CN106191154A - 一种沙格列汀中间体(s)‑n‑叔丁氧羰基‑3‑羟基‑1‑金刚烷基‑d‑甘氨酸的生物制备方法 - Google Patents

一种沙格列汀中间体(s)‑n‑叔丁氧羰基‑3‑羟基‑1‑金刚烷基‑d‑甘氨酸的生物制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种沙格列汀中间体(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基‑1‑金刚烷基‑D‑甘氨酸的生物制备方法，属于生物制药领域。本发明公开了一种沙格列汀中间体(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基‑1‑金刚烷基‑D‑甘氨酸的生物制备方法，是以中间体Ⅰ（2‑（3‑羟基‑1‑金刚烷）‑2‑氧代乙酸）为底物，在氨基转移酶、辅酶、氨基供体和缓冲溶剂的存在下发生反应生成目标产物。此方法具有立体选择性强、产率高的优点，经多次实验，本发明所公开方法制备沙格列汀手性中间体Ⅱ的产率可达90%‑100%。

Description

一种沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷 基-D-甘氨酸的生物制备方法
技术领域
本发明涉及一种沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，属于生物制药领域。
背景技术
沙格列汀是一种高效二肽基肽酶-Ⅳ（Dipeptidyl Peptidase 4，DPP-4）抑制剂，通过选择性抑制DPP-4，可以升高内源性胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽水平，从而调节血糖。
沙格列汀的合成过程中，手性化合物中间体Ⅱ：
的合成是沙格列汀最关键的步骤之一。其中中间体Ⅱ的合成关键在于手性碳的引入，目前现有的合成方法主要有两种：
第一种是化学拆分法（WO2011117393 ；US2005090539 ；J.Med.Chem,2005,48,5025-5037），但是此种合成方法路线较长，总体合成效率不高；锂铝氢等化学试剂的使用造成成本较高，而且会产生较为严重的环境问题和后续处理问题。
第二种是酶催化氨化还原（WO2010032129 ；US2005090539 ；Advanced Synthesis＆ Catalysis,2007,349,1369-1378 ；Bioorganic.Med.Chem,2011,19(3),1136-1154 ；US2010291642），其采用苯丙氨酸脱氢酶合成沙格列汀中间体。与纯化学合成路线相比，酶催化生物转化法可以在纯水相进行，减少使用对人及环境有危害的催化剂，降低了废物的产生，环境友好性好；更重要地是，酶具有优异的立体选择性，中间产物不需要进行拆分，因此酶催化的生物转化可以有效提高产率和产品的光学纯度，具有极好的产业化潜力。
氨基转移酶氨属于转移酶类，通过催化一个氨基与酮基互换合成手性化合物。但是现有技术中尚未有人尝试采用转氨酶如何催化合成沙格列汀中间体，相关研究在现有公开文献中尚未见到。
发明内容
本发明的目的是找到一种或者多种可以用于催化合成沙格列汀中间体的转氨酶，并针对这些转氨酶开发出适合于它们催化合成沙格列汀中间体的具体反应条件和方法。
为了实现这些目的，本发明公开了一种沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，是以中间体Ⅰ（2-（3-羟基-1-金刚烷）-2-氧代乙酸）为底物，在氨基转移酶、辅酶、氨基供体和缓冲溶剂的存在下发生反应生成目标产物。
优选地，反应中氨基转移酶来源不包括Cv-ωTA Variant CNB05-01。
更为优选地，反应中氨基转移酶来源为Enterobacter sp. LT3的BcATen、Escherichia coli K12的BcATes、E.coli的AAT。
同时，我们进一步地公开，所述的氨基转移酶的制备方法为：将含有转氨酶的单菌落接种到含有氨苄抗性的液体培养基中活化，将活化好的工程菌转接到新的培养基中并加入诱导剂IPTG培养工程菌，从培养液中提取氨基转移酶。
在本发明所公开的反应中，所述的氨基供体优选为以下所示化合物中的一种或者多种，
。
优选地，氨基供体是以反复多次的方式加入反应体系中。这里所说的反复多次的方式是指首先加入一定量的氨基供体，待反应达到平衡状态后，再次加入一定量的氨基供体，如此反复。
优选地，每次加入氨基供体后反应维持5分钟左右即取出反应样品，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，从而判断反应平衡状态。
作为一种优选，所述的辅酶优选为磷酸吡哆醛。
并且，我们进一步优选限定反应体系在起始阶段，氨基转移酶、辅酶、氨基供体、以及中间体（３-羟基-１-金刚烷基）-２-羰基甲酸的质量比为（0.1-1.0）：（0.01-0.1）：（1-10）：1。
同时，我们优选在反应中所用的缓冲溶剂优选为水相缓冲液，其中特别地优选为磷酸盐缓冲液、Tris－HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液。
进一步地，我们还公开了优选的反应温度为0-40℃。
最后，我们还优选这一反应在搅拌条件下反应，搅拌转子的转速为100-220r/min。
本发明通过大量的创造性劳动，获得了可以在水溶液中制备沙格列汀手性中间体的转氨酶酶催化合成方法，此方法具有立体选择性强、产率高的优点，经多次实验，本发明所公开方法制备沙格列汀手性中间体Ⅱ的产率可达90%-100%。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
应该知晓的是，这些实施例是为了更好的说明和解释本发明，但并不能用来限制本发明。
同时，需要说明的是，在以下实施例中所使用的试剂、仪器、设备等材料除非有特别的声明或者说明，否则均为市面销售产品。
以下实施例中沙格列汀手性中间体Ⅱ采用高压液相色谱的检测方法：其具体的检测条件为：
色谱柱为C18 (4.6mm×250mm，55μm)，流动相为乙腈-0.06%三氟乙酸溶液(25:75)，流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10μL；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度55 ℃，雾化气体为空气，载气流速为2.0 L/min。
实施例1
在pH 6.0-10，0.2mol/L的PB缓冲液中，添加沙格列汀中间体Ⅰ的浓度为10mmol/L，氨基供体的浓度为20mmol/L，PLP为0.1-10mg。反应温度控制在转氨酶催化的最适温度0-40℃范围内，转速控制在100-220r/ min，因酶催化反应速率较快，反应进行5min后即取出反应样品，检测产物沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度。然后向体系补加一定体积的氨基供体，使反应正向进行；待反应平衡后，再次取样，检测产物浓度并补充一定体积的氨基供体；如此反复添加氨基供体，使最终测得沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度接近10mmol/L，最终检测产物沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ产率可达 90%-100%。
实施例2
以20mmol/L α-氨基戊二酸，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶Cv-ωTAVariant CNB05-01催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶Cv-ωTA Variant CNB05-01的用量为1U/mL，PLP 0.1 mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为0mmol/L。
实施例3
以20mmol/L α-氨基戊二酸，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶BcATen催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶BcATen的用量为1U/mL，PLP 0.1 mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的α-氨基戊二酸；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的α-氨基戊二酸；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为10mmol/L。
实施例4
以20mmol/L α-氨基戊二酸，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶BcATes催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶的用量为1U/mL，PLP 0.1mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的α-氨基戊二酸；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的α-氨基戊二酸；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为9.5mmol/L。
实施例5
以20mmol/L α-氨基戊二酸，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶AAT催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶的用量为1U/mL，PLP 0.1mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的α-氨基戊二酸；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的α-氨基戊二酸；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为9mmol/L。
实施例6
以20mmol/L苯乙胺，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶BcATen催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶BcATen的用量为1U/mL，PLP 0.1 mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的苯乙胺；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的苯乙胺；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为9.5mmol/L。
实施例7
以20mmol/L β-氨基丁酸，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶BcATen催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶BcATen的用量为1U/mL，PLP 0.1 mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的β-氨基丁酸；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的β-氨基丁酸；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为10mmol/L。
实施例8
以20mmol/L 3-氨基-3-苯基丙酸，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶BcATen催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶BcATen的用量为1U/mL，PLP 0.1 mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的3-氨基-3-苯基丙酸；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的3-氨基-3-苯基丙酸；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为9.5mmol/L。
实施例9
以20mmol/L丙胺，与浓度10mmol/L的沙格列汀中间体Ⅰ在转氨酶BcATen催化作用下进行反应。
反应条件为：pH 7.0，0.2mol/L的PB缓冲液体系，转氨酶BcATen的用量为1U/mL，PLP 0.1 mg，反应总体积1.5 mL，温度30℃，转速为140 r/min，待反应5min达到平衡后，取样 200μL，检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度；然后向体系补加100μL的丙胺；待反应平衡后，再次取样200μL，检测产物浓度并补充100μL的丙胺；如此反复添加5次；最终检测沙格列汀手性中间体Ⅱ的浓度，沙格列汀手性中间体Ⅱ的产物浓度为9mmol/L。

Claims (9)

1.一种沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，以中间体Ⅰ（2-（3-羟基-1-金刚烷）-2-氧代乙酸）为底物，在氨基转移酶、辅酶、氨基供体和缓冲溶剂的存在下发生反应生成目标产物。
2.根据权利要求1所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，反应中氨基转移酶来源不包括Cv-ωTA VariantCNB05-01。
3.根据权利要求1所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，反应中氨基转移酶来源为Enterobacter sp. LT3的BcATen、Escherichia coli K12的BcATes、E.coli的AAT。
4.根据权利要求2或3所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，氨基转移酶的制备方法为：将含有转氨酶的单菌落接种到含有氨苄抗性的液体培养基中活化，将活化好的工程菌转接到新的培养基中并加入诱导剂IPTG培养工程菌，从培养液中提取氨基转移酶。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，所述的氨基供体为以下所示化合物中的一种或者多种，
。
6.根据权利要求1所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，氨基供体是以反复多次的方式加入反应体系中。
7.根据权利要求1所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，所述的辅酶为磷酸吡哆醛。
8.根据权利要求1所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，反应体系在起始阶段，氨基转移酶、辅酶、氨基供体、以及中间体（３-羟基-１-金刚烷基）-２-羰基甲酸的质量比为（0.1-1.0）：（0.01-0.1）：（1-10）：1。
9.根据权利要求1所述的沙格列汀中间体(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基-1-金刚烷基-D-甘氨酸的生物制备方法，其特征是，反应条件优选为以下任意一个或者几个，
（1）pH为6.0-10.0；
（2）缓冲溶剂为水相缓冲液，其中特别地优选为磷酸盐缓冲液、Tris－HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液；
（3）反应温度为0-40℃；
（4）在搅拌条件下反应，搅拌转子的转速为100-220r/min。
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