CN106267197A - 一种靶向热消除调节性t细胞的光热转换纳米颗粒、制备及应用 - Google Patents

一种靶向热消除调节性t细胞的光热转换纳米颗粒、制备及应用 Download PDF

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Abstract

一种靶向热消除调节性T细胞的光热转换纳米颗粒，所述纳米颗粒表面设有接枝有长循环的亲水性官能团以及靶向调节性T细胞的官能团，其粒径在2‑100纳米之间；所述的纳米颗粒，包括非化学计量比的氧化钨纳米颗粒或者金纳米颗粒；其中非化学计量比的氧化钨纳米颗粒，其分子式为WOx；氧化钨纳米颗粒的粒径在2‑100纳米之间；所述的靶向纳米颗粒为金纳米颗粒时，其粒径在1‑200纳米之间，形状为球形，三角形或棒状结构中一种或多种；本发明通过去除肿瘤组织中的调节性T细胞，能阻断调节性T细胞对杀伤性T细胞活性的抑制，而且光热治疗产生的热量刺激外周血杀伤性T细胞的活化，削弱肿瘤免疫耐受的同时刺激抗肿瘤免疫反应，对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。

Description

一种靶向热消除调节性T细胞的光热转换纳米颗粒、制备及 应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫干预的材料技术领域，具体涉及应用调节性T细胞靶向性纳米粒子及制备。
背景技术
肿瘤免疫治疗作为一种具有良好机体耐受性和高度病变选择性的疗法，已被视为肿瘤传统三大疗法外的第四极，成为了个性化治疗手段的典范。然而，基于免疫治疗的缓解率和总生存期不如人意，与免疫治疗在体外实验中所得的一系列令人瞩的成果形成强烈反差。随着对肿瘤体内微环境认识的不断加深，表型为CD4+CD25+FoxP3+，被称为调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)的细胞引起了人们广泛的关注。Tregs在体内的功能主要是抑制细胞杀伤性T细胞的过度活化以及树突状细胞对于抗原的呈递，平衡Th1免疫反应。临床结果已经证实多种不同类型肿瘤内Tregs细胞量显著上调，对自体回输的癌细胞特异性T细胞及树突状细胞疫苗活性具有明显的抑制力。而体外细胞培养中显然没有考虑到Tregs细胞的存在，抗肿瘤疫苗所激活的免疫反应可以按照预定方式发挥细胞杀伤作用，这也是造成体内外治疗效果巨大差异的原因。
认识到了这一问题后，新型的基于阻断Tregs细胞对于免疫细胞活性抑制的免疫治疗手段已经被研发。例如杀伤性T细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen 4，CTLA-4)是Treg细胞通过接触诱导杀伤性T细胞失活的关键蛋白。通过体内注射人源化CTLA-4抗体，可以预先封闭Treg细胞表面受体，抑制与对于杀伤性T细胞的CD28受体的结合，维持T细胞的活化。而新近获批的用于阻断诸如PD-1，PD-L1，4-1BB等靶点的药物毒副作用更低，进一步便显出了更大的治疗优越性。然而必须认识到的时，由于肿瘤患者自体免疫力较弱，即便受益于此类疗法，自身的抗肿瘤免疫反应依旧无法有效杀伤癌细胞。为了取得理想的治疗效果，阻断免疫抑制的药物必须与刺激抗肿瘤免疫治疗方案联合，抬高了治疗成本。寻找一种简便易行的治疗手段，激活抗肿瘤免疫反应的同时又能抑制Tregs的活性对于免疫治疗而言显得尤为重要。
发明内容
本发明目的是，在现有的技术基础上，设计了一种联合光热治疗与免疫治疗的新型材料-光热转换靶向热消除调节性T细胞的纳米颗粒及制备方法、应用。此纳米颗粒可通过光热治疗诱导Tregs细胞的凋亡，从而阻断其针对杀伤性T细胞活性的抑制；再利用光热治疗产生的热量刺激外周血杀伤性T细胞活化，削弱肿瘤免疫耐受的同时刺激抗肿瘤免疫反应，增强肿瘤的抗肿瘤免疫治疗能力。
为实现上述目地，本发明采用如下技术方案：一种靶向热消除调节性T细胞的光热转换纳米颗粒，所述纳米颗粒是将一种具有光热转换功能的纳米颗粒，所述纳米颗粒表面设有接枝有长循环的亲水性官能团以及靶向调节性T细胞的官能团，其粒径在2-100纳米之间；所述的纳米颗粒，包括非化学计量比的氧化钨纳米颗粒或者金纳米颗粒；其中非化学计量比的氧化钨纳米颗粒，其分子式为WOx，2<X<3；氧化钨纳米颗粒的粒径在2-100纳米之间；其形状为球形或棒状、长径比大于1且小于20；所述的靶向纳米颗粒为金纳米颗粒时，其粒径在1-200纳米之间，形状为球形，三角形或棒状结构中一种或多种；棒状结构的纳米颗粒的长径比大于1小于20；以表面修饰靶向调节性T细胞的单抗的光热转化纳米颗粒作为与Tregs细胞靶向性结合的载体，赋予了这一纳米颗粒选择性结合Tregs细胞的能力，并通过体内和体外实验验证其Tregs靶向作用及对肿瘤的免疫热疗效果。所述的纳米颗粒，其特征是在可见-近红外区即500-2000nm波长范围内具有较强的光吸收能力，产生光热转化。
进一步，所述的纳米颗粒表面靶向调节性T细胞的官能团为：CD39单抗、CD25单抗、CTLA-4单抗或者Foxp3单抗中的一种或多种。
所述的纳米颗粒，其表面接枝有长循环的亲水性官能团是指长循环层为聚乙二醇(PEG)，聚丙烯酸(PAA)，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。
所要求的长循环层的亲水性官能团，PEG的分子量为500-20000Da；聚丙烯酸分子量为1000-10000Da，聚乙烯基吡咯烷酮分子量为2000-20000Da。
所述的纳米颗粒的制备方法，纳米颗粒的纳米内核为氧化钨时，以WCl6在氮气保护条件下，溶解在乙二醇中，室温下搅拌溶解，得到金黄色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物，搅拌至全部溶解后，在140±15℃条件下氮气保护搅拌反应，体系受热后，最初为深棕黄色，最终转变为深蓝色，继续加热1.5h，而后降温至80℃，加入50mL去离子水，继续搅拌反应1h，停止加热，将反应后的溶液离心纯化，弃去上清液，产物用去离子水洗涤分散，重复这一洗涤过程三次，最终得到纯化产物，为深蓝色颗粒粉末；所制备的带聚丙烯酸聚合物的氧化钨W18O49纳米材料分散在生理盐水中，和靶向官能团结合，制备靶向纳米材料。WCl6与聚丙烯酸聚合物的质量比为1:0.9-1.6。
纳米颗粒的纳米内核为金纳米颗粒时的制备方法：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入HAuCl4溶液中，搅拌溶解后，加入的硼氢化钠反应，得到蓝色溶液；取CTAB和0.08g水杨酸钠，溶解于25ml蒸馏水中，溶解完全后，加入0.5ml、4mM的硝酸银，水浴30℃静置15min左右，再加入25ml，1mM的HAuCl4和0.2ml浓盐酸，温和搅拌15min后，加入300微升0.1M的抗坏血酸，得到无色溶液。最后加入80微升步骤1所得的蓝色溶液，反应12h～24h后，终止反应，8500rpm离心、蒸馏水洗涤三次。获得金纳米棒，其长径比为4；所制备的金纳米棒分散在生理盐水中，和靶向官能团结合，制备靶向纳米材料。
本发明得到的光热转换靶向热消除调节性T细胞的纳米颗粒在制备联合光热治疗与免疫治疗的药物中的应用：此纳米颗粒可通过光热治疗诱导Tregs细胞的凋亡，以表面修饰靶向调节性T细胞的单抗的光热转化纳米粒子作为与Tregs细胞靶向性结合的载体，赋予了这一纳米粒子选择性结合Tregs细胞的能力，并通过体内和体外实验验证其Tregs靶向作用及对肿瘤的免疫热疗效果。
Tregs细胞的凋亡阻断其针对杀伤性T细胞活性的抑制；再利用光热治疗产生的热量刺激外周血杀伤性T细胞活化，削弱肿瘤免疫耐受的同时刺激抗肿瘤免疫反应，增强肿瘤的抗肿瘤免疫治疗能力。免疫热疗在肿瘤区内选择性诱导了Treg细胞的凋亡，破坏了其对免疫细胞活性的抑制。同时肿瘤组织局域产生热量。
具体操作如下：
(1)钨蓝纳米粒子的合成，首先称取WCl6 600mg，PAA 200mg加入50mL一缩二乙二醇当中，N2保护条件下在60℃条件下搅拌反应30min直至全部溶解，所得溶液为金黄色。而后将该分散液直接加入预热至180℃的油浴当中，反应30min后停止加热，将所得溶液自然冷却至室温，向体系中加入50mL去离子水，静置约30min后，9000rpm×10min离心收集所得蓝色沉淀后去离子水洗涤三遍，去除未反应的PAA和WCl6，所得产物放置于4℃冰箱中待用。
(2)钨蓝纳米粒子的靶向性修饰，将100mg新制的钨蓝纳米颗粒分散在20mL去离子水当中(4℃)搅拌均匀后，加入150mg EDC和90mg sulfo-NHS，磁力搅拌条件下反应1.5小时，而后将所得溶液离心纯化后去离子水洗涤三次，去除EDC和sulfo-NHS反应后的副产物，所得纳米颗粒重新分散在50mL预冷至4℃的PBS溶液当中。在冰浴条件下加入30μL CD39单抗(1mg/mL，兔抗小鼠CD39多抗，Lot#ab 128666,Abcam)反应5h。离心收集表面修饰的钨蓝纳米粒子后用PBS洗涤三次，将所得的纳米粒子分散在PBS当中，保存在4℃冰箱中待用(W18O49anti-CD39antibody，简记为WOAA纳米粒子)。
(3)光热转化纳米粒子和Tregs细胞体外共培养结果：我们将Tregs细胞和我们所制备的纳米微粒共培养，并采用808nm的激光照射，研究纳米颗粒对Tregs细胞的靶向性热杀伤能力。研究发现Tregs细胞与WOAA纳米粒子共培养并不会抑制其活性，WOAA本身不具有治疗效果。经激光照射后，Tregs细胞大量凋亡，WOAA纳米颗粒靶向性热疗破坏的不仅仅是Treg细胞自身的结构，同时还对其细胞因子的代谢相关机能造成了破坏，在一定程度上解除了Treg细胞对于抗肿瘤免疫反应的抑制。
(4)光热转化纳米粒子和荷瘤小鼠的体内光热治疗效果：
将靶向纳米颗粒注射到荷瘤小鼠体内，并经808nm激光多次照射后，靶向性热疗显著刺激了CD8+细胞毒淋巴细胞(CD8+CTL)的增殖，这对于刺激外周血重建抗肿瘤细胞免疫反应具有积极的治疗意义。同时发现随着时间的变化，WOAA热疗引起的CD8+CTL其比例虽然逐渐下调，但是即便经过15天，CD8+/CD4+比例仍高达0.47。这部分活化的CTL细胞浸润到肿瘤组织后，具有肿瘤细胞杀伤活性的亚群比例显著高于非靶向性热疗组和阴性对照组，证明靶向性热疗可以募集具有抗肿瘤活性的免疫细胞群进入肿瘤组织。
有益效果：本发明中免疫热疗在肿瘤区内选择性诱导了Treg细胞的凋亡，破坏了其对免疫细胞活性的抑制。同时肿瘤组织局域产生的热量，活化了外周血当中具有抗肿瘤活性的CD8+CTL细胞，这部分细胞被募集到肿瘤区域后，与M1型巨噬细胞协同作用诱导了肿瘤细胞的凋亡，最终形成了免疫热疗结束后短期内仅有Treg细胞凋亡，而后肿瘤细胞凋亡持续上升的结果。
附图说明
图1为所制备的WOAA纳米颗粒的透射电镜照片；
图2为经808纳米的激光照射后的纳米微粒的升温曲线(左图)和形貌(透射电镜，右图，右图的四幅图中，上两幅(分别对应两个放大倍数)是未经照射微粒形貌，下两幅(分别对应两个放大倍数)是经5循环照射微粒形貌)；
图3为WOAA纳米颗粒和4T1(I左)细胞及Tregs(II左)的结合。I、II右图为元素分析照片，在Tregs细胞表面有大量的钨元素，证明了WOAA纳米颗粒和Tregs的选择性结合。
图4为WOAA纳米颗粒在瘤内的代谢。72小时后，仍能观察到约1/5的纳米微粒存在于肿瘤中。表明WOAA与肿瘤微环境浸润Treg细胞充分结合。
图5为荷瘤小鼠注射不同的材料后，经激光照射后，肿瘤大小的变化(注射WOAA纳米颗粒并经808nm激光照射后的肿瘤几乎完全消退)；
图6为荷瘤小鼠注射不同的材料后，经激光照射后，生存率的变化(注射WOAA纳米颗粒并经808nm激光照射后，小鼠40天后全部存活)。
图7为光热转换纳米颗粒靶向热消除调节性T细胞的纳米微粒(左图)及其体内变化(右图)示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式描述本发明的技术方案，但并不限于下述实施例。本发明中，将一种具有光热转换功能的纳米颗粒表面接枝有体内长循环组分和靶向调节性T细胞的官能团(图7左)。该复合纳米颗粒在肿瘤组织中显示对调节性T细胞的高度靶向性。将具有皮肤高透过性的近红外光照射已经注射了该复合纳米微粒肿瘤组织，发生光热转化，产生热量，升高温度，杀死肿瘤组织中的调节性T细胞，解除肿瘤中调节性T细胞产生的肿瘤免疫抑制作用，增强人体免疫系统杀伤肿瘤细胞的作用。本发明是一种联合光热治疗与免疫治疗的新型光热免疫热疗手段。通过去除肿瘤组织中的调节性T细胞，不但能阻断调节性T细胞对杀伤性T细胞活性的抑制，而且光热治疗产生的热量刺激外周血杀伤性T细胞的活化，削弱肿瘤免疫耐受的同时刺激抗肿瘤免疫反应，对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，有效治愈肿瘤疾病，适合推广使用。
实施例1，
(1)、称取WCl6 200mg，在氮气保护条件下，溶解在50mL乙二醇中，室温下搅拌溶解，得到金黄色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物300mg，搅拌至全部溶解后，在140℃条件下氮气保护搅拌反应，体系受热后，最初为深棕黄色，30min后转为蓝绿色，1h后最终转变为深蓝色，并保持不变，继续加热1.5h，而后降温至80℃，加入50mL去离子水，继续搅拌反应1h，停止加热，将反应后的溶液离心纯化，弃去上清液，产物用去离子水洗涤分散，重复这一洗涤过程三次，最终得到纯化产物，为深蓝色W18O49颗粒粉末，TEM可见其平均粒径为4.9nm。
(2)所制备的氧化钨纳米材料分散在生理盐水中，和靶向官能团CD39单抗结合，制备靶向纳米材料。CD39单抗可以靶向到肿瘤内Tregs细胞表面高表达的CD39，从而将复合WOAA纳米颗粒靶向高效的结合到Tregs。
(3)，建立相应的小鼠肿瘤模型，将上述靶向WOAA纳米颗粒和进尾静脉注射或者瘤内原位注射后，采用1064nm的激光器波长，照射肿瘤，检测经不同激光照射时间，次数，强度，并测定其抗肿瘤效果。
实施例2
1)、称取WCl6 200mg，在氮气保护条件下，溶解在50mL乙二醇中，室温下搅拌溶解，得到金黄色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物300mg，搅拌至全部溶解后，在140℃条件下氮气保护搅拌反应，体系受热后，最初为深棕黄色，30min后转为蓝绿色，1h后最终转变为深蓝色，并保持不变，继续加热1.5h，而后降温至80℃，加入50mL去离子水，继续搅拌反应1h，停止加热，将反应后的溶液离心纯化，弃去上清液，产物用去离子水洗涤分散，重复这一洗涤过程三次，最终得到纯化产物，为深蓝色W18O49颗粒粉末，TEM可见其平均粒径为4.9nm。
(2)所制备的氧化钨纳米材料分散在生理盐水中，和靶向官能团Foxp3单抗结合，制备靶向纳米材料。Foxp3单抗可以靶向到肿瘤内Tregs细胞表面高表达的Foxp3，从而将复合WOAA纳米颗粒靶向高效的结合到Tregs。
(3)，建立相应的小鼠肿瘤模型，将上述靶向WOAA纳米颗粒和进尾静脉注射或者瘤内原位注射后，采用1064nm的激光器波长，照射肿瘤，检测经不同激光照射时间，次数，强度，并测定其抗肿瘤效果。
实施例3
1)、称取WCl6 200mg，在氮气保护条件下，溶解在50mL乙二醇中，室温下搅拌溶解，得到金黄色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物300mg，搅拌至全部溶解后，在140℃条件下氮气保护搅拌反应，体系受热后，最初为深棕黄色，30min后转为蓝绿色，1h后最终转变为深蓝色，并保持不变，继续加热1.5h，而后降温至80℃，加入50mL去离子水，继续搅拌反应1h，停止加热，将反应后的溶液离心纯化，弃去上清液，产物用去离子水洗涤分散，重复这一洗涤过程三次，最终得到纯化产物，为深蓝色W18O49颗粒粉末，TEM可见其平均粒径为4.9nm。
(2)所制备的氧化钨纳米材料分散在生理盐水中，和靶向官能团CD25单抗结合，制备靶向纳米材料。CD25单抗可以靶向到肿瘤内Tregs细胞表面高表达的CD25，从而将复合WOAA纳米颗粒靶向高效的结合到Tregs。
(3)，建立相应的小鼠肿瘤模型，将上述靶向WOAA纳米颗粒和进尾静脉注射或者瘤内原位注射后，采用1064nm的激光器波长，照射肿瘤，检测经不同激光照射时间，次数，强度，并测定其抗肿瘤效果。
实施例4
(1)5ml,0.2M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入到5ml，0.5mM的HAuCl4溶液中，搅拌溶解后，加入0.6ml，1.0mM的硼氢化钠反应，得到蓝色溶液。
(2)取0.912g CTAB和0.08g水杨酸钠，溶解于25ml蒸馏水中，溶解完全后，加入0.5ml，4mM的硝酸银，水浴30℃静置15min左右，再加入25ml，1mM的HAuCl4和0.2ml浓盐酸，温和搅拌15min后，加入300微升0.1M的抗坏血酸，得到无色溶液。最后加入80微升步骤1所得的蓝色溶液，反应12h～24h后，终止反应，8500rpm离心、蒸馏水洗涤三次。获得金纳米棒，其长径比为4。测量紫外吸收光谱，得到的吸收峰在～523nm有一小峰，在800～900处有一大吸收峰。
(3)所制备的金棒纳米材料分散在生理盐水中，和靶向官能团CD25单抗结合，制备靶向纳米材料。CD25单抗可以靶向到肿瘤内Tregs细胞表面高表达的CD25，从而将复合金棒纳米颗粒靶向高效的结合到Tregs。
(3)，建立相应的小鼠肿瘤模型，将上述靶向金棒纳米颗粒和进尾静脉注射或者瘤内原位注射后，采用808nm的激光器波长，照射肿瘤，检测经不同激光照射时间，次数，强度，并测定其抗肿瘤效果。

Claims (9)

1.一种靶向热消除调节性T细胞的光热转换纳米颗粒，其特征是所述纳米颗粒表面设有接枝有长循环的亲水性官能团以及靶向调节性T细胞的官能团，其粒径在2-100纳米之间；所述的纳米颗粒，包括非化学计量比的氧化钨纳米颗粒或者金纳米颗粒；其中非化学计量比的氧化钨纳米颗粒，其分子式为WOx，2<X<3；氧化钨纳米颗粒的粒径在2-100纳米之间；其形状为球形或棒状、长径比大于1且小于20；所述的靶向纳米颗粒为金纳米颗粒时，其粒径在1-200纳米之间，形状为球形，三角形或棒状结构中一种或多种；棒状结构的纳米颗粒的长径比大于1小于20；所述的纳米颗粒，在可见-近红外区即500-2000nm波长范围内具有强的光吸收能力，产生光热转化。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征是所述的纳米颗粒表面靶向调节性T细胞的官能团包括，CD39单抗、CD25单抗、CTLA-4单抗或者Foxp3单抗中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征是所述的纳米颗粒，其表面接枝有长循环的亲水性官能团是指长循环层为聚乙二醇(PEG)，聚丙烯酸(PAA)，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征是所述的纳米颗粒表面长循环层的亲水性官能团，PEG的分子量为500-20000Da；聚丙烯酸分子量为1000-10000Da，聚乙烯基吡咯烷酮分子量为2000-20000Da。
5.根据权利要求1-4之一所述的纳米颗粒的制备方法，其特征是纳米颗粒的纳米内核为氧化钨时，以WCl6在氮气保护条件下，溶解在乙二醇中，室温下搅拌溶解，得到金黄色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物，搅拌至全部溶解后，在140±15℃条件下氮气保护搅拌反应，体系受热后，最初为深棕黄色，最终转变为深蓝色，继续加热1.5h，而后降温至80℃，加入50mL去离子水，继续搅拌反应1h，停止加热，将反应后的溶液离心纯化，弃去上清液，产物用去离子水洗涤分散，重复这一洗涤过程三次，最终得到纯化产物，为深蓝色颗粒粉末；所制备的带聚丙烯酸聚合物的氧化钨W18O49纳米材料分散在生理盐水中，和靶向官能团结合，制备靶向纳米材料。WCl6与聚丙烯酸聚合物的质量比为1:0.9-1.6。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒的制备方法，其特征是钨蓝纳米粒子的合成，首先称取WCl6 600mg，PAA 200mg加入50mL一缩二乙二醇当中，N2保护条件下在60℃条件下搅拌反应30min直至全部溶解，所得溶液为金黄色。而后将该分散液直接加入预热至180℃的油浴当中，反应30min后停止加热，将所得溶液自然冷却至室温，向体系中加入50mL去离子水，静置约30min后，9000rpm×10min离心收集所得蓝色沉淀后去离子水洗涤三遍，去除未反应的PAA和WCl6，所得产物放置于4℃冰箱中待用。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒的制备方法，其特征是钨蓝纳米粒子的靶向性修饰，将100mg新制的钨蓝纳米颗粒分散在20mL去离子水当中(4℃)搅拌均匀后，加入150mg EDC和90mg sulfo-NHS，磁力搅拌条件下反应1.5小时，而后将所得溶液离心纯化后去离子水洗涤三次，去除EDC和sulfo-NHS反应后的副产物，所得纳米颗粒重新分散在50mL预冷至4℃的PBS溶液当中。在冰浴条件下加入30μL CD39单抗(1mg/mL，兔抗小鼠CD39多抗，Lot#ab128666,Abcam)反应5h。离心收集表面修饰的钨蓝纳米粒子后用PBS洗涤三次，将所得的纳米粒子分散在PBS当中，保存在4℃冰箱中待用(W18O49anti-CD39 antibody，简记为WOAA纳米粒子)。
8.根据权利要求1-4之一所述的纳米颗粒的制备方法，其特征是纳米颗粒的纳米内核为金纳米颗粒时的制备方法：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入HAuCl4溶液中，搅拌溶解后，加入的硼氢化钠反应，得到蓝色溶液；取CTAB和0.08g水杨酸钠，溶解于25ml蒸馏水中，溶解完全后，加入0.5ml、4mM的硝酸银，水浴30℃静置15min左右，再加入25ml，1mM的HAuCl4和0.2ml浓盐酸，温和搅拌15min后，加入300微升0.1M的抗坏血酸，得到无色溶液。最后加入80微升步骤1所得的蓝色溶液，反应12h～24h后，终止反应，8500rpm离心、蒸馏水洗涤三次。获得金纳米棒，其长径比为4；所制备的金纳米棒分散在生理盐水中，和靶向官能团结合，制备靶向纳米材料。
9.权利要求1-8之一得到的光热转换靶向热消除调节性T细胞的纳米颗粒在制备联合光热治疗与免疫治疗的药物中的应用。
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