg/mL polybrene与慢病毒载体和精子共孵育时，目的基因的水平没有明显差异，与加入10μg/mL和15μg/mL polybrene相比目的基因水平低如图12。在荧光显微镜下观察时(图13)，0μg/mL和5μg/mL polybrene组的相对荧光密度低于10μg/mL组和15μg/mL组，且有显著性差异(P<0.01)。
检测精子活力：吸取孵育后的精子细胞10μl到990μlSFM培养基中，混匀；在光学显微镜下观察精子活力即直线运动的精子细胞数/总精子细胞数×100％
随着慢病毒载体与精子孵育时间增加，精子活力降低：1h和2h组精子细胞活力没有显著性差异(P>0.05)，而3h和4h组与1h和2h组相比精子细胞活力降低，有显著性差异(P<0.05)(图14)。
慢病毒载体的浓度增加，精子活力降低：104IU/ml、105IU/ml和106IU/ml各组与0IU/ml组相比，精子细胞活力降低有显著性差异(P<0.01)。并且106IU/ml组的精子细胞活力显著低于104IU/ml和105IU/ml组(P<0.01)(图15)。
温度增加，精子活力降低：17℃组的精子细胞活力高于25℃和37℃组，有显著性差异(P<0.05)(图16)。
15μg/mL Polybrene降低精子细胞活力：0μg/mL、5μg/mL和10μg/mL各组间精子活力的差异不明显。15μg/mL组的精子细胞活力显著低于0μg/mL、5μg/mL和10μg/mL各组(P<0.01)(图17)。
Claims (5)
1.构建含有SLC3A2基因的慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
(A)用PCR方法扩增SLC3A2基因；
(B)将目的基因SLC3A2克隆到慢病毒载体中；
(C)制备感受态细胞；
(D)将步骤(B)制备的慢病毒载体转化感受态细胞；
(E)从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆；
(F)纯化提取的质粒，将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(A)中所使用的引物为：
正向引物：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’
反向引物：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(A)包括：
oligo设计，目的基因SLC3A2序列片段根据编号NM_001012662.2设计，上下游引物分别加上NotI和BamHII及保护碱基，用于载体的亚克隆；用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，用Y164-1和Y164-62进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。第一轮PCR可得到混有目的基因的非单一条带的PCR产物混合物，然后再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带，PCR反应完成后，利用电泳并切胶回收SLC3A2基因片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(B)包括：用NotI和BamHI对SLC3A2基因片段进行酶切，37℃酶切2小时；用NotI和BamHI对载体LV5进行酶切，37℃酶切2小时。电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收SLC3A2基因片段和载体LV5，用T4 DNA ligase连接双酶切得到的SLC3A2基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(D)包括：从-70℃冰箱中取出感受态细胞，将装有其离心管冰上放置4min，待细胞解冻后，加入步骤(B)制备的10μl连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30min；将离心管放到42℃的水浴锅中放好的试管架上，在90s后，取出离心管；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3min；向每支离心管加入800μl不含抗生素的LB培养基，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45min使细菌复苏；取200μl培育后的细胞均匀涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液体消失后，将平板倒置放置于37℃培养箱中，培养16h。
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