CN106232102A - 局部组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明人已经观察到水性芥菜籽提取物似乎对成纤维细胞具有细胞毒性。当将提取物在120℃下热处理15分钟时，含水芥菜籽提取物的细胞毒性似乎减轻。热处理的含水芥菜籽提取物当与外源黑芥子酶组合时无细胞毒性，但可以诱导培养的成纤维细胞中的HO‑1含量的适度增加，因此预期在用于治疗/预防瘙痒皮肤、特别是头皮的局部组合物中是有用的。本发明因此涉及提供用于治疗/预防瘙痒皮肤、特别是头皮的局部组合物。

Description

局部组合物
本发明涉及提供用于治疗/预防瘙痒皮肤、特别是头皮的局部组合物。
Gems等人(Mechanisms of Ageing and Development, 126, 381-387 (2005))描述了老化的绿色理论，其中建议从代谢的随机误差累积亲脂性毒性副产物(因此不能被细胞识别)，导致分子损伤和老化。Gems等人进一步描述了平滑内质网(真核细胞器)如何充当细胞过滤器，部署1期和2期代谢以移动和排泄亲脂性毒素。1期代谢导致化学反应性官能团的添加，其允许另外的未反应的亲脂性化合物的进一步代谢。2期代谢涉及添加增加溶解性辅助排泄的侧基。细胞色素P450和短链脱氢酶或还原酶是哺乳动物细胞中的1期代谢剂。尿苷5'-二磷酸-葡糖醛酸基转移酶(也称为UDP-葡糖醛酸基转移酶或UGT)，是催化糖基从尿苷-5'-三磷酸(UTP)-糖添加至小疏水分子(称为葡萄糖醛酸化反应)的糖基转移酶，是重要的2期代谢剂。
根据Zhang Y (Phase II Enzymes, 于Schwab M. (编) Encyclopedia ofCancer:SpringerReference, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2009)，2期酶原则上是细胞生物转化机制的一部分。异生素和内生素的细胞生物转化可分为两个连续期：1期(氧化、还原和水解反应)和2期(缀合反应)。2期酶传统上是指催化缀合反应的酶，诸如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)、N-乙酰转移酶(NAT)和磺基转移酶(SULT)。然而，该术语在范围上逐渐变得更宽，并且现在用于指多种催化1期反应的酶，诸如血红素加氧酶-1(HO-1)。这种不确定分类的原因在于，这些酶中的许多由各种化学剂通过Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1) - 核因子红细胞2相关因子2(Nrf2) - 抗氧化反应元件(ARE)信号传导途径协同诱导，并且它们中的所有都在细胞保护中发挥重要作用。
2期酶是主要的解毒酶和针对氧化剂和其它毒性化学品的细胞防御的重要部分。
尽管每个单独的2期基因可能通过多种机制进行调节，但其为许多2期基因共有的Keap1-Nrf2-ARE信号传导系统。Nrf2，核因子红细胞2相关因子2，是通常由其抑制剂Keap1螯合的转录因子。与Keap1的结合促进Nrf2的蛋白酶体降解。Nrf2从Keap1的解离允许前者与伴侣异源二聚化，结合顺式作用DNA调节元件，并促进下游基因的转录。Nrf2异源二聚体结合并活化的DNA调节元件被称为抗氧化反应元件(ARE)。已知一个或多个拷贝的典型ARE序列存在于2期基因(包括HO-1)的5'-侧翼区域。
Matsushima等人(Inflamm. Res. 58, 705-715 (2009))报道了肥大细胞在过敏性炎症反应中发挥重要作用。已显示槲皮素抑制肥大细胞脱粒和随后的组胺释放。观察到短暂暴露于槲皮素后上调血红素加氧酶活性，随后长期暴露于槲皮素后诱导HO-1表达。使用锡原卟啉IX (SnPP)(HO-1抑制剂)逆转槲皮素脱粒的抑制。在大鼠嗜碱性白血病(RBL-2H3)细胞中观察到槲皮素将Nrf2从细胞质转移至核中。这些结果强烈地表明槲皮素经由Nrf2-HO-1途径发挥抗过敏作用。
Kerr等人(Acta Derm Venereol, 91, 404-408 (2011))报道了，在皮肤中，组胺由驻留于真皮中的肥大细胞以及角质形成细胞自身合成。组胺众所周知为在过敏性炎症和免疫应答中发挥重要作用的化学介质，并且其在瘙痒中的作用已经在荨麻疹反应、毒藤和昆虫叮咬中特别良好地建立。然而，对于由更复杂的病理生理学机制引起的皮肤病症(诸如特应性皮炎)，组胺和瘙痒之间的关联并未决定性地确定。尽管如此，增加的组胺水平已经与范围为普通干皮肤到银屑病的皮肤病症中的瘙痒相关。观察到，具有头皮屑的受试者中的组胺水平是没有头皮屑的受试者中的组胺水平的超过两倍。在已知解决剥落症状的条件下，吡啶硫酮锌(zinc pyrithione)洗发剂导致具有头皮屑的受试者中的组胺减少至与没有头皮屑的患者统计学上不可区分的水平。这种组胺减少伴随着瘙痒强度的感觉的非常显著的降低。这些发现表明，头皮瘙痒的主观感觉和皮肤中的组胺水平之间的关联。
根据Fahey等人(Phytochemistry, 56, 5-51 (2001))，十字花科的植物含有称为芥子油苷的有机化合物。芥子油苷是水溶性阴离子，且属于葡萄糖苷类。每个芥子油苷含有中心碳原子，其经由硫原子结合硫葡萄糖基团(形成硫酸化醛肟)，并经由氮原子结合硫酸酯基团。此外，中心碳结合侧基；不同的芥子油苷具有不同的侧基，并且侧基的变化负责这些植物化合物的生物活性的变化。芥子油苷黑芥子苷(2-丙烯基或烯丙基芥子油苷)和白芥子硫苷(4-羟基苄基芥子油苷)可分别分离自黑色(黑色芸苔属植物(Brassica negra))和白色(白芥子)芥菜籽。
具体而言，且根据Halkier等人(Annu. Rev. Plant Biol., 57, 303-333(2006))，存在约120种所述芥子油苷，其共享由以下组成的化学结构：经由硫原子连接至(Z)-N-肟基硫酸酯的β-D-吡喃葡萄糖残基，加上衍生自八个氨基酸之一的可变R基团。芥子油苷可以通过其前体氨基酸和对R基团的修饰类型来分类。衍生自Ala、Leu、Ile、Met或Val的化合物被称为脂肪族芥子油苷，衍生自Phe或Tyr的那些被称为芳香族芥子油苷，衍生自Trp的那些被称为吲哚芥子油苷。大多数芥子油苷的R基团从这些前体氨基酸被广泛修饰。
累积芥子油苷的植物总是具有被称为黑芥子酶的硫葡糖苷活性，其水解主骨架上的葡萄糖部分。产物是葡萄糖和不稳定的糖苷配基，其可以重排以形成异硫氰酸酯、腈和其它产物。完整植物中的水解似乎受芥子油苷和黑芥子酶的空间分离或黑芥子酶的失活的阻碍，但这些组分在组织损伤后混合在一起，导致芥子油苷水解产物的快速形成。芥子油苷的大多数生物活性归因于其水解产物的作用。根据侧链的结构和额外蛋白和辅因子的存在，糖苷配基然后重排以形成不同的产物，包括异硫氰酸酯类、噁唑烷-2-硫酮类、腈类、环硫腈类和硫氰酸酯类。
许多物种中最常见的芥子油苷水解产物是异硫氰酸酯类，其由糖苷配基通过涉及侧链从肟碳迁移至相邻氮的Lossen重排而形成。当芥子油苷侧链在C-2携带羟基时，形成的异硫氰酸酯类是不稳定的并环化成噁唑烷-2-硫酮类。在Gil等人(Phytochemistry, 19,2547-2551 (1980))描述的研究中，在包含从商业芥菜粉制备的活性芥子油苷葡萄糖水解酶提取物和两种芥子油苷烯丙基芥子油苷和2-苯乙基芥子油苷的模型系统中，在pH > 3有利于在体外形成腈类。
MacLeod等人(Phytochemistry, 24, 9, 1895-1898 (1985))描述了关于芥子油苷的研究，所述芥子油苷在其侧链中具有末端不饱和度，已知其水解成氰基环硫烷烃类。具体而言，该研究涉及在欧洲油菜的两种栽培品种油菜(Brassica campestris)和水芹(Lepidium sativum)的籽中测定环硫指定蛋白(epithiospecifier protein)(ESP)活性。所有四种类型的籽含有ESP的敏感底物(即，在它们的侧链中具有末端不饱和度的芥子油苷类)，尽管水芹(Lepidium sativum)仅含有非常少量的敏感底物。在ESP存在的情况下，硫葡糖苷葡萄糖水解酶能够将适当的敏感芥子油苷转化为相应的氰基环硫烷烃，但在其不存在的情况下不形成，并且仅获得“正常”产物诸如异硫氰酸酯类和腈类。ESP本身没有活性。因此其为酶辅因子。看起来，ESP仅在其中绝对没有具有末端不饱和度的芥子油苷的系统中不存在，并且仅非常少量的敏感芥子油苷的存在足以存在可感知的ESP活性。
此外，在添加相对小浓度的亚铁离子后，观察到水解产物的相对比例的主要变化。在所有情况下，Fe2+以5-乙烯基噁唑烷-2-硫酮为代价引起1-氰基-2-羟基-3,4-环硫丁烷的相对量的相当大的增加。亚铁离子还促进“正常”腈(即1-氰基-2-羟基丁-3-烯，而不是环硫腈)的产生。显著地，少量添加的Fe2+足以使主要产物分布完全逆转。因此，仅6 x 10-11 molFe2+的添加足以改变2-羟基丁-3-烯基芥子油苷的局部水解，以得到1-氰基-2-羟基-3,4-环硫丁烷(约55％)作为主要产物，而不是5-乙烯基噁唑烷-2-硫酮(在不添加Fe2+的情况下约54％)。
Halkier等人(Annu. Rev. Plant Biol., 57, 303-333 (2006)进一步解释了其它水解产物包括仅由三种芥子油苷(苄基-、烯丙基-和4-甲基亚硫酰基丁基-芥子油苷，其中所有都形成稳定的侧链阳离子)形成的硫氰酸酯类。吲哚芥子油苷类的水解与其它芥子油苷类型的水解有些不同，因为最初形成的异硫氰酸酯类在中性或微酸性pH下是不稳定的，并且转化为其它代谢物，包括吲哚-甲醇类、抗坏血酸共轭物和寡聚混合物。
Bones等人(Phytochemistry, 67, 1053-67 (2006))报道了，认为硫氰酸酯类由可产生稳定碳阳离子的芥子油苷产生，诸如苄基-、丙烯基-和4-甲基硫代丁基-芥子油苷。已观察到通过T. arvense L.籽粉将黑芥子苷(2-丙烯基芥子油苷)糖苷配基转化为硫氰酸烯丙酯(3-硫氰基丙-1-烯)。因此，似乎硫氰酸酯形成需要至少两种酶，黑芥子酶和硫氰酸酯形成因子。据报道，补充有抗坏血酸盐的来自水芹(Lepidium sativum)的籽粉末活化硫氰酸酯形成因子。
Shikita等人(Biochem. J. 341, 725-32 (1999))公开了大多数植物黑芥子酶的令人感兴趣和令人费解的特征在于它们被抗坏血酸以及几种密切的结构亲缘物强烈活化，但不被其氧化产物脱氢抗坏血酸强烈活化。在抗坏血酸不存在的情况下来自长羽裂萝卜(Raphanus sativus var. longipinnatus)(daikon)的黑芥子酶在pH 6.0下对黑芥子苷的水解中，纯化的酶仅非常缓慢地水解黑芥子苷。在抗坏血酸存在的情况下，酶促活性大大增强。然而，大于500μM的抗坏血酸浓度在150μM黑芥子苷下抑制酶，与0.75和1.0mM抗坏血酸的反应速度为与500μM抗坏血酸的反应速度的90％和73％。Shikita等人还观察到以黑芥子苷作为底物的黑芥子酶反应的产物(即硫酸酯、葡萄糖和异硫氰酸烯丙酯)中，硫酸酯相对于黑芥子苷和抗坏血酸盐竞争性地抑制活性。葡萄糖相对于黑芥子苷仅是非常弱的抑制剂，并且异硫氰酸烯丙酯在高达1mM的浓度下不显著抑制活性。
Shikita等人还报道了大多数植物黑芥子酶在一定程度上被抗坏血酸盐活化。已知0.7-5.0 mM的抗坏血酸盐浓度范围最大活化六种十字花科植物的部分纯化提取物中的黑芥子酶。来自白柳(Salix alba)(白柳)的酶在不存在抗坏血酸盐的情况下保持显著的活性，并且仅被活化约2-3倍，而来自几种其它芸苔属物种的酶显示被抗坏血酸盐的8-12倍活化。
US 2008/0311192 (Kraft Foods Holdings)公开了包含肠溶包衣的芥子油苷和β-硫葡糖苷酶颗粒的颗粒组合物。还公开了在小肠中将芥子油苷转化为异硫氰酸酯的方法，其包括向受试者口服施用包含肠溶包衣的芥子油苷和β-硫葡糖苷酶颗粒的肠溶包衣的化学保护剂前体组合物。未包衣的芥子油苷和β-硫葡糖苷酶颗粒可以在肠溶包衣胶囊中提供。优选地，芥子油苷是萝卜硫苷(glucoraphanin)，且β-硫葡糖苷酶是黑芥子酶。肠溶包衣靶向化合物用于在小肠中释放，在小肠中β-芥子油苷酶将芥子油苷转化为化学保护剂异硫氰酸酯。在实施例1中，从乳糖、微晶纤维素和白芥菜籽提取物制备黑芥子酶颗粒。从乳糖、微晶纤维素和芥子油苷制备芥子油苷颗粒。然后用虫胶包衣颗粒。
GB 935 629 B (Unstead-Joss等人)公开了制备用于外部使用的稳定芥菜发红剂的方法，其中活性成分防止腐烂，使得使用者能够储存制备好的发红剂或其它芥菜制剂用于偶尔使用。该方法由以下组成：将芥菜粉与水或其它含水(例如，软膏)型基质混合，并且在特定时间间隔(其期间允许芥菜的天然酶起作用，释放活性成分)之后，添加防腐剂。如果添加酚类性质的化合物，防腐作用是最有效的。
GB 2 443 036 B (Engelhard-Lyon)公开了使用活性成分预防、限制或改善真皮的质量，特别是当后者受年龄影响时，特别是在人中。实施例10公开了制备芥菜提取物作为活性成分。其它实施例公开了活性成分的递送系统，包括油包水乳液、洗发剂或沐浴露、唇膏、含水凝胶、三重乳液、片剂、软膏和可注射制剂。
US 2009/0247477 A1 (John Hopkins School of Medicine)公开了施用异硫氰酸酯防止UV光诱导的皮肤致癌作用。也可以采用1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷(Sulforaphane)类似物和芥子油苷。递送可以通过局部洗剂。
GB 612 555 B (Augot)描述了包含亚麻子油和芥菜粉的混合物的芥菜膏的制备。
Lee等人(Food Sci.Biotechnol., 18, 5, 1071-1075 (2009))描述了关于对异硫氰酸烯丙酯(一种已知、但挥发性的抗微生物剂)用改性淀粉微胶囊化对延迟释放时间的影响的研究。芥菜粉用作异硫氰酸烯丙酯的来源。
US 2006/0127996 (John Hopkins University)公开了从含有芥子油苷的植物将异硫氰酸酯类提取至油中的方法，以及制备含有从含有芥子油苷的植物提取的异硫氰酸酯油的产品的方法，所述产品包括药物组合物、食品或饮料产品、补充剂或添加剂、皮肤或毛发产品和农产品。异硫氰酸酯当在水相中时可与蛋白反应，因此在转移至油相后稳定。提取的异硫氰酸酯油的组合的稳定性和非含水性质扩大了用于不同类型应用的潜能。
US 2012/0052175 A1 (Ekanayake等人)公开了产生精油的方法。所述精油可以是白芥菜精油。白芥子精油可以包括湿气敏感的异硫氰酸酯化合物。湿气敏感的异硫氰酸酯化合物可以是异硫氰酸4-羟基苄基酯(4-HBITC)。所述精油可以由芥菜籽产生，所述芥菜籽可以包含前体白芥子硫苷和黑芥子酶。芥菜籽可以被减小成粉末。可以进行通过使用水溶剂和促进剂来活化黑芥子酶以形成浆料，其中黑芥子酶催化从白芥子硫苷前体产生包含异硫氰酸酯的精油。
US 4 062 979 (McCormick & Company)公开了通过混合单独制备的芥菜粉获得的刺激性受控的芥菜粉。制备第一芥菜粉，其中酶被失活，但保留葡萄糖苷，而在第二芥菜粉中，酶得到保留，但基本上消除了葡萄糖苷。两种芥菜粉单独地味道温和，但是当与水共混和混合时，一者中的酶将裂解另一者中的葡萄糖苷，产生刺激性味油。因此，芥菜产品的温和性对刺激性的程度可以通过共混两种粉状物来预先确定。两种芥菜粉由脱壳或不脱壳且新鲜或老化的芥菜籽产生，与水混合以产生浆料，将其湿磨并喷雾干燥以产生芥菜粉。当使用热水来产生浆料时，酶被失活，并且粉状物含有特征性的葡萄糖苷。当冷水用于产生浆料时，酶裂解葡萄糖苷并产生刺激性挥发性油，所述刺激性挥发性油在喷雾干燥步骤中被驱除，但酶在芥菜粉状物中存活。
US 4 496 598 (Sakai等人)公开了产生改进的芥菜籽粉的方法，其中将芥菜籽脱油，在使籽中的黑芥子酶失活的条件下进行加热以降低刺激性，随后研磨以形成刺激性降低、风味良好、蛋白含量增强和保存性增强的粉状物。芥菜的刺激性是活性酶黑芥子酶的结果，所述黑芥子酶通过向芥菜中添加水而产生。黑芥子酶水解以形成糖苷黑芥子苷和异硫氰酸烯丙酯。
FR 2 778 095 A1 (Cretoux)公开了密封小袋，其包含不可渗透面和可渗透面，并且含有糊剂。小袋用于人或动物的治疗或美容用途。糊剂可以包含芥菜粉和水。
WO 2012/037193 (Brassica Protection Products LLC)公开了包含I期酶诱导物前体和活化剂的局部制剂。皮肤疾病影响全世界数百万人，并且花费数十亿美元的治疗成本。UV和太阳辐射也可以引发炎症并抑制免疫应答。这样的损伤的作用包括改变皮肤的弹性和含量，加速皮肤的老化(dermatobeliosis)，并引起凸起的、微红的、粗糙纹理的生长(角化病)。在一些情况下，太多日照导致皮肤细胞发育成肿瘤生长，其然后可以变成皮肤癌。对抗癌症的一种策略是通过它们的诱导物引发II期酶的活性。诱导物包括单官能诱导物，诸如二酚、硫代氨基甲酸酯、1,2-二硫醇-3-硫酮类和异硫氰酸酯类。异硫氰酸酯类存在于各种植物中，包括来自芸苔属植物(Brassicae)家族的那些，包括青花菜(broccoli)、花椰菜(cauliflower)、羽衣甘蓝(kale)、抱子甘蓝(brussel sprouts)、芝麻菜(arugula)、卷心菜(cabbage)、大白菜(Chinese cabbage)、芥蓝(collards)、海甘蓝(crambe)、萝卜(daikon)、甘蓝(kohlrabi)、芥菜(mustard)、红萝卜(red radish)、芜菁(turnip)和水田芥(watercress)。异硫氰酸酯类通常当其前体芥子油苷类被酶黑芥子酶(β-硫葡糖苷葡糖水解酶)水解时产生。在所述植物中，芥子油苷和黑芥子酶保持分开。这可能是为了防止芥子油苷类过早水解为异硫氰酸酯类。期望包含分离形式的芥子油苷和黑芥子酶的制剂来治疗和预防皮肤疾病以及其它癌性状况。
WO 2012/116018 (Caudill Seed Company Inc)公开了从包括以下的步骤形成喷雾干燥的黑芥子酶/抗坏血酸盐混合物：提供黑芥子酶源，向黑芥子酶源添加抗坏血酸盐以产生混合物，在溶剂中将混合物加热至约40摄氏度或更高的温度，和喷雾干燥黑芥子酶/抗坏血酸盐混合物。芥子油苷类可以由酶黑芥子酶催化转化为异硫氰酸酯类。芥子油苷和黑芥子酶都可以存在于许多十字花科植物中，并且在芽和籽中的浓度通常高于植物的其余部分中。众所周知的异硫氰酸酯是1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷，其为通过诱导2期酶活性的哺乳动物解毒和化学保护的有效诱导物，已知其保护细胞免于致癌物质的毒性和肿瘤性影响。萝卜硫苷，芥子油苷，是1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的前体。环硫指定蛋白(epithiospecifier protein)(ESP)降低来自萝卜硫苷的1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的产率，所述环硫指定蛋白(epithiospecifier protein)(ESP)也存在于具有黑芥子酶的十字花科植物中。ESP催化1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷腈的形成；该替代反应途径与产生1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷腈的反应途径竞争。一种使ESP失活的方法是通过加热。实施例1描述了研磨含有黑芥子酶的青花菜(broccoli)籽，在35摄氏度添加水并加热至74-79摄氏度并保持5分钟。然后添加抗坏血酸钙，并将混合物在37摄氏度下孵育24小时。然后将混合物喷雾干燥。在实施例2中，将含有萝卜硫苷的青花菜籽在132摄氏度下冲击(rush)，并在超临界二氧化碳中脱脂。然后添加实施例1的黑芥子酶/抗坏血酸盐粉末并在37.5摄氏度下混合，然后喷雾干燥以产生1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷。
WO 2012/074412 (Comvita New Zealand Limited)公开了癌症化学保护产品，特别是含有萝卜硫苷和/或glucoraphanen化合物和黑芥子酶的来源的产品，其稳定，但在施用后为受试者提供化学保护活性。根据特定芥子油苷的结构和现有反应条件，异硫氰酸酯类和腈类通常占这些糖苷配基的大部分。来自萝卜硫苷的酶促反应的反应产物之一是1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷。最近已显示1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷腈不具有1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的抗癌作用性质。来自glucoraphanen的异硫氰酸酯被称为萝卜硫素(sulforaphene)。最近的证据表明，从芥子油苷的形成腈受热敏感蛋白环硫指定蛋白(epithiospecifier protein)(ESP)控制。实施例3报道了，与作为黑芥子酶源的青花菜籽的培养试验显示由于存在ES蛋白导致的对孵育温度的高度依赖性。较高的孵育温度表现出1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的量的增加，然而较低温度似乎将反应引向无活性的腈形成。
US 2010/0317518 (Stevens等人)公开了衍生自芥子油苷的化合物已经用作杀真菌剂、杀虫剂、抑菌剂或杀菌剂、化妆品添加剂和药妆和/或药剂(例如癌症、化学保护剂、抗衰老、抑菌、杀菌、治疗和/或预防溃疡、治疗和/或预防胃炎、治疗皮肤病症，包括但不限于湿疹、面部湿疹、皮炎、外部溃疡、风疹块、皮疹、昆虫叮咬、过敏反应和其它刺激、烧伤、伤口、银屑病、痤疮性出疹、干燥、皮肤干燥、刺激、皮肤萎缩、继发性感染等)。还公开了用于将含有芥子油苷的植物材料中的芥子油苷转化为芥子油苷降解产物(GBP)的方法，其包括：提供一定量的经加工的含有芥子油苷的植物材料，所述经加工的材料凭借所述加工耗尽油和芥子油苷转化酶活性：提供一定量的芥子油苷转化酶活性；将所述经加工的材料与所述量酶活性混合；水化所述混合物；并孵育经水化的混合物，其中所述芥子油苷被酶促转化为GBP。优选地，经加工的植物材料包含油籽来源的籽粉材料，其中已经通过加工(例如，溶剂提取和/或热处理)去除了油。在具体实施方案中，芥子油苷转化酶活性包含黑芥子酶活性和腈形成活性中的至少一种。其它方面提供了包源自含有芥子油苷的植物材料的GBP的低脂组合物(例如，除草剂、杀真菌剂、杀虫剂、抑菌剂或杀菌剂、化妆品、药妆品或药物)。
DE 10 308 298 (Kullmer)公开了用于预防/治疗癌症的来自芸苔属植物成分的草药制剂。描述了获得所述制剂的方法，其包括以下步骤：(a)提供来自含有芥子油苷的植物物种的至少一种材料，(b)使所述材料中的内源性硫葡糖苷酶失活，(c)提取所述材料中含有的芥子油苷，(d)将所述芥子油苷类酶促水解成异硫氰酸酯类。步骤(b)可以通过将材料加热至95-100摄氏度持续足够时间、通常1-420秒来实现。步骤(d)优选通过至少一种外源性硫葡糖苷酶/葡糖水解酶、优选来自萝卜(Raphanus stivus)或白芥子(Sinapis alba)的黑芥子酶来实施。
US 2003/0091518 (Cognis Corporation)公开了化妆品和/或药物制剂，其中成分萝卜硫苷和1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷在使用者中不产生任何皮肤刺激，并且将活化特定的修复和解毒酶(例如谷胱甘肽-S-转移酶)，刺激或调节细胞生长，影响成纤维细胞或角质形成细胞的代谢活性。在实施例H3中，将5.2g 3.8日龄青花菜芽的冷冻干燥的热甲醇水提取物(涉及研磨冷冻的青花菜芽，将其分散在纯水中，然后添加甲醇并回流1小时)悬浮于100g水中，并通过添加5N氢氧化钠溶液将所得悬浮液调节至pH 6。添加25 U硫葡糖苷酶(1U =在25摄氏度(pH6)下从黑芥子苷制备1μmol葡萄糖所需的酶量)和9.9 mg抗坏血酸钠，并将混合物在37℃下搅拌8小时。然后通过添加更多氢氧化钠将pH再调节至pH 6，并将悬浮液过滤并冷冻干燥。提取物的异硫氰酸酯含量为230 µmol/g。
发明概述
本发明人已经观察到含水芥菜籽提取物似乎对成纤维细胞具有细胞毒性。当将提取物在120℃下热处理15分钟时，含水芥菜籽提取物的细胞毒性似乎减轻。热处理的含水芥菜籽提取物当与外源黑芥子酶组合时无细胞毒性，但可以诱导培养的成纤维细胞中的HO-1含量的适度增加，因此预期在用于治疗/预防瘙痒皮肤、特别是头皮的局部组合物中是有用的。
因此，在本发明的第一方面，提供了局部组合物，所述局部组合物包含：
（a）经研磨的含有芥子油苷的植物材料；
（b）包含硫葡糖苷酶的酶源；
（c）水；和
（d）选自润湿剂，包括矿油的有机溶剂、硅酮、香料、有机/无机防晒剂的化合物；
其中所述含有芥子油苷的植物材料在研磨前在至少100摄氏度的温度下在大气压下热处理至少5分钟；并且其中(a)、(b)和(c)的组合仅在使用所述局部组合物时组合；
并且其中所述含有芥子油苷的植物材料选自藜木科（Bataceae），十字花科（Brassicaceae），伯乐树科（Bretschneideraceae），山柑科（Capparaceae），番木瓜科（Caricaceae），大戟科（Euphorbiaceae），环蕊科（Gyrostemonaceae），池花科（Limnanthaceae），辣木科（Moringaceae），瘤药树科（Pentadiplandraceae），商陆科（Phytolaccaceae），海桐花科（Pittosporaceae），木犀草科（Resedaceae），刺茉莉科（Salvadoraceae），烈味三叶草科（Tovariaceae），旱金莲科（Tropaeolaceae），叠珠树科（Akaniaceae），醉蝶花科（Cleomaceae），澳远志科（Emblingiaceae），刺枝树科（Koeberliniaceae），夷白花菜科（Setchellanthaceae）及其混合物，优选十字花科，最优选芥菜（Brassica juncea）种。
发明详述
在本发明的第一方面，提供了局部组合物，所述局部组合物包含：
（a）经研磨的含有芥子油苷的植物材料；
（b）包含硫葡糖苷酶的酶源；
（c）水；和
（d）选自润湿剂，包括矿油的有机溶剂、硅酮、香料、有机/无机防晒剂的化合物；
其中所述含有芥子油苷的植物材料在研磨前在至少100摄氏度的温度下热处理至少5分钟；且
并且其中(a)、(b)和(c)的组合仅在使用所述局部组合物时组合；
并且其中所述含有芥子油苷的植物材料选自藜木科（Bataceae），十字花科（Brassicaceae），伯乐树科（Bretschneideraceae），山柑科（Capparaceae），番木瓜科（Caricaceae），大戟科（Euphorbiaceae），环蕊科（Gyrostemonaceae），池花科（Limnanthaceae），辣木科（Moringaceae），瘤药树科（Pentadiplandraceae），商陆科（Phytolaccaceae），海桐花科（Pittosporaceae），木犀草科（Resedaceae），刺茉莉科（Salvadoraceae），烈味三叶草科（Tovariaceae），旱金莲科（Tropaeolaceae），叠珠树科（Akaniaceae），醉蝶花科（Cleomaceae），澳远志科（Emblingiaceae），刺枝树科（Koeberliniaceae），夷白花菜科（Setchellanthaceae）及其混合物，优选十字花科，最优选芥菜（Brassica juncea）种。更优选地，所述含有芥子油苷的植物材料包含选自黑芥子苷、萝卜硫苷、苄基芥子油苷、苯乙基芥子油苷、α-萘基芥子油苷的芥子油苷及其混合物。
优选地，将所述含有芥子油苷的植物材料在环境压力(即，在加热时占主导的大气压条件)下热处理。在SI单位中，大气压等于101325 Pa，然而在本申请的上下文中，环境压力简单地意味着热处理不在特定地或人工地升高或降低的压力下实施。
优选的是，含有芥子油苷的植物材料不仅包含携带在侧基上的羟基、更优选在侧基上的C2处的羟基的芥子油苷，因为已经观察到，这样的芥子油苷形成不稳定的异硫氰酸酯类，所述异硫氰酸酯类环化为噁唑烷-2-硫酮。
关键的是，酶源不会不利地包含任何细胞毒性物质。细胞毒性是指当使用本文所述的细胞毒性测定法(使用ApoTox-Glo™ Triplex测定法(Promega Corporation))时，在0.001 U / 6 ml的硫葡糖苷酶水平下，细胞毒性不超过媒介物对照的180％，优选150％，最优选120％。此外，在一个实施方案中，所述酶源包含硫葡糖苷酶作为唯一酶，因为在环硫指定蛋白存在的情况下，已经观察到，硫葡糖苷酶能够将具有末端不饱和度的芥子油苷转化为它们相应的氰基环硫烷烃类(cyanoepithioalkanes)，而不是异硫氰酸酯类。
多元醇类型的润湿剂可以用于本发明的局部组合物中。润湿剂通常有助于增加润肤剂的有效性，减少结垢，刺激积垢的去除并改善皮肤感觉。通常的多元醇包括甘油，聚亚烷基二醇，更优选亚烷基多元醇及其衍生物，包括丙二醇，二丙二醇，聚丙二醇，聚乙二醇及其衍生物，山梨糖醇，羟丙基山梨糖醇，己二醇，1,3-丁二醇，1,2,6-己三醇，乙氧基化甘油，丙氧基化甘油及其混合物。为了获得最佳效果，所述润湿剂优选是丙二醇或透明质酸钠。润湿剂的量可以范围为局部组合物的0.2-25％、优选约0.5-约15％15 % w/w的任何值，包括其中包含的所有范围。
适用于本发明中的有机溶剂类型的说明性和非限制性实例包括烷醇，如乙醇和异丙醇、其混合物等。
香料可以用于本发明的局部组合物中。可以使用的香料类型的说明性非限制性实例包括包含萜烯和萜烯衍生物的那些，例如Bauer, K., 等人, Common Fragrance andFlavor Materials,VCH Publishers (1990)中描述的那些。本发明中可以使用的香料类型的说明性但非限制性实例包括月桂烯、二氢月桂烯醇、柠檬醛、万寿菊酮、顺式香叶酸、香茅酸、其混合物等。优选地，本发明的局部组合物中使用的香料的量范围为所述局部组合物的0.000001至10、更优选0.00001至5、最优选0.0001至2 % w/w，包括其中包含的所有范围。
防晒剂包括通常用于阻挡紫外线辐射的那些材料。示例性的有机防晒剂是对氨基苯甲酸(PABA)、肉桂酸酯和水杨酸酯的衍生物。例如，可以使用avobenzophenone (Parsol1789®)甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基苯甲酮(也称为羟苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基苯甲酮分别以商标Parsol MCX™和Benzophenone-3™销售。本发明的局部组合物中采用的防晒剂的确切量可以根据期望的针对太阳的紫外辐射的保护程度而变化。也可以采用反射或散射太阳射线的无机防晒剂。这些包括氧化物如氧化锌和二氧化钛。
局部组合物的pH通常为至少3，优选3至8，最优选4至7.5，因为已经在体外观察到，在烯丙基和2-苯乙基芥子油苷存在的情况下包含从芥菜粉制备的硫葡糖苷酶提取物的系统中有利于形成腈类。
局部组合物优选基本上不含亚铁离子，因为在它们存在的情况下，已经观察到水解产物的比例存在显著变化。
局部组合物优选包含0.1至10mM，优选0.3至5mM，最优选0.3至3mM维生素C，因为已经观察到维生素C活化硫葡糖苷酶。
局部组合物优选包含含有芥子油苷的植物材料，其量在所述局部组合物中提供最终浓度为0.05至1000，优选0.1至500，最优选0.5至100 mM的芥子油苷。
局部组合物优选包含酶源，所述酶源包含硫糖苷酶，其量提供局部组合物中的至少0.001U、更优选至少0.002U、更优选仍至少0.01U、最优选至少0.1U且优选至多20U、更优选至多10U、更优选仍至多2U、最优选至多1U的最终浓度。酶单位(U)是特定酶量的单位。一个U定义为在指定条件下每分钟催化1微摩尔底物的转化的酶量。1 U = 1/60微开特 =16.67纳开特。
在本发明的第二个方面，提供了治疗或预防瘙痒皮肤、优选头皮的方法，所述方法包括外部施用本发明第一个方面的局部组合物的步骤。
在其一个实施方案中，提供了治疗或预防瘙痒皮肤、优选头皮的方法，所述方法包括向有需要的人外部施用本发明第一个方面的局部组合物的步骤。
在其另一个实施方案中，提供了第一个方面的局部组合物，其用作药物，特别是用于治疗或预防瘙痒皮肤、优选头皮。
在其又一个实施方案中，提供了第一个方面的局部组合物用作药物、特别是用于治疗或预防瘙痒皮肤、优选头皮的用途。
在其另一个实施方案中，提供了第一个方面的局部组合物，其用于制备用于治疗或预防瘙痒皮肤，优选头皮的药物。
实施例
实施例1：用含水芥菜籽(芥菜(Brassica juncea))提取物和外源黑芥子酶处理的原代人新生真皮成纤维细胞中的血红素加氧酶1 (HO-1)的上调
在本实施例中，用来自芥菜(芥菜、印度芥菜、中国芥菜或叶芥菜、东方芥菜)的芥菜籽的任选热处理的含水提取物和外源黑芥子酶处理原代人新生真皮成纤维细胞，以确定该处理对血红素加氧酶1水平的影响。
材料
来自芥菜的Forge栽培品种的芥菜籽
异硫氰酸烯丙酯(AITC) (Sigma-Aldrich Company)
黑芥子苷(Sigma-Aldrich Company)
黑芥子酶 > 100 U/g固体(也称为硫葡糖苷葡萄糖水解酶、sinigrinase和sinigrase)(Sigma-Aldrich Company；1U将在25℃、pH6.0下从黑芥子苷每分钟产生1.0微摩尔葡萄糖)
原代人新生真皮成纤维细胞(Cell Research Corporation)
1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷(Sigma-Aldrich Company)
蛋白酶抑制剂片剂(Roche Diagnostics GmbH, Complete™ mini, 无EDTA片剂)
方法
芥菜籽提取物的制备
使用研钵和研杵研磨芥菜籽，并将粉碎的籽筛分以产生最大粒径为250μm的粉状物。以每 ml水100 mg芥菜籽粉的浓度制备含水提取物。然后将提取物在室温下静置10-15分钟，然后通过玻璃棉过滤，然后通过0.45 µm PTFE注射过滤器过滤。
热处理的芥菜籽含水提取物通过如下制备：在所需温度(50、60、70、80和120℃)下预热水，添加芥菜籽粉，在相同所需温度下将提取物加热15分钟，将提取物冷却至室温，并如上所述过滤。
将所有提取物冷冻在-80℃，直至使用。还在补充有10％FBS的DMEM(称为完全培养基)中制备异硫氰酸烯丙酯(AITC)(8.4 mM芥子油苷当量，假定所有芥子油苷完全转化为异硫氰酸烯丙酯)和8.4 mM芥子油苷黑芥子甙对照。
黑芥子酶溶液的制备
以10 U/ml的浓度在水中制备外源黑芥子酶的储备溶液。将酶在室温下在溶液中静置4小时，然后在冰箱中储存过夜，然后直接施用于细胞。
成纤维细胞的培养
在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(称为完全培养基)中培养和传代原代人新生真皮成纤维细胞。将细胞以每孔40,000个细胞的接种密度常规地接种于24孔组织培养板中的1ml完全培养基中，并在37℃、5 % CO2下孵育48小时，然后添加测试溶液。
测试样品的添加
通过添加足够的黑芥子酶溶液、使得6ml芥菜籽提取物包含1U黑芥子酶来制备测试样品。然后将该混合物用补充有10％ FBS的DMEM以1/10、1/25、1/50和1/100稀释。将真皮成纤维细胞用500ul/孔的测试样品处理24小时时段。每个实验板中包括媒介物和阳性对照(2μM1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷)。
收获样品
在收获细胞之前注意到细胞形态学的任何变化。所有组织培养上清液立即储存在-20℃。随后测定组织培养上清液的细胞活力、细胞毒性和细胞凋亡。
细胞毒性测定
使用根据制造商的说明书使用的ApoTox-Glo™ Triplex测定(Promega Corporation)来检查所有组织培养上清液的细胞毒性。该测定结合三种测定化学物质来评价相同的基于细胞的测定孔中的活力、细胞毒性和细胞凋亡事件。
首先，通过测量同时添加含有两种肽底物的单一非裂解试剂的两种差异蛋白酶生物标志物来确定活力和细胞毒性。活细胞蛋白酶活性限于完整的活细胞，并且使用荧光、细胞渗透性肽底物(GF-AFC底物)测量。底物进入完整细胞，在完整细胞中其被切割以产生与活细胞数目成比例的荧光信号。该活细胞蛋白酶活性标志物在膜完整性丧失和渗漏入周围培养基中后变得无活性。第二、细胞不渗透的荧光肽底物(双-AAF-R110底物)同时用于测量已经从已经失去膜完整性的细胞释放的死细胞蛋白酶活性。这导致细胞活力和细胞毒性的的成比率、反向相关的量度。活细胞与死细胞的比率不依赖于细胞数目，因此可用于使数据均一化。
添加含有胱天蛋白酶-3/7的发光DEVD-肽底物(序列DEVD(氨基酸序列Asp-Glu-Val-Asp)对应于PARP1(聚(ADP-核糖)聚合酶1内的序列)的第二试剂和Ultra-Glo™重组热稳定荧光素酶，PARP1(聚(ADP-核糖)聚合酶1为通过细胞凋亡的细胞死亡期间被蛋白胱天蛋白酶-3切割。底物的胱天蛋白酶-3/7切割释放荧光素，其为荧光素酶的底物并产生光。用光度计测量的光输出与作为细胞凋亡的关键指标的胱天蛋白酶-3/7活化相关。
设置培养基中含有<20,000个细胞/孔的96孔测定板。将组织培养上清液和媒介物对照添加至合适孔，每孔最终体积为100μl。将细胞培养24小时。然后将20μl含有荧光、细胞渗透的肽底物甘氨酰苯丙氨酰基-氨基氟香豆素(GF-AFC)底物和荧光肽底物双-丙氨酰-丙氨酰苯丙氨酰-罗丹明110(双-AAF-R110)的活力/细胞毒性试剂添加至每个孔，并通过轨道摇动短暂混合(300-500rpm，约30秒)。将细胞在37℃下孵育2.5小时，并且在用于激发的400nm和用于发射的505nm测量荧光(活力)，和在用于激发的485nm和用于发射的520nm测量荧光(细胞毒性)。
然后将100μl胱天蛋白酶-Glo® 3/7试剂添加至所有孔，并通过轨道摇动(300-500rpm，约30秒)短暂混合，之后将细胞在室温下孵育30分钟。测量发光以确定作为细胞凋亡的标志的胱天蛋白酶活化的水平。
细胞裂解物的制备
去除和储存组织培养上清液之后，用每孔1ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞单层，并用每孔200μl细胞裂解缓冲液裂解。细胞裂解缓冲液由pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的0.5 % w/w Triton™ X100 (辛基苯酚乙氧基化物)和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)组成。在临使用前，以制造商推荐的水平将蛋白酶抑制剂片剂添加至裂解缓冲液中。所述板接受一个冻融循环以确保完全的细胞裂解。随后如下澄清裂解物：通过用移液管尖端将样品从板上刮下并使用Acroprep™真空歧管(Pall Corporation)将其通过Acrowell™过滤板(Pall Corporation)进入96孔微孔板。将澄清的裂解物储存在-20℃，直至需要。
总蛋白测定
使用Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒(Perbio Science UK Ltd)测量每种细胞裂解物的总蛋白浓度。BCA蛋白测定组合众所周知的在碱性介质中通过蛋白将Cu2+还原为Cu1+，以及通过二辛可宁酸(BCA)高灵敏度和选择性比色检测亚铜阳离子(Cu1+)。第一步是在碱性环境中铜与蛋白螯合以形成浅蓝色络合物。在称为缩二脲反应的该反应中，含有三个或更多个氨基酸残基的肽在含有酒石酸钠钾的碱性环境中与铜离子形成有色螯合物。
在显色反应的第二步中，二辛可宁酸与第一步中形成的还原型(亚铜)阳离子反应。强烈的紫色反应产物由两个BCA分子与一个亚铜离子的螯合产生。BCA/铜络合物是水溶性的，并且表现出随着蛋白浓度增加的562nm的强线性吸光度。BCA试剂比第一反应的浅蓝色灵敏度高约100倍(检测下限)。
导致BCA颜色形成的反应受蛋白的氨基酸序列中的四个氨基酸残基(半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)的强烈影响。由于通用肽主链也有助于颜色形成，这有助于使由蛋白组成差异引起的变异性最小化。
从提供的2 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)储备溶液制备范围为0至800 µg/ml蛋白的一系列8种标准溶液。将10μl标准或细胞裂解物添加至平底96孔微量滴定板的一式两份孔中。根据试剂盒说明书从50份试剂A和1份试剂B制备试剂溶液。将200μl最终试剂添加至微量滴定板的每个孔中。将板混合，加盖并在37℃下孵育30分钟，并在540nm读取吸光度。构建蛋白标准曲线并用于确定每种单个细胞裂解物的蛋白浓度。总蛋白的数据用于均一化来自下面血红素加氧酶1测定的数据。
血红素加氧酶1(HO-1)测定
使用人总HO-1/HMOX1 DuoSet IC测定(R&D Systems Europe Ltd)根据制造商的说明书测定每种细胞裂解物的血红素加氧酶1(HO-1)蛋白浓度。该DuoSet IC ELISA(间接竞争性酶联免疫吸附测定)含有开发测量细胞裂解物中的HO-1 / HMOX1(血红素加氧酶(脱环)1，其为编码酶血红素加氧酶1的人基因1)/HSP32(热休克蛋白32(Hsp32)，也称为血红素加氧酶1(HO-1))的夹心ELISA所需的基本组分。对HO-1/HMOX1/HSP32特异性的固定化捕获抗体结合磷酸化和未磷酸化的HO-1/HMOX1/HSP32。在洗掉未结合的物质之后，生物素化的检测抗体用于利用标准链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)形式检测磷酸化和非磷酸化的蛋白。
以范围为0.15625至10 ng/ml的浓度在试剂稀释剂(pH7.2的PBS中的0.5 % w/wTriton™ X100 (辛基苯酚乙氧基化物)和1mM EDTA)中制备八个HO-1标准品，包括阴性对照。将HO-1捕获抗体在PBS中稀释至8 µg/ml的浓度，并在室温下与微量滴定板(GreinerBio-One Ltd)结合过夜。通过在自动洗板机上用洗涤缓冲液(PBS中的0.05 % w/w Tween20 (聚山梨醇酯20))洗涤三次来去除未结合的抗体。将板用300μl/孔的PBS中的1 % w/w牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，并在洗涤缓冲液中洗涤三次。
将100μl在试剂稀释液中1/5稀释的细胞裂解物或标准品添加至一式两份孔中。将板在室温下孵育2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μl稀释至200 ng/ml浓度的HO-1检测抗体添加至每个孔中，并将板在室温下孵育2小时。如前所述洗涤板。将100μl在PBS中的1％BSA中1/200稀释的链霉抗生物素蛋白HRP添加至每个孔中，并在室温下在黑暗中孵育20分钟。如前所述洗涤板，然后将100μl底物溶液(颜色试剂A和颜色试剂B的1:1混合物)添加至每个孔中，并在黑暗中在室温下孵育，直至显色(约20分钟)。将50μl终止溶液(2M H2SO4水溶液)施加至每个孔，并在微板读数器(Dynex MRX)上在450 nm读取板，波长校正设定在540nm。
绘制平均光密度对HO-1浓度的标准曲线，并通过回归分析计算最佳拟合线。由此估计所有样品中的HO-1蛋白的未知浓度。使用从前述测定获得的总蛋白数据将结果均一化，并且表示为每μg蛋白的ng HO-1或HO-1相比于媒介物对照值的百分比变化。
结果
细胞毒性和HO-1测定的结果呈现于下表1至3中。
表1显示用有无热处理15分钟的含水芥菜籽提取物处理、用外源黑芥子酶和适当对照(媒介物为水)处理的原代人新生真皮成纤维细胞的HO-1水平(每μg蛋白的pg HO-1)。括号中的数字表示用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释的体积份数程度。通过用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)将储备溶液稀释至0.1 IU/ml来制备黑芥子酶对照。
在未热处理的情况下，含水芥菜提取物在成纤维细胞中诱导每μg蛋白约400 pgHO-1水平的HO-1。该水平的HO-1诱导被认为是高的。当将芥菜提取物热处理至70℃时，在成纤维细胞中诱导的HO-1的水平显著降低。如果芥菜提取物未热处理或在70℃以下处理并与外源黑芥子酶合并，则似乎对HO-1诱导没有影响。这表明，所测量的HO-1诱导是由于芥菜提取物中的某物质，而不是由于通过将提取物与外源黑芥子酶组合而产生的酶促最终产物。当芥菜的热处理温度增加至120℃时，在成纤维细胞中仅诱导非常低水平的HO-1。假设由未热处理或在低于120℃的温度下热处理的芥菜提取物诱导的高HO-1诱导是由于提取物中的组分(酶或蛋白)引起细胞的细胞毒性。热处理明显失活或以某种方式去除该产物。在用120℃热处理的芥菜提取物处理的成纤维细胞中诱导的HO-1的量为75 pg/µg蛋白，其类似于在50 pg/µg蛋白的媒介物对照水平。该水平是体外培养物中的正常成纤维细胞中存在的HO-1蛋白的背景水平。
当120℃热处理的芥菜提取物与外源酶黑芥子酶组合并施用于成纤维细胞时，发生比无黑芥子酶的样品更高水平的HO-1诱导。我们假设这是由于从芥菜提取物中的芥子油苷黑芥子甙有利产生异硫氰酸烯丙酯。异硫氰酸烯丙酯是nrf-2的已知活化剂，并且将诱导II期脱毒酶(包括HO-1)的产生。
该样品中诱导的HO-1的水平在176 pg/µg蛋白下是适度的，因此我们认为该诱导是由于产生有利的黑芥子酶连接的最终产物，而不是由于存在细胞毒性物质。当仅将外源黑芥子酶施用于成纤维细胞时，未诱导高于媒介物水平的HO-1，说明单独的黑芥子酶没有作用。
表 1：用有无热处理15分钟的含水芥菜籽提取物处理、用外源黑芥子酶和适当对照(媒介物为水)处理的原代人新生真皮成纤维细胞的HO-1水平(每μg蛋白的pg HO-1)。括号中的数字表示用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释的重量份数程度。通过用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)将储备溶液稀释至0.1 IU/ml来制备黑芥子酶对照。95％置信限值时的误差，n = 3。
芥菜籽提取物热处理(°C) HO-1(每µg蛋白的pg HO-1)
媒介物(1/50) - 17.25 ± 4.47
芥菜提取物(1/50) 无 397.87 ± 53.31
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/50) 无 396.64 ± 81.02
媒介物(1/100) - 29.95 ± 8.26
芥菜提取物(1/100) 无 307.02 ± 33.50
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/100) 无 371.67 ± 21.09
媒介物(1/50) - 18.38 ± 10.32
芥菜提取物(1/50) 50 421.11 ± 28.44
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/50) 50 443.88 ± 15.31
媒介物(1/100) - 46.60 ± 37.87
芥菜提取物(1/100) 50 271.42 ± 28.29
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/100) 50 296.96 ± 17.94
媒介物(1/50) - 11.67 ± 5.90
芥菜提取物(1/50) 60 359.07 ± 7.42
芥菜提取物 + 黑芥子酶溶液(1/50) 60 308.77 ± 19.71
媒介物(1/100) - 11.76 ± 1.07
芥菜提取物(1/100) 60 192.07 ± 16.85
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/100) 60 193.07 ± 16.82
媒介物(1/50) - 4.03 ± 1.16
芥菜提取物(1/50) 70 122.76 ± 5.15
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/50) 70 132.78 ± 8.64
媒介物(1/100) - 4.03 ± 0.22
芥菜提取物(1/100) 70 66.25 ± 10.32
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/100) 70 75.28 ± 3.89
媒介物(1/50) - 5.38 ± 1.00
芥菜提取物(1/50) 80 120.11 ± 3.16
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/50) 80 102.07 ± 3.03
媒介物(1/100) - 7.99 ± 0.40
芥菜提取物(1/100) 80 80.73 ± 6.87
芥菜提取物 + 黑芥子酶溶液(1/100) 80 51.25 ± 10.14
媒介物(1/50) - 51.78 ± 30.98
芥菜提取物(1/50) 120 75.06 ± 47.02
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/50) 120 176.38 ± 14.87
媒介物(1/100) - 45.84 ± 20.63
芥菜提取物(1/100) 120 57.90 ± 24.37
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/100) 120 275.19 ± 11.70
黑芥子酶溶液(1/50) - 6.87 ± 3.15
黑芥子酶溶液(1/100) - 8.41 ± 2.50
表2显示含水芥菜籽提取物对有无热处理的原代人新生真皮成纤维细胞和适当对照(媒介物为水)的细胞毒性(485nm的激发水平与520nm的发射水平的比率的相对荧光单位(RFU)×1000)。括号中的数字表示用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释的重量份数程度。在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中制备异氰酸烯丙酯和黑芥子苷对照。
观察到含水芥菜籽提取物的细胞毒性明显取决于其浓度，并且对于1/10至1/100稀释度，从约2000至300 RFU (x 1000)变化。观察到在相同浓度的含水芥菜籽提取物的细胞细胞毒性程度在120℃热处理15分钟后显著下降至约112至77 RFU (x 1000)(1/10至1/100稀释度)。我们假设这显示未热处理的芥菜提取物含有细胞毒性组分，并且因此这驱动成纤维细胞中的非常高水平的HO-1诱导。当将芥菜提取物在120℃热处理时，去除该细胞毒性，并且提取物显示很少或不诱导HO-1。假设热处理可以使酶失活或使未知来源的蛋白变性。芥子油苷、异硫氰酸酯或黑芥子酶本身都不诱导任何细胞毒性，表明芥菜提取物的细胞毒性组分不是这些组分中的任一种。
表 2：含水芥菜籽提取物对有无热处理的原代人新生真皮成纤维细胞和适当对照(媒介物为水)的细胞毒性(485nm的激发水平与520nm的发射水平的比率的相对荧光单位(RFU)×1000)。括号中的数字表示用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释的重量份数程度。在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中制备异氰酸烯丙酯和黑芥子苷对照。通过用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)将储备溶液稀释至0.1 IU/ml来制备黑芥子酶对照。95％置信限值时的误差，n = 4。
芥菜籽提取物热处理(°C) 细胞毒性(RFU x 1000)
无细胞 - 2.49 ± 0.05
未处理的细胞 - 63.96 ± 4.66
媒介物(1/10) - 141.87 ± 4.79
媒介物(1/25) - 92.55 ± 4.98
媒介物(1/50) - 81.35 ± 9.92
媒介物(1/100) - 79.64 ± 8.95
芥菜提取物(1/10) 无 1970.65 ± 4.84
芥菜提取物(1/25) 无 1058.59 ± 169.67
芥菜提取物(1/50) 无 508.83 ± 124.17
芥菜提取物(1/100) 无 277.09 ± 41.43
芥菜提取物(1/10) 120 112.49 ± 8.69
芥菜提取物(1/25) 120 86.02 ± 6.64
芥菜提取物(1/50) 120 82.60 ± 9.08
芥菜提取物(1/100) 120 77.36 ± 7.75
未处理的细胞 18.63 ± 1.41
异硫氰酸烯丙酯对照(1/50) - 66.71 ± 4.63
黑芥子苷对照(1/50) - 80.94 ± 39.75
黑芥子酶溶液(1/5) - 38.88 ± 2.58
黑芥子酶溶液(1/10) - 41.82 ± 1.22
媒介物(1/10) - 38.85 ± 1.93
表3显示用热处理的含水芥菜籽提取物处理、用外源黑芥子酶和适当对照(媒介物为水)处理的原代人新生真皮成纤维细胞的均一化HO-1水平(每μg蛋白的pg HO-1，其中媒介物= 100)。括号中的数字表示用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释的重量份数程度。通过用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)将储备溶液稀释至0.1 IU/ml来制备黑芥子酶对照。在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中制备黑芥子苷对照。
将外源黑芥子酶添加至热处理的含水芥菜籽提取物导致HO-1相比于从媒介物对照上调1.5倍至3.3倍。该反应类似于用异氰酸烯丙酯所观察到的反应。
表 3：用热处理的含水芥菜籽提取物处理、用外源黑芥子酶和适当对照(媒介物为水)处理的原代人新生真皮成纤维细胞的均一化HO-1水平(每μg蛋白的pg HO-1，其中媒介物= 100)。括号中的数字表示用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)稀释的重量份数程度。通过用补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)将储备溶液稀释至0.1 IU/ml来制备黑芥子酶对照。在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中制备黑芥子苷对照。95％置信限值时的误差，n = 3。
芥菜籽提取物热处理(°C) 均一化的HO-1(媒介物= 100)
媒介物(1/50) - 100 ± 59.82
芥菜提取物(1/50) 120 144.96 ± 90.81
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/50) 120 340.63 ± 28.72
异硫氰酸烯丙酯对照(1/50) - 335.46 ± 54.80
黑芥子苷对照(1/50) - 168.32 ± 73.93
黑芥子酶溶液 - 58.86 ± 27.00
媒介物(1/100) - 100 ± 31.52
芥菜提取物(1/100) 120 126.32 ± 53.18
芥菜提取物+ 黑芥子酶溶液(1/100) 120 600.39 ± 25.52
异硫氰酸烯丙酯对照(1/100) - 383.74 ± 30.02
黑芥子苷对照(1/100) - 49.08 ± 12.98
黑芥子酶溶液 - 71.48 ± 21.24
结论
表1和2显示含水芥菜籽提取物似乎对成纤维细胞具有细胞毒性，并且因为该细胞毒性而诱导非常高水平的HO-1。黑芥子酶、芥子油苷黑芥子苷、异硫氰酸烯丙酯本身(在相当水平)都不诱导细胞毒性，所以细胞毒性不是由于芥菜提取物中存在这些物质。当将提取物在120℃下热处理15分钟时，含水芥菜籽提取物的细胞毒性似乎减轻，表明可能未知酶被失活或蛋白变性，这消除了这种固有的细胞毒性。热处理的含水芥菜籽提取物当与外源黑芥子酶组合时无细胞毒性，但可以诱导培养的成纤维细胞中的HO-1含量的适度增加。这可表明，热处理的提取物内的芥子油苷被转化成有利的最终产物，诸如异硫氰酸烯丙酯，并且这些最终产物引起细胞的HO-1含量的适度增加。
实施例2：用选择的外源异硫氰酸酯化合物处理的原代人新生真皮成纤维细胞中的血红素加氧酶1 (HO-1)的上调
在本实施例中，用选择的外源异硫氰酸酯化合物处理原代人新生真皮成纤维细胞，以确定它们对血红素加氧酶1水平的影响。
材料(额外)
异硫氰酸α-萘酯(NITC) (Sigma-Aldrich Company)
异硫氰酸苯乙酯(PEITC) (Sigma-Aldrich Company)
1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷(Sigma-Aldrich Company)
异硫氰酸苄酯(BITC) (Sigma-Aldrich Company)
原代人成体真皮成纤维细胞(Cell Research Corporation)
方法
成纤维细胞的培养
在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(称为完全培养基)中常规培养和传代原代人成体真皮成纤维细胞。将细胞以每孔20,000个细胞的接种密度铺于12孔组织培养板中的1ml低血清培养基(补充有1％ FBS的DMEM)中，并在37℃下5 %CO2中孵育96-120小时，然后添加测试样品。
测试样品的添加
在二甲基亚砜(DMSO)中制备异硫氰酸酯(全部来自Sigma-Aldrich Company)1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷、异硫氰酸烯丙酯(AITC)、异硫氰酸α-萘酯(NITC)、异硫氰酸苯乙酯(PEITC)和异硫氰酸苄酯(BITC)，并且在补充有1 % FBS的DMEM中稀释至1uM和2uM的最终浓度。将真皮成纤维细胞用1 ml/孔的测试样品处理24小时时段。每个实验板中包括溶剂媒介物。
细胞裂解物的制备
24小时之后，用每孔1ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞单层，并用每孔400μl RIPA细胞裂解缓冲液裂解。RIPA细胞裂解缓冲液由50 mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.6)中的150 mM NaCl、1 % v/v Nonidet-P40 (Igepal CA603，来自Fluka 56741)、0.1 % w/v十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1 % w/v脱氧胆酸钠组成。在临使用前，以制造商推荐的水平将蛋白酶抑制剂片剂添加至裂解缓冲液中。所述板接受一个冻融循环以确保完全的细胞裂解。随后如下澄清裂解物：用移液管尖端将样品从板上刮下，以13,000 rpm离心10分钟，并将上清液转移至96孔微量滴定板中。将澄清的裂解物储存在-20℃，直至需要。
总蛋白测定
使用Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒(Perbio Science UK Ltd)测量每种细胞裂解物的总蛋白浓度，因此根据实施例1中记载的方法进行。
血红素加氧酶1(HO-1)测定
使用来自Assay Designs (ADI-EKS-800, Enzo Life Sciences, UK)的人HO-1 ELISA试剂盒根据制造商的说明书测定每种细胞裂解物的血红素加氧酶1(HO-1)蛋白浓度。简而言之，将活检样品在样品稀释液中1/10稀释，并将100μl转移至预包被的抗HO-1免疫测定板。还在样品稀释液中制备7点重组HO-1标准曲线，范围为25至0.39 ng/ml。将免疫测定板在室温下孵育30分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，并在室温下与100μl/孔的抗HO-1抗体溶液再孵育60分钟。如上所述洗涤板，并在室温下与100μl/孔的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合物溶液孵育30分钟。再次如上所述洗涤板，并在室温下在黑暗中将100μl/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-底物添加至每个孔中，持续15分钟。添加100μl/孔的终止溶液后，在微板阅读器(Dynex MRX)上在450nm读取吸光度，并从标准曲线外推HO-1的未知裂解物水平。使用从前述测定获得的总蛋白数据将结果均一化，并且表示为每μg蛋白的ng HO-1或HO-1相比于媒介物对照值的百分比变化。
结果
结果呈现于表4中，从中明显的是，1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷、异硫氰酸烯丙酯(AITC)、异硫氰酸α-萘酯(NITC)、异硫氰酸苯乙酯(PEITC)和异硫氰酸苄酯(BITC)中的每一种，在1或2μM，都增加原代人成体皮肤成纤维细胞中的HO-1产生。
表 4：用一系列异氰酸酯和媒介物对照处理后，由原代人成体真皮成纤维细胞表达的HO-1(ng HO-1/μg蛋白)。
治疗 剂量 HO-1(pg HO-1/μg蛋白)
媒介物对照 0.1% DMSO 179 ± 28
异硫氰酸α-萘酯(NITC) 1 µM 195 ± 25
异硫氰酸α-萘酯(NITC) 2 µM 191 ± 31
异硫氰酸烯丙酯(AITC) 1 µM 207 ± 13
异硫氰酸烯丙酯(AITC) 2 µM 243 ± 26
1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷 1 µM 280 ± 15
1-亚硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷 2 µM 309 ± 45
异硫氰酸苯乙酯(PEITC) 1 µM 429 ± 49
异硫氰酸苯乙酯(PEITC) 2 µM 668 ± 101
异硫氰酸苄酯(BITC) 1 µM 381 ± 50
异硫氰酸苄酯(BITC) 2 µM 730 ± 170
结论
在该测定中测试的所有异硫氰酸酯都增加原代人成体皮肤成纤维细胞中的HO-1产生。
实施例3：包含氢化椰子脂包裹的芥菜粉的颗粒的制备
在本实施例中，制备包含脂肪包封的热灭活的芥菜籽粉的颗粒。包封将芥菜籽粉与外用个人护理组合物的含水载体分离。
成分
5 g热灭活的芥菜粉
25 g氢化椰子脂(mp 36 – 40℃)
80 g用冰冷却的水
方法
将芥菜粉以1:5的重量比混合于温热的氢化椰子脂(保持在50℃)中。然后将混合物置于具有19号针的注射器中。将针保持在冰水下并快速地注射至表面下，产生在冷水中硬化的包裹芥菜粉的小脂肪颗粒。然后可以将这些颗粒从冷却水中小心地去除，并在室温下置于含有黑芥子酶的产品基料诸如洗发剂或护发素中。在使用中，体热或温水将融化芥菜粉胶囊，使得芥菜粉中的芥子油苷与产品基料中的黑芥子酶反应，将它们转化为异硫氰酸烯丙酯。这将导致异硫氰酸烯丙酯的低水平原位产生并递送至皮肤/头皮，导致要求保护的从HO-1上调的皮肤益处。

Claims (9)

1.局部组合物，其包含：
（a）经研磨的含有芥子油苷的植物材料；
（b）包含硫葡糖苷酶的酶源；
（c）水；和
（d）选自润湿剂，包括矿油的有机溶剂、硅酮、香料、有机/无机防晒剂的化合物；
其中所述含有芥子油苷的植物材料在研磨前在至少100摄氏度的温度下热处理至少5分钟；且
并且其中(a)、(b)和(c)的组合仅在使用所述局部组合物时组合；
并且其中所述含有芥子油苷的植物材料选自藜木科（Bataceae），十字花科（Brassicaceae），伯乐树科（Bretschneideraceae），山柑科（Capparaceae），番木瓜科（Caricaceae），大戟科（Euphorbiaceae），环蕊科（Gyrostemonaceae），池花科（Limnanthaceae），辣木科（Moringaceae），瘤药树科（Pentadiplandraceae），商陆科（Phytolaccaceae），海桐花科（Pittosporaceae），木犀草科（Resedaceae），刺茉莉科（Salvadoraceae），烈味三叶草科（Tovariaceae），旱金莲科（Tropaeolaceae），叠珠树科（Akaniaceae），醉蝶花科（Cleomaceae），澳远志科（Emblingiaceae），刺枝树科（Koeberliniaceae），夷白花菜科（Setchellanthaceae）及其混合物，优选十字花科，最优选芥菜（Brassica juncea）种。
2.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述含有芥子油苷的植物材料包含选自黑芥子苷、萝卜硫苷、苄基芥子油苷、苯乙基芥子油苷、α-萘基芥子油苷的芥子油苷及其混合物。
3.根据权利要求1或2中任意项所述的局部组合物，其中所述含有芥子油苷的植物材料专门不包含在侧基上携带羟基的芥子油苷。
4.根据权利要求3所述的局部组合物，其中所述含有芥子油苷的植物材料专门不包含在侧基上的C2处携带羟基的芥子油苷。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的局部组合物，其中硫葡糖苷酶是唯一的酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的局部组合物，其中pH为至少3，优选3至8，最优选4至7.5。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的局部组合物，其中所述局部组合物基本上不包含亚铁离子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的局部组合物，其中所述局部组合物包含0.1至10，优选0.3至5，最优选0.3至3 mM的维生素C。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的局部组合物，其包含含有芥子油苷的植物材料，其量在所述局部组合物中提供最终浓度为0.05至1000，优选0.1至500，最优选0.5至100 mM的芥子油苷。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020161653A2 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Benny Antony Mustard extract enriched with sinigrin having increased bioactivity and bioavailability of allyl isothiocyanate
FR3104032B1 (fr) * 2019-12-06 2021-11-12 Lvmh Rech Composition cosmétique comprenant des extraits de kigélia et de capucine

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496598A (en) * 1981-10-08 1985-01-29 Shiro Sakai Process for preparing mustard flour
US20030091518A1 (en) * 1999-12-20 2003-05-15 Gilles Pauly Cosmetic and/or pharmaceutical preparations
DE10308298A1 (de) * 2003-02-26 2004-09-09 Kullmer, Thomas, Priv. Doz. Dr. med. Verfahren zur Herstellung von Präparationen mit hochkonzentrierten Brassica-Inhaltsstoffen und deren Verwendung
US20060127996A1 (en) * 2004-12-14 2006-06-15 Johns Hopkins University Method of extraction of isothiocyanates into oil from glucosinolate-containing plants and method of producing products with oil containing isothiocyanates extracted from glucosinolate-containing plants
US20120052175A1 (en) * 2010-03-31 2012-03-01 Athula Ekanayake Process of Extracting Isothiocyanates

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1512406A1 (de) * 2003-09-03 2005-03-09 Cognis Iberia, S.L. Zubereitungen zur oralen Aufnahme

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496598A (en) * 1981-10-08 1985-01-29 Shiro Sakai Process for preparing mustard flour
US20030091518A1 (en) * 1999-12-20 2003-05-15 Gilles Pauly Cosmetic and/or pharmaceutical preparations
DE10308298A1 (de) * 2003-02-26 2004-09-09 Kullmer, Thomas, Priv. Doz. Dr. med. Verfahren zur Herstellung von Präparationen mit hochkonzentrierten Brassica-Inhaltsstoffen und deren Verwendung
US20060127996A1 (en) * 2004-12-14 2006-06-15 Johns Hopkins University Method of extraction of isothiocyanates into oil from glucosinolate-containing plants and method of producing products with oil containing isothiocyanates extracted from glucosinolate-containing plants
US20120052175A1 (en) * 2010-03-31 2012-03-01 Athula Ekanayake Process of Extracting Isothiocyanates

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