CN106267349A - 一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法 - Google Patents

一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种富血小板纤维蛋白膜(PRF)的制备方法，属于生物材料和组织工程技术领域，本发明的PRF，采用静脉血样本，经离心机在1000‑3000转离心操作10‑30分钟后，将离心产物在红细胞PRF交界偏向红细胞1‑3mm处剪去红细胞层，并倒掉上清液，将得到的PRF凝胶放置多层纱布上，上覆多层纱布，用力持续挤压纱布，使PRF在纱布中间缓缓受压并持续脱水。本发明的PRF三维结构致密，脱水完全，其生长因子释放缓慢而持久，是软硬组织再生术中，理想的生长因子来源，在植入体内4周内，缓释生长因子的同时，也保持了自身膜状结构的相对稳定，可以作为GBR术区的屏障膜，为GBR术区持续隔离封闭的成骨空间。

Description

一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料和组织工程技术领域，具体涉及一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法。
背景技术
富血小板纤维蛋白(Platelet-rich-fibrin,PRF)，是一种完全源自自体外周血的生物材料，其制备方法与第一代血小板凝集生长因子PRP类似，然而PRF在制备的过程中不需要添加外源性物质，这也避免了其制备过程中可能出现的交叉感染及免疫反应。PRF本身良好的机械性能及缓释特性，赋予了其作为生物膜及生长因子的载体参与局部组织再生的能力，PRF会随着时间缓慢降解，进而内部多种生长因子也会随时间逐渐释放到周边组织中，持续刺激种植体周围软硬组织再生，此外，PRF内含有大量源自血小板的细胞因子，可以激活患者术区的白细胞并促进术区的抗炎抗感染效果。由于其极佳的促进软硬组织再生能力，PRF近年来被广泛应用于种植位点存在严重软硬组织缺损的病例中。
现有方法，主要为压膜器法制备PRF膜，如图1所示，其主要制备过程如下：
1).取静脉血10-20ml，以1000-3000r/min匀速离心10-15min，将离心后的上清液倒出，得到PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞处剪去红细胞层；
2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于钳夹中，手紧握住钳柄，加力挤压钳夹中的PRF，使挤压时间>10秒，使得PRF脱水，最终形成富血小板纤维蛋白膜。
而该方法制备的PRF脱水相对不完全，三维结构也相对不够致密。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法，具体步骤如下；
1).取静脉血10-20ml，以1000-3000r/min匀速离心10-30min，将离心的物质倒出，得到如图2所示的PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞1-3mm处剪去红细胞层，并倒掉上清液；
2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于多层纱布上，并覆盖多层纱布，挤压纱布并持续加压，使得PRF在纱布中间充分脱水，并塑形为膜结构，最终形成富血小板纤维蛋白膜。
进一步地，步骤(1)中所述的静脉血放置于离心机中进行离心。
进一步地，步骤(2)中所述的纱布层数大于30层。
更进一步地，步骤(2)中所述的纱布持续加压时间大于20s。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
通过本发明的纱布法制备的PRF膜的纤维结构更加致密，现有技术中压膜器法制备的PRF薄膜中，纤维丝遭到了破坏，部分纤维丝因压力而塌陷或出现形变，三维纤维结构也在一定程度上出现了塌陷和破坏，空隙不均匀，而纱布法制备的PRF其内部三维结构完整，空隙均匀，其网格结构致密而完整，同时并没有受到破坏，同时其内部含有的PDGFTGF－b，VEGF的释放量并没有受到影响。动物体内试验显示：压膜器法制备的PRF膜平均厚度于第2w、3w、4w、5w显著降低，而纱布法及注射器法前4周PRF膜平均厚度降低并不明显。纱布法，相对于压膜器法，制备的PRF薄膜在体内前4周保证了相对的稳定，因而在前4周的重要成骨时间段内，纱布脱水法制备的PRF可以保证相对的稳定，在为GBR术区提供生长因子促进成骨的同时，其致密而相对稳定的的结构也可以作为GBR手术的屏障膜，为GBR术区提供稳定的屏障保护。
附图说明
图1为现有技术压膜器法制备富血小板纤维蛋白膜的流程图；
图2为本发明制备富血小板纤维蛋白膜的流程图；
图3为实施例3离心得到的PRF凝胶结构；
图4为实施例3纱布加压脱水之前的结构示意图；
图5为实施例3纱布加压脱水之后结构示意图；
图6a为实施例1通过压膜器法制备的PRF膜的扫描电镜图；图6b为实施例3采用纱布法制备的PRF膜的扫描电镜图；
从图6a中可以看出，压膜器法制备的PRF膜的纤维直径差异较大，在1μm－5um之间，纤维束之间空隙结构直径约为1-5μm，其表面形貌稀疏，孔隙率高且孔隙大，其纤维分布均匀一致，排列规则，相互交错，呈现三维网状交叉结构，纤维网络中可容纳有呈球形的白细胞和中央凹陷呈扁形的红细胞；
从图6b中可以看出，纱布法制备的PRF膜纤维，直径相对均一，在1-2um之间，其表面孔隙结构适中，其纤维粗细适中，其表面结构平整致密，可看到网状的纤维蛋白交叉结构。
图7a为实施例1通过压膜器法制备的PRF膜的透射电镜图；图7b为实施例3采用纱布法制备的PRF膜透射电镜图；
从图7a中可以看出，压膜器法制备的PRF膜内部纤维密度最低，纤维之间空隙大且多，结构稀疏，其膜内部纤维束孔隙平均直径约1-2μm。
从图7b中可以看出，纱布法制备的PRF膜内部纤维密度最高，纤维分布紧凑几乎无空隙，其膜内部纤维束孔隙平均直径约为500nm。
图8:三种方法制备的PRF膜在不同时间点释放的PDGF量；
图9:三种方法制备的PRF膜在不同时间点释放的TGF-B量：
图10:三种方法制备的PRF膜在不同时间点释放的VEGF量；
从图中可以看出，三种方法制备的PRF膜虽然在表面形貌与纤维密度上有差异，但是对TGF-β1、VEGF及PDGF-AB等细胞因子的释放及纤维膜的降解速度并没有产生显著性差异。这也说明，改良注射器法和纱布法制备的PRF薄膜相比对照组钳夹法，并不会减低其内部生长因子的释放。
图11:三种方法制备的PRF膜在植入动物皮下不同时间点剩余PRF膜厚度值比较；
从图中可以看出，对照压膜器法制备的PRF膜在植入动物皮下前4周内，其厚度降低迅速，相应具有较快的降解速度，而纱布法和注射器法制备的PRF在植入动物皮下前4周的厚度变化相对较小，其降解速度相对较慢，相对结构也更加稳定。
具体实施方式
实施例1利用压膜器法制备PRF膜的步骤
1).取静脉血20ml，以3000r/min匀速离心10min，将离心后的物质倒出，得到PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞处剪去红细胞层；
2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于钳夹中，手紧握住钳柄，加力挤压钳夹中的PRF，使挤压时间20秒，使得PRF脱水，最终形成富血小板纤维蛋白膜。
实施例2利用纱布法制备PRF膜的步骤
1).取静脉血20ml，以3000r/min匀速离心10min，将离心后的物质倒出，得到如图2所示的PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞3mm处剪去红细胞层；
2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置放在30层纱布上，对纱布加压，并最终持续加压20秒，在纱布压迫PRF的同时，使得PRF本身的水分充分渗透到纱布中并完成脱水，最终形成富血小板纤维蛋白膜。
实施例3利用注射器法制备PRF膜的步骤
1).取静脉血20ml，置于离心机中以3000r/min匀速离心10min，将离心后的物质倒出，得到如图2所示的PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞3mm处剪去红细胞层；
2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于5ml注射器中，去除注射器针头，并将注射器前部针管剪掉，注射器头部顶在30层纱布上，以0.2ml/s的速度挤压注射器尾部使得注射器压迫PRF的同时，PRF本身的水分沿着注射器头部渗透到纱布中，最终形成富血小板纤维蛋白膜。

Claims (4)

1.一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法，具体步骤如下；
1).取静脉血10-20ml，以1000-3000r/min匀速离心10-30min，将离心后的物质倒出，得到PRF凝胶结构，用医用剪刀在PRF凝胶与红细胞交界处偏向红细胞1-3mm处剪去红细胞层，并倒掉上清液；
2).将步骤(1)得到的PRF凝胶置于多层纱布上，并覆盖多层纱布，挤压纱布并持续加压，使得PRF在纱布中间充分脱水，形成膜结构，最终形成富血小板纤维蛋白膜。
2.如权利要求1所述的一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的静脉血放置于离心机中进行离心。
3.如权利要求1所述的一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的纱布层数大于30层。
4.如权利要求1所述的一种富血小板纤维蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的加压时间大于20秒。
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