CN106282212A

CN106282212A - 三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用

Info

Publication number: CN106282212A
Application number: CN201610717422.XA
Authority: CN
Inventors: 黄剑飞; 王志伟; 咸云; 曹学敏; 李洁莹; 张筱静
Original assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Current assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2036-08-24
Also published as: CN106282212B

Abstract

本发明公开了一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体及其构建方法和应用。该三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，在pcDNA^TM6.2‑GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。本发明的三联amiRNA，降低胰腺癌细胞增殖，促使凋亡增加，并降低了细胞迁移和侵袭能力；在裸鼠移植胰腺癌模型，三联amiRNA‑VEGFRs显著降低了肿瘤的生长，与化疗药物协同作用，并与抑制上皮‑间质转化有关；并且对胰腺形态、外周血的胰岛素和血糖水平无影响。可见针对抑制VEGFRs的三联人工miRNA在制备用于治疗胰腺癌等高表达VEGFRs的恶性肿瘤中具有很好的应用。

Description

三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用。

背景技术

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、早期诊断率低、进展迅速、预后极差。其病死率居恶性肿瘤死亡率中男性第4位、女性第3位。近年来虽然多种方法在胰腺癌的诊治方面取得了一定的进展，但其预后极差，术后复发转移率高，对放疗、化疗不敏感，容易产生多药耐性，5年存活率仍然低于4％。提高胰腺癌的治疗效果，是医疗界面临的一个治疗难题，因此探索基因靶向治疗及其作用机制具有重要意义。最理想的治疗靶点是只针对肿瘤细胞及其周围的肿瘤微环境，靶向药物杀死恶变细胞的同时又不影响正常细胞的生长。目前国内外研究报道显示，肿瘤的靶向治疗以肿瘤新生血管为靶点具特异、高效、安全的特点，且无针对血管的耐药性，其中以血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)和血管内皮生长因子受体(Vascular endothelialgrowth factor receptor，VEGFR)家族的三个亚型(VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3，以下统称VEGFRs)为靶向治疗肿瘤的重要目标。

血管生成是包括胰腺癌在内的实体肿瘤生长和转移的必要因素，肿瘤细胞分泌的VEGFRs和肿瘤的发生发展密不可分，同时成为治疗肿瘤的理想靶点。随着肿瘤微环境作用的研究深入，揭示肿瘤间质成分不但和肿瘤生长和转移有关，而且与上皮间质转化(epithelial meserlchymal transition，EMT)现象以及靶向治疗作用区密切相关。近年来研究报道EMT参与胰腺癌的转移，不但在上皮细胞来源的恶性肿瘤侵袭转移中起重要作用，并与肿瘤抗凋亡现象有密切关系，出现EMT的胰腺癌患者预后明显差。因为某些上皮源性的肿瘤在经历EMT过程中，细胞形态、表面标志物以及运动侵袭能力发生改变，使细胞对化疗药物的敏感性亦产生显著的改变。因此，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性改变以及耐药现象的产生在EMT现象发生的机制中发挥了重要的作用。由此可见，VEGFRs在胰腺癌中高表达可能与EMT现象也有内在联系，抑制VEGFRs在癌中的表达，也许会降低EMT现象发生的后果，其最后结果则是患者病情进展减慢，生存期延长。

近年来系统生物学的出现和不断发展为药物发现提供了一种全新的思路—多靶点药物治疗，同时，对疾病网络系统的进一步研究和认识也揭示了调节单一靶点在复杂疾病治疗中的局限性，多角度攻击疾病系统可以同时调节疾病网络系统中的多个环节，不易产生耐药性，现已应用于多种重大疾病，尤其适用于肿瘤，由于肿瘤的发生发展是由多基因参与的多步骤、多阶段、体内外因素相互作用的复杂过程，多靶点药物治疗会产生协同效应，从而使总效应大于各单效应之和。随着多靶点药物技术的不断成熟，已有越来越多的多靶点治疗药物不断产生。近年来证据表明，MicroRNAs(miRNAs)突变或者异位表达与多种人类癌症相关，人工miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能，可在癌症治疗中起重要作用。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的提供一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体。本发明的另一目的是提供上述三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法。本发明还有一目的是提供上述三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的在制备治疗癌症药物中的应用，以期实现为治疗癌症药物的制备提供有效途径。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，在pcDNA^TM 6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。

所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体在制备用于治疗癌症药物中的应用。

所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，步骤如下：

1)通过引物miRNA-1F、1R扩增miRNA-1表达框，采用凝胶回收PCR产物，目标载体采用pSilence4.1-CMV/neo载体和miRNA-1表达框PCR回收产物分别采用EcoRI和NheI酶切，连接PCR产物至酶切好的pSilence4.1-CMV/neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo中间载体；

2)通过引物miRNA-2F、2R扩增miRNA-2表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo和miRNA-2表达框PCR回收产物分别采用KpnI和HindIII酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo中间载体；

3)通过引物miRNA-3F、3R扩增miRNA-3表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo和miRNA-3表达框PCR回收产物分别采用KpnI和NheI酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-Tri-miRNA/GFP-Neo载体。

所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，miRNA-1F：CCG GTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-1R：CCGATGCATGCTACGACTCACTATAGGGGATGCT；miRNA-2F：CCGTGTAAAACGACGGCCAGTGTTGACATTGATTATTGAC；miRNA-2R：CCGCAGGAAACAGCTATGACCTACGACTCACTATAGGGG；miRNA-3F:CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-3R:CCGTACGACTCACTATAGGGGATGCT。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的三联amiRNA，降低胰腺癌细胞增殖，促使凋亡增加，并降低了细胞迁移和侵袭能力；在裸鼠移植胰腺癌模型，三联amiRNA-VEGFRs显著降低了肿瘤的生长，与化疗药物协同作用，并与抑制上皮-间质转化有关；并且对胰腺形态、外周血的胰岛素和血糖水平无影响。可见针对抑制VEGFRs的三联人工miRNA在制备用于治疗胰腺癌等高表达VEGFRs的恶性肿瘤中具有很好的应用。

附图说明

图1是VEGFRs蛋白在人胰腺癌组织上的表达结果图；

图2是VEGFRs在5株细胞系中表达水平图；

图3是三联人工miRNA-VEGFRs载体构建示意图；

图4是胰腺癌细胞系中用筛选最佳的人工miRNA沉默VEGFRs图；

图5是三联人工miRNA-VEGFRs抑制胰腺癌细胞VEGFRs蛋白表达图；

图6是三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞的增殖能力图；

图7是三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞的侵袭能力图；

图8是流式细胞术测三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞凋亡图；

图9是三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞的凋亡相关蛋白表达图；

图10是三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞的EMT相关蛋白表达图；

图11是三联人工miRNA--VEGFRs在胰腺癌裸鼠模型影响肿瘤生长和病理切片及免疫组化结果图；

图12是三联人工miRNA—VEGFRs作用胰腺癌裸鼠模型肿瘤组织中凋亡和EMT相关蛋白表达变化图；

图13是三联人工miRNA—VEGFRs作用胰腺癌裸鼠模型血糖水平图；

图14是三联人工miRNA—VEGFRs作用胰腺癌裸鼠模型胰岛素水平图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

以下实施例所使用的主要材料为：168例胰腺癌和40例良性胰腺组织的术后石蜡组织，具有完整的临床资料和随访信息，主要来自南通大学附属医院。胰腺癌细胞系4株：BXPC-3，MIAPACA2，ANC-1和SW1990；胰腺良性导管上皮细胞系1株：HPDE6C7；购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。抗-VEGRF1抗体(Abcam，ab32152，USA)，自制抗-VEGRF2抗体(国家发明专利号：ZL 2009 1 0026399.X)，抗-VEGRF3抗体(Abcam，ab27278，USA)，抗-E-cadherin抗体(Abcam，ab76055，USA)，抗-S100A4抗体(Abcam，ab197896，USA)，抗-Vim抗体(Abcam，ab8978，USA)，抗-Bcl-2抗体(Abcam，ab692，USA)，抗-Bax抗体(Abcam，ab10813，USA)，抗-caspase-9抗体(Abcam，ab32539，USA)，抗-caspase-3抗体(Abcam，ab4051，USA)。雌性6周龄BALB/c裸鼠，购于上海国家动物中心，裸鼠饲养于动物隔离器中，并置于无特定病原体屏障环境中。

实施例1

1)大样本胰腺癌组织芯片(含168胰腺癌和40良性胰腺疾病)，临床资料包括性别、年龄、肿瘤直径、位置、分化程度、转移情况，5年总生存率等，样本使用经所在医院伦理委员会同意。石蜡组织芯片切片经高温抗原修复，孵育第一抗体4℃过夜，根据阳性细胞数和染色强度，分为高表达、低或无表达，经统计学分析确认，血管内皮生长因子受体三个亚型在癌组织中表达都高于良性胰腺组织，VEGFR1和VEGFR3不但在肿瘤细胞中有高表达现象，而且在肿瘤间质中有不同程度的阳性表达；VEGFRs在癌中的联合高表达现象与胰腺癌恶性程度，临床分期及患者预后差相关，说明VEGFRs可以作为胰腺癌治疗研究的靶点。

VEGFRs蛋白在人胰腺癌组织上的表达，结果如图1所示，图中，A1)VEGFR1阳性染色位于肿瘤细胞和肿瘤间质，A2)阳性VEGFR2染色在肿瘤细胞中，A3)VEGFR3染色阳性在肿瘤细胞和肿瘤间质；B1)肿瘤细胞VEGFR1染色阳性，b2)肿瘤细胞VEGFR2染色阴性，B3)肿瘤细胞VEGFR3阳性染色；C1)良性胰腺组织VEGFR1阴性染色，C2)良性胰腺组织VEGFR2染色阴性，C3)良性胰腺组织VEGFR3染色阴性。L列×40倍(标尺＝500微米)，H列×400倍放大(标尺＝50微米)染色。

VEGFR1蛋白在肿瘤细胞表达(66.67％，112/168)高于对应的良性胰腺组织和良性疾病胰腺组织(51.61％，32/62)(χ²＝4.3839，p＝0.036)；VEGFR2在肿瘤细胞表达(43.90％，72/164)高于良性胰腺组织(11.43％，8/70)(χ²＝22.994，p<0.001)；VEGFR3在肿瘤细胞表达(67.86％，114/168)高于良性胰腺组织(53.42％，34/73)(χ²＝4.573，p＝0.032)；同时VEGFR1和VEGFR3在胰腺间质中也有表达，VEGFR1蛋白在肿瘤间质表达(50.92％，83/163)高于良性胰腺组织间质(27.50％，11/40)(χ²＝7.086，p＝0.008)，VEGFR3蛋白在肿瘤间质表达(57.23％，83/159)高于良性胰腺组织间质(20.59％，7/34)(χ²＝8.461，p＝0.004)；罕见几例胰腺肿瘤间质有VEGFR2蛋白表达，与良性组织间质表达比较，统计学无差异。

另外，VEGFR1在肿瘤细胞高表达与淋巴结转移(p＝0.002)，周围组织浸润(p＝0.018)和分期晚(p＝0.018)有关；VEGFR1间质高表达与肿瘤细胞血管侵犯(p＝0.014)，淋巴结转移(p＝0.001)，周围组织浸润(p<0.001)和分期晚(p＝0.001)有关。VEGFR2在肿瘤细胞高表达与淋巴结转移(p＝0.001)，周围组织浸润(p＝0.003)和分期晚(p＝0.025)有关；VEGFR3在肿瘤细胞高表达与神经侵犯(p＝0.020)和分期晚(p＝0.031)有关，VEGFR3间质高表达与肿瘤部位(p＝0.024)，淋巴结转移(p＝0.015)和周围组织浸润(p＝0.035)有关。

在这187例胰腺癌组织中，39例(26.53％)肿瘤细胞有VEGFRs蛋白共同高表达(VEGFR1，VEGFR2和VEGFR3)，64例(42.95％)肿瘤间质有VEGFR1和VEGFR3共同高表达；VEGFRs蛋白在肿瘤细胞共同高表达，与肿瘤分期晚(p＝0.036)有关，肿瘤间质有VEGFR1和VEGFR3共同高表达，与肿瘤分化差(p＝0.021)，淋巴结转移(p＝0.003)，周围组织浸润(p＝0.002)和分期晚(p＝0.008)有关。

单因素生存分析显示，肿瘤细胞VEGFR1高表达(HR＝3.291，p＝0.002，95％CI：1.562-6.934)，肿瘤间质VEGFR1高表达(HR＝2.029，p＝0.040，95％CI：1.032-3.987)，肿瘤细胞VEGFR2高表达(HR＝2.975，p<0.001，95％CI：1.544-5.734)，肿瘤细胞VEGFR3高表达(HR＝4.385，p＝0.002，95％CI：1.711-11.239)，肿瘤间质VEGFR3高表达(HR＝2.259，p＝0.018，95％CI：1.147-4.447)和5年生存率差相关；而且，VEGFRs在肿瘤细胞共高表达(HR＝3.510，p<0.001，95％CI：2.050-6.010)，肿瘤间质有VEGFR1和VEGFR3共同高表达(HR＝1.522，p＝0.025，95％CI：1.054-2.197)也和5年生存率差相关。多因素分析结果示，VEGFRs(VEGFR1，VEGFR2和VEGFR3)在肿瘤细胞共高表达是胰腺癌患者的预后差的独立因素。

2)实时定量PCR和免疫印迹

上述5株细胞系培养至对数生长期，提取总RNA，逆转录为cDNA，以β-actin为内对照，扩增VEGFRs基因，引物分别为：

hsβ-actin-RT-F：5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’；

hsβ-actin-RT-R：5’-GCCTCGTCGCCCACATAG-3’；

hs VEGFR1-RT-F：5’-TGGCTTTAAACCAGTTCAGATG-3’；

hs VEGFR1-RT-R：5’-CTCGGACCTGCCTGATATG-3’；

hs VEGFR2-RT-F：5’-CTGAAGGCTCAAACCAGACA-3’；

hs VEGFR2-RT-R：5’-AGAATCTGGGCTGTGCTACC-3’；

hs VEGFR3-RT-F：5’-AGACAGACAGTGGGATGGTG-3’；

hs VEGFR3-RT-R：5’-CCGCTTTCTTGTCTATGCCT-3’。

同样上述细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，用10％SDS-PAGE蛋白胶电泳，转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以anti-β-actin蛋白为内参，上述VEGFRs抗体为第一抗体，化学发光增强系统进行蛋白条带显示。运用ImageJ软件进行灰度分析，将灰度分析整理在excel工作簿中，并且作出对应的柱状图。

结果如图2所示，A1-A3：VEGFRs mRNA在5株细胞系中表达的柱状示意图，B1-B3：VEGFRs蛋白在5株细胞系中表达的柱状示意图；C：免疫印迹实验显示VEGFRs蛋白在5株细胞系中表达，a)HPDE6-C7，b)BXPC3，c)MIAPACA2，d)PANC-1，e)SW1990。结果可知：VEGFR1和VEGFR2在SW1990细胞中表达最高；VEGFR3在PANC-1细胞中表达最高。

实施例2

分别针对3个目的基因VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)构建于pcDNA^TM 6.2-GW/miR载体中，如图3所示，用于表达特异性的人工miRNA，该miRNA经工程化改造，与目的基因序列有100％的同源性并能引起靶标分子的切割。该载体转染至细胞内，通过CMV II型(Pol II)强启动子转录形成的工程化的Pre-miRNA，其结构包含了鼠miR-155的侧翼序列和环序列，其中5’和3’侧翼序列使转录形成的Pre-miRNA与miR-155结构相似，再通过人工优化环序列，提高了切割靶基因的效率。采用快速连接实验方案克隆miRNA并进行转染，可立即表达pre-miRNA，所表达的premiRNA在核内经内源细胞机制(包括Drosha酶)加工后，转运至细胞质，由Dicer酶进一步加工；然后完成加工的miRNA结合到RISC，在此处其功能类似于siRNA，使mRNA靶标被切割。每个目的基因同时设计了4对人工miRNA，分别筛选一个沉默效果的miRNA，用于构建三联人工miRNA-VEGFRs。

VEGFRs基因最佳amiRNA的碱基序列如下表：

Gene	Sequence(5’-3’)	Gene Accession No.	Location
				VEGFR1	GCCTCTGATGGTGATTGTTGA	NM_002019	2987
VEGFR2	GAGAATCAGACGACAAGTATT	NM_002253	2308
				VEGFR3	TTAACTCAGGTGTCACCTTTG	NM_002020	833

图4是在胰腺癌细胞系中用筛选最佳的人工miRNA沉默VEGFRs，图中，A1-A3：在人工miRNA-VEGFRs的作用下，胰腺癌细胞系中VEGFRs mRNA表达不同程度的下调。B1-B3：在人工miRNA-VEGFRs的作用下，胰腺癌细胞系中VEGFRs mRNA表达不同程度的下调；C：免疫印迹条带显示，在人工miRNA-VEGFRs的作用下，胰腺癌细胞系中VEGFRs mRNA表达不同程度的下调；VEGFR1-amiR-3，VEGFR2-amiR-1，VEGFR3-amiR-4的下调效率最高。D：人工miRNA转染胰腺癌细胞系的免疫荧光；a1，sw1990转染前；a2)VEGFR1amiRNA-3转染SW1990，b1，sw1990转染前；b2)SW1990转染VEGFR2amiRNA-1，c1，PANC-1转染前，c2)VEGFR3amiRNA-4转染PANC-1。标尺＝50μm。

4)构建三联人工miRNA，实时定量PCR和免疫印迹检测抑制VEGFRs表达

通过PCR调取miRNA表达框，分别包含转录amiRNA的CMV启动子，GFP及amiRNA结构，和转录终止子；然后通过串联的形式，连接到psliencer4.1的骨架载体(EcoRI和NheI酶切位点，将原来的shRNA表达框删除)。由于整个miRNA表达框2kb，使3个CMV启动子的距离足够远，而不互相干扰各个表达框的转录，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。

具体过程如下：

1)miRNA载体设计通过设计含有CMV启动子，miRNA表达框序列和TK终止子的完整表达框的2端引物序列，引物序列融合相关酶切位点，表达框结构与引物序列共3种。

miRNA-1表达框结构：“EcoRI---miRNA1表达框---HindIII---KpnI---NheI，”引物序列：

EcoRI

miRNA-1F：CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；

NheIKpnIHindIII

miRNA-1R：CCGATGCATGCTACGACTCACTATAGGGGATGCT；

miRNA-2表达框结构“HindIII---M13F---miRNA2表达框---M13R---KpnI”，引物序列：

HindIIIM13F

miRNA-2F：CCGTGTAAAACGACGGCCAGTGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；

KpnI M13R

miRNA-2R：CCGCAGGAAACAGCTATGACCTACGACTCACTATAGGGGATGCT；

miRNA-3表达框结构：“KpnI---miRNA3表达框---NheI”引物序列：

KpnI

miRNA-3F:CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；

NheI

miRNA-3R:CCGTACGACTCACTATAGGGGATGCT。

2)为了方便测序，特别要保证CMV启动子区和miRNA区的正确，在表达框之间融合一个测序引物序列(如M13F/R)。

通过引物miRNA-1F、1R扩增miRNA-1表达框，采用凝胶回收PCR产物，目标载体采用pSilence4.1-CMV/neo载体和miRNA-1表达框PCR回收产物分别采用EcoRI和NheI酶切，连接PCR产物至酶切好的pSilence4.1-CMV/neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo中间载体。

通过引物miRNA-2F、2R扩增miRNA-2表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo和miRNA-2表达框PCR回收产物分别采用KpnI和HindIII酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo中间载体。

通过引物miRNA-3F、3R扩增miRNA-3表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo和miRNA-3表达框PCR回收产物分别采用KpnI和NheI酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-Tri-miRNA/GFP-Neo载体。

结果如图5所示，A.三联人工amiRNA-VEGFRs下调胰腺癌细胞系中VEGFRs mRNAs表达；B.三联人工amiRNA-VEGFRs下调胰腺癌细胞系中VEGFRs蛋白表达；C.免疫印迹条带显示三联人工amiRNA-VEGFRs下调胰腺癌细胞系中VEGFRs蛋白表达。

实施例3细胞计数(CCK8)的增殖实验

SW1990和PANC-1两种细胞系，调整细胞浓度为5×10⁴ cells/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱内培养24h。在96孔板中加入不同浓度梯度的药物，每孔150μL，每组三个复孔，于6h，12h，24h，48h，72h后进行CCK8(Sigma公司产品)检测。每孔加入15μL的CCK8，37℃，5％CO₂培养箱内培养避光孵育3h。酶标检测仪(Thermo MK3型)492nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞增殖影响的分析。

结果如图6所示，和对照细胞比较，针对VEGFRs的三联人工miRNA抑制了PANC-1和SW1990的增殖；SW1990细胞生长第6小时的抑制率达55％，72小时达38％；PANC-1细胞生长第6小时的抑制率为11％，72小时达51％。

实施例4细胞侵袭实验

取出-20℃保存的Matrigel(BD Incorporated，USA)，将其在4℃下过夜解冻，(在4℃进行操作)；将无聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮微孔滤膜(微孔直径8μm)的Boyden小室放置到24孔培养板，形成上下两室。将制备的人工基底膜加入每个Boyden小室的上室，37℃孵育2h使其呈凝胶状。SW1990和PANC-1两种细胞系，待细胞长满后调整细胞浓度，于上室加入300μl细胞悬液(5×10⁴个)，在下室内加入600μl的培养液后，放入细胞培养箱，在37℃，5％CO₂条件下培养24h。取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净膜上未侵袭的细胞以及人工基底膜胶，37℃预温的PBS液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30min，苏木素染色5min。将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在显微镜下计数浸润到小室背面的细胞。

结果如图7所示，显示三联人工miRNA-VEGFRs降低SW1990细胞侵袭能力46％，降低PANC-1细胞侵袭能力80％。

实施例5流式细胞术检测凋亡变化情况

SW1990和PANC-1两种细胞接种至6孔板中，接种密度为10⁵个细胞/孔(细胞达到80％粘连)，每孔加入1mL培养液。细胞给药按照以下实验分组进行实验：空白组：培养液+SW1990/PANC-1+1％DMSO；试验组：SW1990/PANC-1+培养液+不同浓度的miRNA-VEGFRs；分别取24h，48h和72h处理细胞。细胞用胰酶消化后，收集细胞悬液1000r/min离心3min，PBS洗涤2次；最后用PBS调整细胞浓度，混匀，冰75％乙醇固定细胞，1-2h；取200ul单核细胞悬液与PI10ul混匀后避光，室温孵育45min；冷PBS溶液洗涤细胞，流式上机(Becton Dickinson，Bedford，MA，USA)检测，CELL Quest软件分析。

结果如图8所示，显示三联人工miRNA-VEGFRs增加SW1990细胞凋亡，早期(3.61％to 7.43％)，晚期(0.729％to 4.40％)；增加PANC-1细胞凋亡，早期(3.12％to 12.4％)，晚期(0.306％to 2.17％)。

实施例6免疫印迹检测凋亡和EMT变化

细胞培养和蛋白提取，免疫印迹和灰度分析方法同上，结果如图9和图10所示，图9中，A1-A5：SW1990细胞系，B1-B5：PANC-1细胞系；A1，B1：Fas表达；A2，B2：Bcl-2表达；A3，B3：Bax表达；A4，B4：Caspase-9表达；A5，B5：Caspase-3表达；C.SW1990和PANC-1的免疫印迹蛋白条带。图10中，A1-A4：SW1990细胞系，B1-B4：PANC-1细胞系；A1，B1：E-cadherin表达；A2，B2：SW100A4表达；A3，B3：VIM表达；A4，B4：MMP9表达；C.SW1990和PANC-1的免疫印迹蛋白条带。可见，SW1990和PANC-1两种细胞的Fas，BCL-2，Caspase-9和Caspase-3明显上调，BAX蛋白下调，说明增强凋亡；E-cadherin蛋白上调，S100A4，VIM，和MMP9蛋白下调，说明抑制EMT现象。

实施例7建立裸鼠胰腺癌模型

超净台内，75％酒精消毒裸鼠注射部位皮肤，在裸鼠前肢腋下注射50μL(2×10⁶cells)的SW1990细胞悬液。每3天测量一次裸鼠瘤体大小，用游标卡尺测量瘤体最长直径，最短直径，计算肿瘤体积V(mm³)＝πab²/6。当SW1990细胞成瘤至50mm³后，按照分组：3联载体组：即向瘤内多点注射100μl的3联载体(200ng/ml)，3天一次，共4次；空载体组：向瘤内多点注射100μl的NC载体(200ng/ml)，3天一次，共4次；顺铂+3联体组：向瘤内多点注射2.5mg/kg的DDP和100μl的3联载体(200ng/ml)，3天一次，共4次；顺铂组：向瘤内多点注射2.5mg/kg的DDP，3天一次，共4次；生理盐水组：向瘤内多点注射100μl的生理盐水，3天一次，共4次；每日观察裸鼠活动、摄食及饮水情况变化。每天测量一次记录各组裸鼠肿瘤大小和体重。最后一次取血测量血糖(血糖仪)和胰岛素(ELISA试剂盒，上海沪鼎生物科技有限公司)，取胰腺拍照，取瘤块部分冻存，部分WB检测。

结果如图11、12、13和14所示，图11中，A1：顺铂加三联人工miRNA-VEGFRs组，A2：三联人工miRNA-VEGFRs组，A3：顺铂组，A4：三联人工空白miRNA组，A5：生理盐水组B1：各组肿瘤组织形态，B2:各组肿瘤体积生长曲线；C.肿瘤组织H-E染色和免疫组化染色的代表性镜下照片a)生理盐水组，b)三联人工空白miRNA组，c)顺铂组，d)三联人工miRNA-VEGFRs组，e)顺铂加三联人工miRNA-VEGFRs组。×400倍(标尺＝50μm)。

图12中，A1：E-cadherin蛋白，A2：S100A4蛋白，A3：VIM蛋白，A4：MMP9蛋白，A5：FAS蛋白，A6：BCL-2蛋白，A7：BAX蛋白，A8：Caspase 9蛋白，A9：Caspase 3蛋白；B.免疫印迹检测裸鼠肿瘤组织中，凋亡和EMT相关蛋白：1)生理盐水组，2)三联人工空白miRNA组，3)顺铂组，4)三联人工miRNA-VEGFRs组，5)顺铂加三联人工miRNA-VEGFRs组。

显示肿瘤于裸鼠皮下局部呈膨胀性生长，2周后体积逐渐增大，质硬；与生理盐水组或空白载体对照组相比，顺铂减低肿瘤生长，肿瘤细胞巢分散且细胞小；三联人工miRNA-VEGFRs组，肿瘤生长受抑制，除肿瘤细胞巢分散且细胞小之外，肿瘤细胞间隙增宽，可见肿瘤间质胶原变性；顺铂和三联人工miRNA-VEGFRs联合治疗，更加明显抑制肿瘤生长，上述镜下表现之外，肿瘤间隙更宽，间质胶原变性更明显。

免疫组化和免疫印迹检测结果一致证实，顺铂组和三联人工miRNA-VEGFRs组中，E-cadherin，BAX，caspase 3和caspase 9蛋白水平明显增高，顺铂和三联人工miRNA-VEGFRs联合治疗组中增高最明显；反之是BCL-2，VIM和S100A4蛋白降低。各组的血糖水平无明显变化。各组胰岛素水平无明显变化。

Claims

1.一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，其特征在于，在pcDNA^TM6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。

2.权利要求1所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体在制备用于治疗癌症药物中的应用。

3.权利要求1所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

4.根据权利要求3所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，其特征在于，miRNA-1F：CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-1R：CCGATGCATGCTACGACTCACTATAGGGGATGCT；miRNA-2F：CCGTGTAAAACGACGGCCAGTGTTGACATTGATTATTGAC；miRNA-2R：CCGCAGGAAACAGCTATGACCTACGACTCACTATAGGGG；miRNA-3F:CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-3R:CCG TACGACTCACTATAGGGGATGCT。