CN106191261B - 一种检测结核分支杆菌耐药性的dna标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用，本发明发现突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性且不受POA抑制；还具有磷酸解单链DNA（SS DNA）活性；且突变蛋白Rv2783cD67N不与POA结合；这样的位点突变会显著引起结核分枝杆菌对PZA的耐药性，可作为结核分枝杆菌PZA耐药性分子诊断的一个标志位点，有利于提高对具有PZA耐药性的结核分枝杆菌的检出率，精准率。能够有效缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。该发明为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。

Description

一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用。
背景技术
吡嗪酰胺（PZA）是一线抗结核药物，其作用机制还没有被完全阐明。目前只是知道，PZA是一种前药，需要被结核分枝杆菌（Mtb）的吡嗪酰胺酶（PZase）活化成活性形式POA才起作用。因此，PZase的基因pncA突变可以导致Mtb对PZA耐药[1]，故pncA可以作为快速诊断Mtb对PZA是否耐药的重要DNA分子标记，并已被广泛证明。但是，有相当多的对PZA耐药的Mtb并没有pncA基因突变，因此，推测是其活性产物POA的靶标发生了突变，故而导致耐药。最近先后有报道称编码核糖体蛋白S1的rpsA基因[2]以及编码天冬氨酸脱羧酶的panD基因[3,4]与PZA的耐药性有关。
然而，在实际研究中发现，有些PZA耐药的临床Mtb菌株并不存在已知的pncA，rpsA和panD基因突变，这些临床Mtb菌株的PZA耐药机制如何？怎么才能更便利地被检测出，提高结核分枝杆菌PZA耐药的检出率？仍是目前所面临的难题。
参考文献：
1. A. Scorpio, Y. Zhang, Mutations in pncA, a gene encodingpyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drugpyrazinamide in tubercle bacillus. Nat. Med. 2, 662-667 (1996).
2. W. Shi, X. Zhang, X. Jiang, H. Yuan, J. S. Lee, C. E. Barry, H.Wang. W. Zhang, Y. Zhang, Pyrazinamide inhibits trans-translation inMycobacterium tuberculosis. Science333, 1630-1632 (20110.
3.W. Shi, J. Chen, J. Feng, P. Cui, S. Zhang, X. Weng, W. Zhang, Y.Zhang, Aspartate decarboxylase (PanD) as a new target of pyrazinamide inMycobacterium tuberculosis. Emerg Microbes Infect3, e58 (2014).
4. N.A. Dillon, N. D. Peterson, B. C. Rosen, A. D. Baughn,Pantothenate and pantetheine ntagonize the antitubercular activity ofpyrazinamide. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 7258-63 (2014)。
发明内容
本发明的目的在于提供结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测位点及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌基因Rv2783c的第199位碱基是否发生G突变为A的碱基突变。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测膜，该检测膜中含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的PCR扩增引物。
进一步的，所述引物序列为：
Rv2783cF：5’-GGGAATTCCATATGTCTGCCGCTGAAAT-3’ （SEQ ID NO：5）；
Rv2783cR：5’-CCCAAGCTTATTCGGTGACCACTCG-3’ （SEQ ID NO：6）。
一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的蛋白，该蛋白为突变的蛋白Rv2783c，突变位点为第67位氨基酸天冬氨酸Asp突变为天冬酰胺Asn。
进一步的，上述蛋白具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性，且其活性不受吡嗪酸的影响。
进一步的，上述蛋白具有磷酸解单链DNA的活性。
一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的碱基序列，该序列为突变的基因Rv2783c序列，突变的位点为第199位碱基由G突变为A。
本发明的有益效果是：
1）本发明发现了Rv2783c基因特定位点的突变会显著引起结核分枝杆菌对PZA的耐药性，PZA对该突变结核分枝杆菌的MIC（最小抑菌浓度）达500 µg/ml；可作为结核分枝杆菌PZA耐药性分子诊断的一个标志位点，有利于提高对具有PZA耐药性的结核分枝杆菌的检出率，精准率。能够有效缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。该发明为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。
2）本发明通过研究发现，突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性且不受POA抑制；还具有磷酸解单链DNA（SS DNA）活性；且突变蛋白Rv2783cD67N不与POA结合；这对进一步研究出抗PZA耐药结核分枝杆菌药物提供的广泛的新的思路。
附图说明
图1为野生型Rv2783c与POA、PZA相互作用的检测结果；(A)等温滴定(Isothermaltitration calorimetry, ITC)结合研究表明，较高浓度的POA可以与结核菌的野生型Rv2783c结合。上半部分显示的是原始数据，Y轴表示野生型Rv2783c与POA结合时每秒释放的热量；下半部分显示的是每注射一次POA释放的热量以及拟合的曲线，Y轴表示每次注射每摩尔释放的热量；(B)ITC结合研究显示，PZA不结合野生型Rv2783c，上半部分Y轴显示的是，PZA与野生型Rv2783c不结合，不放出热量，而下半部分显示的是每次注入PZA都没有热量放出，因而没有拟合曲线；
图2为毛细管电泳结果显示Rv2783c具有不依赖模板的DNA合成活性；(A)未抑制的野生型 Rv2783c DNA合成活性；(B)PZA不抑制野生型Rv2783c DNA合成活性；(C) POA抑制野生型Rv2783c的DNA合成活性；(D)比较POA和PZA对野生型Rv2783c的不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性抑制效果；(E)突变的Rv2783cD67N的DNA聚合酶活性既不受PZA影响，（G）也不受POA的影响；(H)比较POA和PZA对突变的Rv2783cD67N的不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性抑制效果。数据显示的是平均值± SEM。使用t-test进行统计学分析；
图3为毛细管电泳结果显示Rv2783c磷酸解单链DNA（SS DNA）的活性；(A)未抑制的野生型Rv2783c 磷酸解活性；(B) PZA不抑制野生型Rv2783c 磷酸解；(C) POA抑制野生型Rv2783c的磷酸解活性；(D) 比较POA和PZA对野生型Rv2783c的磷酸解活性抑制效果；(E)未抑制的突变的Rv2783cD67N 磷酸解活性；（F）PZA不抑制突变的Rv2783cD67N 磷酸解活性；(G) POA 部分抑制突变的Rv2783cD67N 磷酸解活性；(H)比较POA和PZA对突变的Rv2783cD67N的磷酸解活性抑制效果。数据显示的是平均值±SEM。使用t-test进行统计学分析。
具体实施方式
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌基因Rv2783c的第199位碱基是否发生G突变为A的碱基突变。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。
优选的，所述特异性寡核苷酸探针序列为5’-GGGGGAAGAAGTTGAAGTGTTCTTTGGGG-3’（SEQ ID NO：4）或其反向互补充列。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测膜，该检测膜中含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的PCR扩增引物。
优选的，所述引物序列为：
Rv2783cF：5’-GGGAATTCCATATGTCTGCCGCTGAAAT-3’ （SEQ ID NO：5）；
Rv2783cR：5’-CCCAAGCTTATTCGGTGACCACTCG-3’（SEQ ID NO：6）。
一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的蛋白，该蛋白为突变的蛋白Rv2783c，突变位点为第67位氨基酸天冬氨酸Asp突变为天冬酰胺Asn。
优选的，上述蛋白具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性，且其活性不受吡嗪酸的影响。
优选的，上述蛋白具有磷酸解单链DNA的活性。
一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的碱基序列，该序列为突变的基因Rv2783c序列，突变的位点为第199位碱基由G突变为A。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 PZA耐药基因的发现
现有究表明，pncA，rpsA和panD基因与结核分枝杆菌（Mtb）PZA耐药有关，本发明在对PZA耐药的临床Mtb菌株的研究中，发现2株耐药Mtb并没有发生前述基因的突变，但存在Rv2783c基因的突变。经基因测序检测，发现突变后的Rv2783c基因序列为5’-ATGTCTGCCGCTGAAATTGACGAAGGCGTGTTCGAGACGACCGCCACCATCGACAACGGGAGCTTTGGCACCCGGACCATCCGCTTCGAGACCGGCCGATTGGCCTTGCAGGCCGCCGGCGCGGTGGTCGCCTACCTCGACGACGACAACATGCTGCTGTCGGCGACCACCGCCAGCAAGAACCCCAAAGAACACTTCAACTTCTTCCCCCTCACGGTCGACGTCGAGGAGCGCATGTATGCGGCCGGCCGCATCCCCGGTTCGTTCTTCCGTCGCGAGGGCCGACCCTCCACCGACGCGATCCTGACCTGCCGGCTCATCGACCGCCCGCTGCGCCCGTCGTTTGTCGACGGGCTGCGCAACGAGATCCAAATCGTGGTGACGATTCTCAGCCTGGATCCGGGCGATCTCTACGACGTATTGGCGATCAACGCGGCGTCGGCGTCCACCCAGCTGGGCGGTCTGCCGTTCTCCGGGCCCATCGGCGGTGTGCGGGTGGCGCTCATCGACGGCACCTGGGTCGGCTTCCCCACCGTCGACCAGATCGAGCGCGCCGTGTTCGACATGGTCGTGGCCGGCCGGATCGTCGAGGGTGATGTTGCCATCATGATGGTCGAAGCCGAGGCCACCGAAAACGTCGTCGAGCTCGTCGAAGGTGGTGCCCAAGCGCCGACGGAAAGCGTGGTGGCCGCGGGCCTGGAGGCGGCCAAGCCGTTTATCGCCGCGCTGTGCACCGCGCAGCAGGAGCTTGCCGATGCCGCTGGAAAGTCGGGCAAACCGACCGTCGACTTCCCGGTGTTCCCTGACTACGGCGAAGACGTGTACTACTCGGTGTCCTCGGTGGCCACCGACGAGTTGGCCGCCGCGTTGACCATCGGCGGTAAAGCCGAGCGCGACCAGCGCATCGACGAAATCAAGACCCAGGTTGTGCAGCGGCTCGCCGACACCTACGAGGGTCGCGAAAAGGAGGTCGGCGCCGCGTTGCGTGCCCTGACCAAAAAGCTGGTTCGGCAGCGCATCCTCACCGACCATTTCCGTATCGACGGCCGCGGCATCACCGACATTCGCGCATTGTCGGCCGAGGTGGCCGTGGTTCCGCGCGCGCACGGCAGCGCGCTGTTCGAACGCGGCGAAACCCAGATCCTGGGTGTGACCACACTCGACATGATCAAGATGGCCCAGCAGATCGACTCGTTGGGGCCGGAGACATCGAAGCGGTACATGCACCACTACAACTTCCCGCCGTTCTCCACCGGCGAGACCGGTCGGGTCGGTTCGCCCAAGCGGCGTGAGATCGGGCACGGCGCACTGGCCGAGCGGGCCCTGGTGCCGGTGTTGCCGAGCGTCGAGGAATTCCCGTATGCCATTCGCCAGGTGTCGGAGGCTCTGGGCTCCAACGGGTCGACCTCGATGGGGTCGGTGTGCGCGTCGACGCTGGCGCTGCTCAACGCCGGGGTGCCGCTCAAGGCGCCGGTGGCCGGCATCGCGATGGGCCTGGTCTCCGACGACATTCAAGTAGAAGGGGCGGTCGACGGCGTTGTGGAGCGTCGCTTCGTCACCCTCACCGACATCCTCGGCGCCGAAGACGCGTTCGGTGACATGGACTTCAAGGTCGCCGGGACCAAGGACTTCGTCACCGCGCTGCAGCTGGACACCAAGCTCGACGGGATCCCTTCGCAGGTGCTTGCCGGAGCACTCGAGCAGGCCAAGGACGCCCGCCTCACGATCTTGGAGGTGATGGCTGAGGCCATCGATAGACCCGACGAAATGAGTCCCTACGCCCCGCGGGTGACCACCATCAAGGTTCCGGTGGACAAGATCGGGGAGGTCATCGGACCCAAGGGCAAGGTCATCAACGCCATCACCGAGGAGACCGGCGCGCAGATCTCCATCGAAGACGACGGCACCGTGTTCGTCGGCGCCACCGACGGGCCATCGGCACAGGCCGCGATCGACAAGATCAACGCCATCGCCAACCCGCAGCTGCCGACGGTGGGCGAACGGTTCCTCGGAACCGTGGTCAAGACCACCGATTTCGGTGCCTTTGTATCGTTGCTGCCTGGCCGCGACGGTCTGGTGCACATTTCCAAACTCGGCAAGGGCAAGCGCATCGCGAAGGTCGAGGACGTTGTCAATGTCGGTGACAAGCTGCGGGTGGAGATCGCCGACATCGACAAACGGGGCAAGATCTCCCTGATCCTGGTCGCCGACGAGGACAGCACCGCCGCCGCTACCGATGCCGCGACGGTCACCAGCTGA-3’（SEQ ID NO：1），即基因Rv2783c第199位碱基是发生了G突变为A的碱基突变。
突变后的基因Rv2783c的所编码的氨基酸序列为MSAAEIDEGVFETTATIDNGSFGTRTIRFETGRLALQAAGAVVAYLDDDNMLLSATTASKNPKEHFNFFPLTVDVEERMYAAGRIPGSFFRREGRPSTDAILTCRLIDRPLRPSFVDGLRNEIQIVVTILSLDPGDLYDVLAINAASASTQLGGLPFSGPIGGVRVALIDGTWVGFPTVDQIERAVFDMVVAGRIVEGDVAIMMVEAEATENVVELVEGGAQAPTESVVAAGLEAAKPFIAALCTAQQELADAAGKSGKPTVDFPVFPDYGEDVYYSVSSVATDELAAALTIGGKAERDQRIDEIKTQVVQRLADTYEGREKEVGAALRALTKKLVRQRILTDHFRIDGRGITDIRALSAEVAVVPRAHGSALFERGETQILGVTTLDMIKMAQQIDSLGPETSKRYMHHYNFPPFSTGETGRVGSPKRREIGHGALAERALVPVLPSVEEFPYAIRQVSEALGSNGSTSMGSVCASTLALLNAGVPLKAPVAGIAMGLVSDDIQVEGAVDGVVERRFVTLTDILGAEDAFGDMDFKVAGTKDFVTALQLDTKLDGIPSQVLAGALEQAKDARLTILEVMAEAIDRPDEMSPYAPRVTTIKVPVDKIGEVIGPKGKVINAITEETGAQISIEDDGTVFVGATDGPSAQAAIDKINAIANPQLPTVGERFLGTVVKTTDFGAFVSLLPGRDGLVHISKLGKGKRIAKVEDVVNVGDKLRVEIADIDKRGKISLILVADEDSTAAATDAATVTS（SEQ ID NO：2），即蛋白Rv2783c序列的第67位氨基酸天冬氨酸Asp是突变为天冬酰胺Asn，将突变后的蛋白记为Rv2783cD67N。
实施例2 过表达突变基因Rv2783c的重组Mtb对PZA耐药
为了进一步确认上述发现的PZA耐药的Mtb菌株的耐药性是否由基因Rv2783c突变所致，本实施例在正常Mtb菌株（亲本菌株Mtb H37Rv）体内过表达突变的Rv2783c（突变位点如实施例1所述），所得Mtb菌株命名为Rv2783c（D67N），检测该菌株对PZA的耐药性。同时分别对正常Mtb菌株（亲本菌株 Mtb H37Rv）体内过表达无突变的Rv2783c、及空载Hsp60Rv作为对照。
具体实验设计如下：用Bactec MGIT 960分别检测Rv2783c（D67N）菌株、Rv2783c无突变菌株、空载体Hsp60Rv 菌株、亲本菌株 Mtb H37Rv对PZA的耐药性，即检测PZA对上述菌株的MIC（最小抑菌浓度），检测了≧3次。
检测结果如表1所示，从中可以看出过表达突变的Rv2783c可以导致重组菌对PZA耐药，PZA对Rv2783c（D67N）的MIC（最小抑菌浓度）上升到200µg/ml以上，达500 µg/ml；而PZA对其他重组菌株和亲本菌株的MIC（最小抑菌浓度）均在150 µg/ml以下。对Rv2783c（D67N）菌株体内的吡嗪酰胺酶（PZase）的活性进行检测，检测结果为阳性，进一步说明，Rv2783c（D67N）菌株的PZA耐药性为基因Rv2783c突变所致。
表1 检测表达不同Rv2783c蛋白的重组Mtb对PZA的敏感性
实施例3 野生型Rv2783c与POA相互作用
吡嗪酰胺（PZA）是一种前药，需要被结核分枝杆菌（Mtb）的吡嗪酰胺酶（PZase）活化成活性形式吡嗪酸（POA）才起到抑制Mtb的作用，为了进一步研究吡嗪酰胺（PZA）的作用机制，本实施例通过等温滴定(Isothermal titration calorimetry, ITC)法对野生型Rv2783c与POA、PZA之间的相互作用进行研究。
实验结果与结论：
上述检测结果如图1所示，图1A为野生型Rv2783c与POA的等温滴定(Isothermaltitration calorimetry, ITC)实验结果，图中上半部分显示的是原始数据，Y轴表示野生型Rv2783c与POA结合时每秒释放的热量；下半部分显示的是每注射一次POA释放的热量以及拟合的曲线，Y轴表示每次注射每摩尔释放的热量。从中可以看出，较高浓度的POA可以与结核菌的野生型Rv2783c结合。图1B为野生型Rv2783c与PZA的ITC实验结果，图中上半部分Y轴显示的是PZA与野生型Rv2783c不结合，不放出热量，而下半部分显示的是每次注入PZA都没有热量放出，因而没有拟合曲线。从中可以看出，PZA不结合野生型Rv2783c。
上述结果说明野生型Rv2783c可以和POA结合但不与PZA结合，可以被POA抑制，但是不被PZA抑制。
实施例4 突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性且不受POA抑制
实验方法：将含有36-聚体的ssDNA底物、dADP的缓冲液分别与野生型Rv2783c蛋白、突变蛋白Rv2783cD67N和M.smeg_2656蛋白(阳性对照)反应。反应后的样品经过100℃加热5mim终止反应，然后通过华大基因公司进行毛细管电泳分析。
上述ssDNA序列：5’-FAM-GCCCTGCTGCCGACCAACGAAGGTAAAAAAAAAAAA-3’（SEQ IDNO：3）。
实验结果与结论：
毛细管电泳分析结果如图2所示，图2A为野生型 Rv2783c不依赖DNA模板的DNA合成活性检测，从中可以看出，野生型Rv2783c具有DNA合成活性，具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性。
图2B为有PZA存在的条件下，野生型 Rv2783c不依赖DNA模板的DNA合成活性检测，从中可以看出，野生型 Rv2783的DNA聚合酶活性不受影响，说明PZA不抑制野生型Rv2783c的DNA合成活性。
图2C为有POA存在的条件下，野生型 Rv2783c不依赖DNA模板的DNA合成活性检测，从中可以看出，POA抑制野生型Rv2783c的DNA合成活性。
图2D为POA和PZA对野生型Rv2783c的不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性抑制效果的比较，从中可以看出，POA具有显著抑制野生型Rv2783c不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性的功能。
图2E和2G检测结果显示，突变蛋白Rv2783cD67N的DNA聚合酶活性既不受PZA影响（图2E），也不受POA的影响（图2G）。POA和PZA对突变的Rv2783cD67N的不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性均没有明显的抑制效果（图2H）。
上述结果说明，本发明发现的突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性，该活性既不受PZA影响，也不受POA的影响。
实施例5 突变蛋白Rv2783cD67N具有磷酸解单链DNA（SS DNA）的活性
实验方法：将含有36-聚体的ssDNA底物、(NH4)3PO4的缓冲液分别与野生型Rv2783c蛋白、突变蛋白Rv2783cD67N和M.smeg_2656蛋白(阳性对照)反应。反应后的样品经过100℃加热5mim终止反应，然后通过华大基因公司进行毛细管电泳分析。
上述ssDNA序列：5’-FAM-GCCCTGCTGCCGACCAACGAAGGTAAAAAAAAAAAA-3’（SEQ IDNO：3）。
实验结果与结论：
实验检测结果如图3所示，图3A为野生型 Rv2783c磷酸解单链DNA的活性检测，从中可以看出，野生型Rv2783c具有磷酸解活性。
图3B为有PZA存在的条件下，野生型 Rv2783c磷酸解单链DNA的活性检测，从中可以看出，野生型 Rv2783的磷酸解单链DNA活性不受影响，说明PZA不抑制野生型Rv2783c的磷酸解单链DNA活性。
图3C为有POA存在的条件下，野生型 Rv2783c磷酸解单链DNA的活性检测，从中可以看出，POA抑制野生型Rv2783c的磷酸解单链DNA活性。
图3D为POA和PZA对野生型Rv2783c磷酸解单链DNA活性抑制效果的比较，从中可以看出，POA具有显著抑制野生型Rv2783c磷酸解单链DNA活性的功能。
图3E和3G检测结果显示，突变蛋白Rv2783cD67N的磷酸解单链DNA活性不受PZA影响（图3E），但部分受POA的影响（图3G）。POA和PZA对突变的Rv2783cD67N的磷酸解单链DNA的活性抑制比较结果（图3H）显示，POA能部分影响Rv2783cD67N的磷酸解单链DNA活性，但其抑制作用远远小于对野生型Rv2783c的抑制作用。
上述结果说明，本发明发现的突变蛋白Rv2783cD67N具有磷酸解单链DNA（SS DNA）的活性，该活性不受PZA影响，只部分受POA的影响。
综上所述，1）本发明突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性且不受POA抑制；2）本发明突变蛋白Rv2783cD67N具有磷酸解单链DNA（SS DNA）的活性； 3）本发明突变蛋白Rv2783cD67N不与POA结合，但野生的Rv2783c蛋白可以与POA结合；可见，本发明突变蛋白Rv2783cD67N的上述功能受POA的影响较小或不受POA的影响，但野生型Rv2783c蛋白的功能都受到POA的抑制。4）过表达突变的Rv2783c基因可以导致重组菌对PZA具有显著的耐药性。
上述实验结果说明，基因Rv2783c第199位碱基、或蛋白Rv2783c第67位氨基酸可作为结核分枝杆菌PZA耐药性分子诊断的一个标志位点，有利于提高对具有PZA耐药性的结核分枝杆菌的检出率。具体可应用于以下几个方面：
1）一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。
2）一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌基因Rv2783c的第199位碱基是否发生G突变为A的碱基突变。
3）一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针；所述特异性寡核苷酸探针序列可以为5’-GGGGGAAGAAGTTGAAGTGTTCTTTGGGG-3’（SEQ ID NO：4）或其反向互补充列。
4）一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测膜，该检测膜中含有用于检测基因Rv2783c第199碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针；所述特异性寡核苷酸探针序列为可以为5’-GGGGGAAGAAGTTGAAGTGTTCTTTGGGG-3’（SEQ ID NO：4）或其反向互补充列。
5）一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的PCR扩增引物，对所得扩增产物进行测序分析，即可获知基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A；
上述PCR扩增引物可以为：
Rv2783cF：5’-GGGAATTCCATATGTCTGCCGCTGAAAT-3’ （SEQ ID NO：5）；
Rv2783cR：5’-CCCAAGCTTATTCGGTGACCACTCG-3’ （SEQ ID NO：6）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2259
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtctgccg ctgaaattga cgaaggcgtg ttcgagacga ccgccaccat cgacaacggg 60
agctttggca cccggaccat ccgcttcgag accggccgat tggccttgca ggccgccggc 120
gcggtggtcg cctacctcga cgacgacaac atgctgctgt cggcgaccac cgccagcaag 180
aaccccaaag aacacttcaa cttcttcccc ctcacggtcg acgtcgagga gcgcatgtat 240
gcggccggcc gcatccccgg ttcgttcttc cgtcgcgagg gccgaccctc caccgacgcg 300
atcctgacct gccggctcat cgaccgcccg ctgcgcccgt cgtttgtcga cgggctgcgc 360
aacgagatcc aaatcgtggt gacgattctc agcctggatc cgggcgatct ctacgacgta 420
ttggcgatca acgcggcgtc ggcgtccacc cagctgggcg gtctgccgtt ctccgggccc 480
atcggcggtg tgcgggtggc gctcatcgac ggcacctggg tcggcttccc caccgtcgac 540
cagatcgagc gcgccgtgtt cgacatggtc gtggccggcc ggatcgtcga gggtgatgtt 600
gccatcatga tggtcgaagc cgaggccacc gaaaacgtcg tcgagctcgt cgaaggtggt 660
gcccaagcgc cgacggaaag cgtggtggcc gcgggcctgg aggcggccaa gccgtttatc 720
gccgcgctgt gcaccgcgca gcaggagctt gccgatgccg ctggaaagtc gggcaaaccg 780
accgtcgact tcccggtgtt ccctgactac ggcgaagacg tgtactactc ggtgtcctcg 840
gtggccaccg acgagttggc cgccgcgttg accatcggcg gtaaagccga gcgcgaccag 900
cgcatcgacg aaatcaagac ccaggttgtg cagcggctcg ccgacaccta cgagggtcgc 960
gaaaaggagg tcggcgccgc gttgcgtgcc ctgaccaaaa agctggttcg gcagcgcatc 1020
ctcaccgacc atttccgtat cgacggccgc ggcatcaccg acattcgcgc attgtcggcc 1080
gaggtggccg tggttccgcg cgcgcacggc agcgcgctgt tcgaacgcgg cgaaacccag 1140
atcctgggtg tgaccacact cgacatgatc aagatggccc agcagatcga ctcgttgggg 1200
ccggagacat cgaagcggta catgcaccac tacaacttcc cgccgttctc caccggcgag 1260
accggtcggg tcggttcgcc caagcggcgt gagatcgggc acggcgcact ggccgagcgg 1320
gccctggtgc cggtgttgcc gagcgtcgag gaattcccgt atgccattcg ccaggtgtcg 1380
gaggctctgg gctccaacgg gtcgacctcg atggggtcgg tgtgcgcgtc gacgctggcg 1440
ctgctcaacg ccggggtgcc gctcaaggcg ccggtggccg gcatcgcgat gggcctggtc 1500
tccgacgaca ttcaagtaga aggggcggtc gacggcgttg tggagcgtcg cttcgtcacc 1560
ctcaccgaca tcctcggcgc cgaagacgcg ttcggtgaca tggacttcaa ggtcgccggg 1620
accaaggact tcgtcaccgc gctgcagctg gacaccaagc tcgacgggat cccttcgcag 1680
gtgcttgccg gagcactcga gcaggccaag gacgcccgcc tcacgatctt ggaggtgatg 1740
gctgaggcca tcgatagacc cgacgaaatg agtccctacg ccccgcgggt gaccaccatc 1800
aaggttccgg tggacaagat cggggaggtc atcggaccca agggcaaggt catcaacgcc 1860
atcaccgagg agaccggcgc gcagatctcc atcgaagacg acggcaccgt gttcgtcggc 1920
gccaccgacg ggccatcggc acaggccgcg atcgacaaga tcaacgccat cgccaacccg 1980
cagctgccga cggtgggcga acggttcctc ggaaccgtgg tcaagaccac cgatttcggt 2040
gcctttgtat cgttgctgcc tggccgcgac ggtctggtgc acatttccaa actcggcaag 2100
ggcaagcgca tcgcgaaggt cgaggacgtt gtcaatgtcg gtgacaagct gcgggtggag 2160
atcgccgaca tcgacaaacg gggcaagatc tccctgatcc tggtcgccga cgaggacagc 2220
accgccgccg ctaccgatgc cgcgacggtc accagctga 2259
<210> 2
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Ala Ala Glu Ile Asp Glu Gly Val Phe Glu Thr Thr Ala Thr
1 5 10 15
Ile Asp Asn Gly Ser Phe Gly Thr Arg Thr Ile Arg Phe Glu Thr Gly
20 25 30
Arg Leu Ala Leu Gln Ala Ala Gly Ala Val Val Ala Tyr Leu Asp Asp
35 40 45
Asp Asn Met Leu Leu Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Asn Pro Lys Glu
50 55 60
His Phe Asn Phe Phe Pro Leu Thr Val Asp Val Glu Glu Arg Met Tyr
65 70 75 80
Ala Ala Gly Arg Ile Pro Gly Ser Phe Phe Arg Arg Glu Gly Arg Pro
85 90 95
Ser Thr Asp Ala Ile Leu Thr Cys Arg Leu Ile Asp Arg Pro Leu Arg
100 105 110
Pro Ser Phe Val Asp Gly Leu Arg Asn Glu Ile Gln Ile Val Val Thr
115 120 125
Ile Leu Ser Leu Asp Pro Gly Asp Leu Tyr Asp Val Leu Ala Ile Asn
130 135 140
Ala Ala Ser Ala Ser Thr Gln Leu Gly Gly Leu Pro Phe Ser Gly Pro
145 150 155 160
Ile Gly Gly Val Arg Val Ala Leu Ile Asp Gly Thr Trp Val Gly Phe
165 170 175
Pro Thr Val Asp Gln Ile Glu Arg Ala Val Phe Asp Met Val Val Ala
180 185 190
Gly Arg Ile Val Glu Gly Asp Val Ala Ile Met Met Val Glu Ala Glu
195 200 205
Ala Thr Glu Asn Val Val Glu Leu Val Glu Gly Gly Ala Gln Ala Pro
210 215 220
Thr Glu Ser Val Val Ala Ala Gly Leu Glu Ala Ala Lys Pro Phe Ile
225 230 235 240
Ala Ala Leu Cys Thr Ala Gln Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala Gly Lys
245 250 255
Ser Gly Lys Pro Thr Val Asp Phe Pro Val Phe Pro Asp Tyr Gly Glu
260 265 270
Asp Val Tyr Tyr Ser Val Ser Ser Val Ala Thr Asp Glu Leu Ala Ala
275 280 285
Ala Leu Thr Ile Gly Gly Lys Ala Glu Arg Asp Gln Arg Ile Asp Glu
290 295 300
Ile Lys Thr Gln Val Val Gln Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu Gly Arg
305 310 315 320
Glu Lys Glu Val Gly Ala Ala Leu Arg Ala Leu Thr Lys Lys Leu Val
325 330 335
Arg Gln Arg Ile Leu Thr Asp His Phe Arg Ile Asp Gly Arg Gly Ile
340 345 350
Thr Asp Ile Arg Ala Leu Ser Ala Glu Val Ala Val Val Pro Arg Ala
355 360 365
His Gly Ser Ala Leu Phe Glu Arg Gly Glu Thr Gln Ile Leu Gly Val
370 375 380
Thr Thr Leu Asp Met Ile Lys Met Ala Gln Gln Ile Asp Ser Leu Gly
385 390 395 400
Pro Glu Thr Ser Lys Arg Tyr Met His His Tyr Asn Phe Pro Pro Phe
405 410 415
Ser Thr Gly Glu Thr Gly Arg Val Gly Ser Pro Lys Arg Arg Glu Ile
420 425 430
Gly His Gly Ala Leu Ala Glu Arg Ala Leu Val Pro Val Leu Pro Ser
435 440 445
Val Glu Glu Phe Pro Tyr Ala Ile Arg Gln Val Ser Glu Ala Leu Gly
450 455 460
Ser Asn Gly Ser Thr Ser Met Gly Ser Val Cys Ala Ser Thr Leu Ala
465 470 475 480
Leu Leu Asn Ala Gly Val Pro Leu Lys Ala Pro Val Ala Gly Ile Ala
485 490 495
Met Gly Leu Val Ser Asp Asp Ile Gln Val Glu Gly Ala Val Asp Gly
500 505 510
Val Val Glu Arg Arg Phe Val Thr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Ala Glu
515 520 525
Asp Ala Phe Gly Asp Met Asp Phe Lys Val Ala Gly Thr Lys Asp Phe
530 535 540
Val Thr Ala Leu Gln Leu Asp Thr Lys Leu Asp Gly Ile Pro Ser Gln
545 550 555 560
Val Leu Ala Gly Ala Leu Glu Gln Ala Lys Asp Ala Arg Leu Thr Ile
565 570 575
Leu Glu Val Met Ala Glu Ala Ile Asp Arg Pro Asp Glu Met Ser Pro
580 585 590
Tyr Ala Pro Arg Val Thr Thr Ile Lys Val Pro Val Asp Lys Ile Gly
595 600 605
Glu Val Ile Gly Pro Lys Gly Lys Val Ile Asn Ala Ile Thr Glu Glu
610 615 620
Thr Gly Ala Gln Ile Ser Ile Glu Asp Asp Gly Thr Val Phe Val Gly
625 630 635 640
Ala Thr Asp Gly Pro Ser Ala Gln Ala Ala Ile Asp Lys Ile Asn Ala
645 650 655
Ile Ala Asn Pro Gln Leu Pro Thr Val Gly Glu Arg Phe Leu Gly Thr
660 665 670
Val Val Lys Thr Thr Asp Phe Gly Ala Phe Val Ser Leu Leu Pro Gly
675 680 685
Arg Asp Gly Leu Val His Ile Ser Lys Leu Gly Lys Gly Lys Arg Ile
690 695 700
Ala Lys Val Glu Asp Val Val Asn Val Gly Asp Lys Leu Arg Val Glu
705 710 715 720
Ile Ala Asp Ile Asp Lys Arg Gly Lys Ile Ser Leu Ile Leu Val Ala
725 730 735
Asp Glu Asp Ser Thr Ala Ala Ala Thr Asp Ala Ala Thr Val Thr Ser
740 745 750
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggggaagaa gttgaagtgt tctttgggg 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggaattcca tatgtctgcc gctgaaat 28
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccaagctta ttcggtgacc actcg 25

Claims (10)

1.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，所述方法不用于疾病的诊断，其特征在于，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。
2.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，所述方法不用于疾病的诊断，其特征在于，检测结核分枝杆菌基因Rv2783c的第199位碱基是否发生G突变为A的碱基突变。
3.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。
4.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测膜，其特征在于：该检测膜中含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。
5.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的PCR扩增引物。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述引物序列为：
Rv2783cF：5’-GGGAATTCCATATGTCTGCCGCTGAAAT-3’(SEQ ID NO：5)；
Rv2783cR：5’-CCCAAGCTTATTCGGTGACCACTCG-3’(SEQ ID NO：6)。
7.一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的蛋白，其特征在于：该蛋白序列为突变的蛋白Rv2783c序列，突变位点为第67位氨基酸天冬氨酸Asp突变为天冬酰胺Asn。
8.根据权利要求7所述的蛋白，其特征在于：该蛋白具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性，且其活性不受吡嗪酸的影响。
9.根据权利要求7所述的蛋白，其特征在于：该蛋白具有磷酸解单链DNA的活性。
10.一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的碱基序列，其特征在于：该序列为突变的基因Rv2783c序列，突变的位点为第199位碱基由G突变为A。
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