CN106243196B - 一种检测血浆pou5f1天然抗体的氨基酸序列及应用 - Google Patents

一种检测血浆pou5f1天然抗体的氨基酸序列及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测POU5F1天然抗体的氨基酸序列及应用，检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序如下所示：H‑HFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN‑OHH‑ALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLH‑OH纯度>95％,pH>7.0。上述免疫标志物POU5F1天然抗体能够在探讨肿瘤风险预测及临床防治肿瘤中应用。有益效果：能够用于定性、定量检测相应的天然抗体。有望达到预测肿瘤发生风险的目的，且为肿瘤新药研究与开发提供可靠数据。

Description

一种检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序列及应用
技术领域
本发明涉及一种天然抗体的氨基酸序列及应用，特别涉及一种检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序列及应用。
背景技术
当前,相关的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。例如，由英国诺丁汉Oncimmune有限公司推出的Early CDTTM-Lung诊断试剂盒已在北美和欧洲应用于临床早期诊断肺癌近6年。然而，目前所报道的抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达60％以上。其主要原因在于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在患者血中的阳性检测率平均在5-15％之间，即便是多种抗原混合而产生叠加信号，阳性检测率也难以突破50％。近年来有关天然抗体研究显示，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要有B1淋巴细胞产生，不需要特异性抗原刺激。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,并且充当固有免疫和特异免疫两个系统之间的桥梁。特别值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞。因此，维持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推测，天然抗体缺乏者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。
发明内容
本发明的目的是为了更好地定性、定量检测相应人体内的天然抗体而提供的一种检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序列及应用。
本发明提供的检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序如下所示：
H-HFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN-OH
H-ALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLH-OH
纯度>95％,pH>7.0。
上述两条抗原多肽在POU5F1分子序列上的位置用斜体标示如下：
上述POU5F1天然抗体能够在探讨肿瘤风险预测及临床防治肿瘤中应用。
上述两条多肽抗原在ELISA法检测血浆POU5F1天然抗体应用中的具体操作方法如下：
步骤一、操作前，每种抗原用65％-70％乙酸溶解为5毫克/毫升储存液,然后等体积混合并放置-20℃冰箱中保存，误差2℃以内；
步骤二、操作开始时，首先将步骤一中所列两种多肽抗原的等比混合液用包被液稀释为10-50微克/毫升，该包被液为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，酸碱度pH为7.0-7.4之间；
步骤三、然后包被马来酰亚胺活化的96孔检测板，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，酸碱度pH为7.0-7.4之间。
步骤四、分步加样分析如下：
(1)待测血浆样本设双复孔，先设2个阴性对照孔NC，即参照物为不含血浆POU5F1抗体的阴性对照液，藉此反映两种多肽抗原在POU5F1天然抗体阴性环境下的实验指标值，再设2个阳性对照孔PC，即参照物为含POU5F1抗体标准品的阳性对照液，藉此反映两种多肽抗原在POU5F1抗体标准品基准含量水平上的实验指标值；
(2)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，酸碱度p)为7.0-7.4之间，每孔加100μl,25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍；
(3)用所述分析液按照上述步骤操作后，即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，酸碱度为7.0～7.4之间，稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，用以验证血桨中被检测的物质是否是特异性抗体，抗体工作范围为1:10000-1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小时；
(4)以前述洗液，即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，酸碱度PH值为7.0-7.4之间，洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺及过氧化物酶混合液，室温避光20-30分钟；
(5)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液，然后用酶标仪检测光密度值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，检测过程在加入终止液后10分钟内完成，据此可定量分析个体血浆POU5F1天然抗体水平。
本发明的有益效果：
本发明通过自行设计的POU5F1抗原表位多肽，检测肿瘤患者血清或血浆中其天然抗体水平，并优化相应的抗体检测条件，对POU5F1蛋白上的多个表位序列进行免疫信息学预测和模拟，分析与抗原特性相关的各种参数，设计两条抗原在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性多肽氨基酸序列。能够用于定性、定量检测相应的天然抗体。有望达到预测肿瘤发生风险的目的，且为肿瘤新药研究与开发提供可靠数据。
具体实施方式
1.样本收集：收集132份肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者血浆样品(包括111例男性和21例女性,平均年龄54.9±9.9岁)及231例健康人血浆样品(包括184例男性和47例女性,平均年龄55.2±10.9岁)用于检测血浆POU5F1天然抗体水平。操作前所有血浆样品均在负80度(-80℃)条件下保存，经核实保存时间未超过两年，没有反复冻融(冻融次数不超过3次)的血浆样品。
2.样本检测：在4℃环境下解冻血浆样品，本实验所采用的两条肽多抗原由英国SEVERN BIOTECH有限公司合成，纯度为95％，具体操作按如下步骤进行：
(1)操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5mg/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃冰箱中保存。
(2)操作开始时，首先将两种抗原混合液用包被液稀释为33μg/ml，该包被液为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，测得酸碱度(pH值)为7.2。
(3)然后包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜16.5小时孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，测得酸碱度pH值为7.2。
(4)然后分步加样分析如下：
a)待测血浆样本设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为Sigma-Aldrich公司提供的不含人血浆POU5F1抗体的阴性对照液)和2个阳性对照孔(PC，参照物同样为Sigma-Aldrich公司提供的人血浆POU5F1抗体标准品阳性对照液)。
b)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，测得酸碱度(pH)为7.2，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
c)以前述洗液(即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，测得酸碱度为7.2)洗板3遍后，用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体工作浓度为1:30000，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
d)以前述洗液(即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，测酸碱度PH值为7.2之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(由Life Technologies公司提供)，室温避光25分钟。
e)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H2SO4，)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤将依据此结果针对每一个体进行POU5F1天然抗体的定量对比分析。
3.数据分析：
对前述检测所得数据进行分析时，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中POU5F1天然抗体水平，PSR计算公式为：PSR＝[ODPOU5F1值–ODNC值]/[ODPC值–ODNC值]，NC为各样本的阴性对照。应用接收者操作特征(receiver operatingcharacteristic,ROC)曲线图分析数据。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式确定分界值或决定阈，即以病人血浆样品的真阳性率(灵敏度)为纵坐标，以健康人血浆样品的假阳性率(1-特异性)为横坐标绘制曲线。ROC曲线下的面积(AUC)值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算AUC值，判定灵敏度和特异性；经过秩和(Z)检验，获得一类错误水准为a＝0.05的P值。
如表1所示，肝癌患者血浆中POU5F1天然抗体IgG水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.6，灵敏度为16.5％，特异性为90.2％,其中女性肝癌患者血浆中POU5F1天然抗体IgG水平变化比男性肝癌患者显著,ROC曲线下面积为0.73，灵敏度为28.6％，特异性为91.5％。
表1.ROC曲线分析肝癌患者血浆中POU5F1天然抗体IgG水平结果
1SE:标准误差；295％CI:95％可信区间
如表2所示，秩和检验证实肝癌患者血浆中POU5F1天然抗体IgG水平明显低于健康组(Z＝-3.07，P＝0.002)。
表2.肝癌患者血浆中POU5F1天然抗体IgG水平变化结果
上述实验结果表明，血浆中POU5F1天然抗体水平较低或阴性个体可能具有较高的肝癌发病风险。因此，检测血浆中POU5F1天然抗体水平具有预测肝癌发病风险和早期诊断肝癌的重要价值。

Claims (2)

1.一种检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序列，其特征在于：所述的氨基酸序如下所示：
H-HFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN-OH
H-ALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLH-OH
纯度>95％,pH>7.0。
2.根据权利要求1所述的一种检测血浆POU5F1天然抗体的氨基酸序列，其特征在于：所述的两条多肽抗原在ELISA法检测血浆POU5F1天然抗体应用中的具体操作方法如下：
步骤一、操作前，每种抗原用65％-70％乙酸溶解为5毫克/毫升储存液,然后等体积混合并放置-20℃冰箱中保存，误差2℃以内；
步骤二、操作开始时，首先将步骤一中所列两种多肽抗原的等比混合液用包被液稀释为10-50微克/毫升，该包被液为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，酸碱度pH为7.0-7.4之间；
步骤三、然后包被马来酰亚胺活化的96孔检测板，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，酸碱度pH为7.0-7.4之间；
步骤四、分步加样分析如下：
(1)待测血浆样本设双复孔，先设2个阴性对照孔NC，即参照物为不含血浆POU5F1抗体的阴性对照液，藉此反映两种多肽抗原在POU5F1天然抗体阴性环境下的实验指标值，再设2个阳性对照孔PC，即参照物为含POU5F1抗体标准品的阳性对照液，藉此反映两种多肽抗原在POU5F1抗体标准品基准含量水平上的实验指标值；
(2)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mM EDTA，酸碱度p)为7.0-7.4之间，每孔加100μl,25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍；
(3)用所述分析液按照上述步骤操作后，即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和10mMEDTA，酸碱度为7.0～7.4之间，稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，用以验证血桨中被检测的物质是否是特异性抗体，抗体工作范围为1:10000-1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小时；
(4)以前述洗液，即0.1M磷酸盐缓冲液含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20，酸碱度PH值为7.0-7.4之间，洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺及过氧化物酶混合液，室温避光20-30分钟；
(5)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液，然后用酶标仪检测光密度值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，检测过程在加入终止液后10分钟内完成，据此可定量分析个体血浆POU5F1天然抗体水平。
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