CN106190841A - 一种神经网络电活动检测系统以及基于此系统的神经精神类药物的筛选方法 - Google Patents

一种神经网络电活动检测系统以及基于此系统的神经精神类药物的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种神经网络电活动检测系统以及基于此系统的神经精神类药物的筛选方法。该检测系统主要由体外构建的神经网络系统、光电信号转化系统以及监测与分析系统组成。在此基础上本发明的检测系统还可用于神经系统的理论研究以及潜在神经精神类药物的早期筛选和测试。本发明实现了体外构建神经网络，便于大规模制备，可建立病理神经网络模型，无需刺激介入，保持了神经网络自然的生理工作状态，可对网络电活动进行一定范围的调节与控制，可通过病毒引入药物靶点，将电信号转化为光信号，简化了采集系统，节约成本，容易实现高通量筛选，有针对性软件进行高通量数据分析，降低人工成本，具有极高的应用前景。

Description

一种神经网络电活动检测系统以及基于此系统的神经精神类 药物的筛选方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种神经网络电活动检测系统以及基于此系统的神经精神类药物的筛选方法。
背景技术
神经精神类疾病(包括神经退行性疾病，癫痫，抑郁，焦虑，精神分裂症，双相情感障碍，成瘾等)大约占到所有人类疾病的14％，波及全球总人口的2.5-3.0％，并且其发病率呈现逐年递增的趋势(The Lancet.2007,370,859；Plos Med.2006,3,e442)。由于神经系统本身的复杂性，基础理论的不完善，以及缺乏有效而可靠的筛选平台，神经精神类药物研发的周期和风险都明显高于其他类药物的研发(Neuron.2014,84,546)。统计结果表明，只有8％临床前测试合格的药物能够最终通过临床试验。因此很多制药公司近年来减少了神经精神类药物的研发投入以规避风险(Net Rev Drug Discov.2015,14,815)。然而，人类对于精神健康与优质生活的迫切需求又离不开更多更好的药物的支持。因此市场需要更准确和高效的临床前神经精神类药物评价平台以加快该类药物的研发速度。
目前对于神经精神类药物临床前的开发和筛选主要有以下四种方式(Neuron.2014,84,546；Net Rev Drug Discov.2015,14,815；神经药理学研究技术与方法.人民卫生出版社2015,ISBN:9787117066051)：
1.针对特定靶点的生化水平筛选。
该方法主要基于我们对于神经系统特定受体的认识来筛选能与该受体相互作用的化合物。例如：如果研究表明某种受体具有治疗某种疾病的作用，那么理论上那些能与该受体相互作用的化合物就具有开发成药物的潜质。该方法缺点：1)理论层面缺乏有效支撑。由于神经元和受体亚型的多样性以及表达水平的差异，特定受体在神经系统中的作用并不十分明确。其次，对于绝大多数神经精神疾病，我们目前也缺乏有效而确实的药物靶点，因此即使化合物与受体有明确相互作用也无法预测其在神经系统的功能；2)漏检率非常高。由于该筛选系统只针对特定靶点进行结合率测试，并不能发现新的靶点。另外，由于化合物往往结合多种受体，单纯检测化合物对待检受体的结合能力并不能排除化合物是否与其他受体也有相互作用。
2.细胞水平筛选
该方法通过在体外培养神经细胞，通过检测药物对神经细胞形态或分子指标的影响(例如生存率，特定蛋白水平等等)来评价药效。该技术优点在于高通量，可重复性高。但由于绝大部分神经系统疾病在蛋白或基因水平并没有可靠的标记物，因此检测指标比较模糊，指导性差，并非功能性筛选。
3.动物行为学筛选。
该方法主要通过在体建立动物病理模型来模拟人类疾病，然后测试药物对动物的特定的行为范式的影响来观察药效。该技术的缺点在于：1)动物的神经系统不同于人类。对于高级认知功能疾病(例如精神分裂症，自闭症等)无法进行有效模拟；2)周期长，稳定性差；3)对待选药物作用机理无明确指导意义。
4.针对神经元电活动的筛选。
神经系统是由大量神经元相互连接形成的功能性网络。神经元之间通过电活动和化学递质进行交流并发挥功能。该方法主要利用该性质通过电生理手段(胞外记录，膜片钳等)来测试药物对神经电活动的影响。该技术属于神经系统功能性筛选，敏感性很高，稳定，可重复性好。但现有技术系统复杂，成本极高，效率低，需要继续改进优化。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种神经网络电活动的检测系统以及基于此系统的神经精神类药物的筛选方法。该检测系统通过体外建立神经网络并使其产生自发电活动来模拟神经系统的生理病理状态，克服依赖外部刺激诱发神经元电活动的方式。将特定神经元电活动信号转换成光信号，简化目前神经元电活动监测所需的复杂技术与专业设备，实现大规模神经元在单细胞水平电活动的监测与分析。同时本发明可用于神经系统的理论研究以及潜在神经精神类药物的早期筛选和测试。
本发明采用以下技术方案：
一种神经网络电活动检测系统，它是由体外构建的神经网络系统、光电信号转化系统以及监测与分析系统组成；
所述体外构建的神经网络系统是采用下述方法构建而成：
A.从新生小鼠脑内获得原代神经元
1)全程手术在无菌条件下进行，根据实验需要，神经元可以取自皮层，海马，纹状体，中脑或多脑区混合；
2)将新生小鼠，2-3只一组，用70％酒精涂布消毒，在冰上放置5分钟后断头，取脑，解剖镜下取相应脑区组织并置于0-4℃HBS缓冲液中，10ml/2只小鼠；
3)用HBS缓冲液清洗脑组织2次，加入组织裂解液并置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中静置20分钟；
4)真空吸除组织裂解液并用MEM缓冲液润洗组织2次；
5)向组织中按照2ml/2只小鼠的量加入铺板缓冲液并用移液器吹打40次；
6)用细胞滤器过滤组织悬浮液获得悬浮原代神经元；
B.原代神经元铺板
1)将盖玻片采用细胞外基质涂布表面，然后置于37℃，5％CO2的培养箱1小时；
2)表面处理结束后将A步骤所得悬浮原代神经元均匀铺板到盖玻片上，细胞密度200-1000/mm2，然后置于培养箱中静置1小时；
3)加入铺板缓冲液，置于培养箱中；
C.后续处理
1)铺板后12小时，更换所有铺板缓冲液为生长缓冲液；
2)铺板后48-72小时，每间隔2小时检查胶质细胞密度，在胶质细胞生长密度为60％-80％时加入1-4μM阿糖胞苷；
3)铺板后第3-5天，进行病毒感染；
4)6-10天，成熟突触形成，神经网络生长；
5)14天后，网络成熟，体外神经网络系统构建完成；
所述光电信号转化系统是采用下述方法进行的：
1)病毒设计：通过分子克隆手段改造慢病毒或腺病毒载体，采用Synapsin启动子使目标蛋白只在神经元而不在胶质细胞中表达，采用2A表达系统同时表达tdTomato红色荧光蛋白和钙离子指示剂蛋白，二者的表达量严格遵照1:1，红色荧光蛋白用来指示单个神经元位置，钙离子指示剂蛋白用来检测电活动；
2)病毒制备：采用磷酸钙转染法在HEK293细胞系中共转载体质粒和包装质粒，600ug DNA/75ml培养皿，转染时HEK293细胞密度60-70％，第二天更换为生长缓冲液；对于慢病毒，转染72小时后收集上清液获得病毒备用；对于腺病毒，转染72小时后收集HEK293细胞胞体，以冻融法裂解即在37℃/-40℃孵育3次，每次10min，离心后加入DNA/RNA酶，在37℃下孵育30分钟，取上清液获得病毒备用；所获病毒经过0.2μm滤膜过滤后分装，置于-80℃冻存；
3)病毒感染：原代神经元铺板后3-5天，加入50-100μl/ml步骤2)制备好的病毒，使病毒最终滴度在108-1012VP/ml；
4)病毒感染后3-5天，目标蛋白开始表达，荧光显微镜下可看到红色荧光蛋白标记的单个神经元；
所述监测与分析系统由视频采集和数据处理两部分构成；
所述HBS缓冲液的pH为7.3；
所述组织裂解液以配置10ml的量计，是由以下组分配置而成：
10ml HBS缓冲液
10ul 0.5M EDTA pH8.0
10ul 1M CaCl2
100ul木瓜蛋白酶
100ul脱氧核糖核酸酶；
所述铺板缓冲液，以1L的量计，是由以下组分制备而成：
900ml MEM缓冲液
25ml 20％的葡萄糖
2.5ml 8％NaHCO3
100mg转铁蛋白
100ml FBS
10ml 200mM L-谷氨酰胺
25mg胰岛素；
所述生长缓冲液，以1L的量计，是由以下组分制备而成：
900ml MEM缓冲液
25ml 20％的葡萄糖
2.5ml 8％NaHCO3
100mg转铁蛋白
50ml FBS
20ml细胞培养添加剂B 27
2.5ml 200mM L-谷氨酰胺。
所述视频采集的具体方法如下：
1)在铺板后15-18天，取出载有构建好的神经网络的盖玻片并置于标准细胞外液中静置10分钟，采用恒温装置控制温度在25-30℃；
2)将神经网络置于荧光显微镜下，采用4x物镜，视野范围2mm x 2mm，囊括200-400个神经元，采用EMCCD或CMOS系统成像，采用470nm LED或488nm激光激活钙指示剂蛋白；
3)采用晶体管逻辑电路同步控制光源和图像采集系统，曝光时间100-500ms，采集频率2.5s/帧，采集系统最终生成TIFF格式文件，单图像素2048x2048；
4)采用以上方法记录网络基础电活动1小时；
所述标准细胞外液配方为：140mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，2mM CaCl2，10mMHEPES，10mM葡萄糖，pH为7.4。
所述数据处理具体方法为：
1)采用卢卡斯-卡那德算法对采集的图像进行稳定化处理以消除长时间记录产生的位移；
2)减除图像背景；
3)采用二维大津展之算法对个体神经元进行物体识别并生成待分析位置坐标集；
4)对每个神经元荧光强度进行分析生成时相图；
5)对时相图进行统计分析，主要分析内容包括：放电强度，放电时程，震荡频率，总体电活动量，单神经元之间相关性，单神经元放电出峰时间点，出峰速度，震荡活动传播路径，传播速度，个体神经元非震荡自发活动10个指标。
一种利用上述的神经网络电活动检测系统对神经精神类药物的筛选方法，它是在监测与分析系统中视频采集部分中记录网络基础电活动结束后，加入待测药物后，继续采用同样的方法记录神经网络系统电活动情况并根据系统方法对数据进行处理，比较给药前后的时相图分析数据得出药物筛选结果，根据所筛选药物目的的不同调控神经网络系统的基础震荡电活动，具体调控方法如下：
1)调节标准细胞外液的钙离子浓度在1-8mM以控制信号强度和网络传导效率；
2)调节标准细胞外液中镁离子浓度在0-4mM以控制NMDA受体的开放率，进而控制网络兴奋度；
3)调节标准细胞外液中钾离子浓度在0-40mM以控制神经元膜电位；
4)加入特定受体激动剂或阻断剂以控制网络活动，这些受体和通道包括：乙酰胆碱受体、多巴胺受体、谷氨酸受体、GABA受体、钙离子通道、钾离子通道、钠离子通道、激酶。
本发明的理论基础为：人类的神经系统是由大量神经元(～1011)和胶质细胞(～1014)相互连接而组成的复杂网络。神经元的基本活动模式是产生动作电位(一种短时程的放电行为；一般持续1-5ms)。单个神经元通过树突接收上一级神经元传入的信息并加以计算和整合，然后通过产生动作电位将信号传入下一级神经元。神经系统的正常工作依赖各神经元之间的相互协调和流畅交流。而神经元之间的交流又受到多种因素的控制与调节：例如离子通道开放程度，受体表达量和激活程度，递质调质水平等都会对神经元的电活动产生明显影响。
神经精神类疾病是一类以表现在行为，心理活动上的紊乱为主的神经系统疾病。它们病因往往多种多样：有的是由于神经系统的衰退或特定神经元的死亡(例如：老年痴呆和帕金森氏病)；有的则是由于神经系统的发育或连接异常(例如：癫痫和自闭症)；还有的是由于递质或受体水平的功能性失调(例如：精神分裂症和成瘾)。但无论这些疾病产生的原因如何，它们的共同特征都是神经元之间不能够正常交流。而对抗这些疾病的药物无一例外地需要通过影响神经元在网络层面的电活动而发挥治疗作用。目前对于神经网络电活动的研究主要依赖电生理方法(例如膜片钳，胞外记录，脑电记录等)。这些手段由于技术复杂，难以实现对潜在药物的高通量筛选。因此一种快速准确地评价化合物或生物制品对神经网络电活动影响的方法对于促进神经精神类药物开发具有重要意义。
本发明采用离体培养神经元的方法构建神经网络。神经元在体外特定条件下生长可以相互之间形成突触进而组成网络。当网络连接达到一定规模又有起搏神经元存在的时候，体外神经网络可以产生自发震荡活动(一种有规律的集群放电行为)。一旦网络震荡活动形成，体外神经网络就可以在无外界干预(刺激)的情况下进行信息整合与计算。利用该性质，我们在体外大规模构建拥有功能性电活动的神经网络。神经元的基本活动单位是动作电位(由钠，钙离子跨膜运动产生)。伴随动作电位产生的是大量钙离子的内流。由于钙离子水平与神经元电活动水平正相关，而钙离子在神经元内的浓度可以通过钙离子指示剂进行量化。钙离子指示剂是一种能够结合钙离子的荧光染料，有的是化学试剂，有的是蛋白质。这些指示剂在结合钙离子后光谱性质会发生改变(例如荧光增强)。基于这一原理，我们通过钙离子指示剂将神经元的电活动转化为光信号。本发明采用病毒感染神经元引入钙离子指示剂蛋白(GCaMP6，2013年问世，是目前世界上敏感性最高的指示剂蛋白，这种蛋白在结合钙离子后荧光强度增强)来转化电信号。在将神经元电活动变成光信号之后，神经元的电活动可通过荧光显微镜成像系统进行采集生成视频资料。本发明优化了光学采集系统，可以大规模监测神经元活动，生成视频资料。在此基础上本发明开发了相关软件对视频资料进行有针对性地分析。并利用本系统对潜在的神经精神类药物进行早期筛选和测试。
除此之外，本发明的功能和应用范围可在多方面进行拓展：首先，体外神经网络构建也可以直接采用GCaMP6转基因小鼠制备，这样可以省略病毒感染步骤。钙离子成像也可以采用化学染料替代。为实现靶向药物筛选，本发明可以通过病毒在特定神经元表达待选药物靶点，这些靶点可以是受体，离子通道或酶。
为实现针对特定疾病的药物筛选，需要模拟病理状态下的神经网络电活动。本发明主要采取以下措施来构建病理神经网络。
1)直接从病理模型动物体内获得原代神经元进行培养形成病理网络。
2)利用病毒系统(主要是慢病毒和腺病毒)感染健康神经元并导入特定致病基因。
3)在正常神经网络中加入特定药物或改变离子环境，温度，pH等。
本发明的有益效果是：1)体外构建神经网络，便于大规模制备。2)可建立病理神经网络模型。3)无需刺激介入，保持了神经网络自然的生理工作状态。4)可对网络电活动进行一定范围的调节与控制。5)可通过病毒引入药物靶点。6)将电信号转化为光信号，简化了采集系统，节约成本。7)容易实现高通量筛选。8)有针对性软件进行高通量数据分析，降低人工成本。
附图说明
图1是本发明检测系统的基本组成与工作流程示意图。图中(第1-5天)为铺板后各个时间点的神经元形态(白光照射)。第14天图为红色荧光蛋白荧光成像图，图中可见单个神经元以及发育完成的轴突和树突。第15-18天图为钙离子指示剂蛋白(GCaMP6)成像示例。上边为静息状态，下边为神经元放电状态。图像分析所示为神经元相关性分析矩阵。
图2是本发明实施例1构建的成熟的神经网络采用免疫荧光细胞化学方法对所示蛋白的激光共聚焦成像图。
图3是本发明实施例1构建的成熟的神经网络的自发电活动钙离子指示剂蛋白成像示例图。其中原始图像(上)和放大图片(下)，曝光时间400ms。
图4是本发明实施例2中监测与分析系统的数据处理工作流程图。
图5是本发明构建的神经活动检测系统用于药物筛选时调控震荡电活动实例结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的详细说明。
实施例1
一种神经网络电活动检测系统，它是由体外构建的神经网络系统、光电信号转化系统以及监测与分析系统组成，具体组成与工作流程示意图如图1所示；
所述体外构建的神经网络系统是采用下述方法构建而成：
A.从新生小鼠脑内获得原代神经元
1)全程手术在无菌条件下进行，根据实验需要，神经元可以取自皮层，海马，纹状体，中脑或多脑区混合；
2)将新生小鼠，2-3只一组，用70％酒精涂布消毒，在冰上放置5分钟后断头，取脑，解剖镜下取相应脑区组织并置于0-4℃HBS缓冲液中，10ml/2只小鼠；
3)用HBS缓冲液清洗脑组织2次，加入组织裂解液并置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中静置20分钟；
4)真空吸除组织裂解液并用MEM缓冲液润洗组织2次；
5)向组织中按照2ml/2只小鼠的量加入铺板缓冲液并用移液器吹打40次；
6)用细胞滤器过滤组织悬浮液获得悬浮原代神经元；
B.原代神经元铺板
1)将盖玻片采用细胞外基质涂布表面，然后置于37℃，5％CO2的培养箱1小时；
2)表面处理结束后将A步骤所得悬浮原代神经元均匀铺板到盖玻片上，细胞密度200-1000/mm2，然后置于培养箱中静置1小时；
3)加入铺板缓冲液，置于培养箱中；
C.后续处理
1)铺板后12小时，更换所有铺板缓冲液为生长缓冲液；
2)铺板后48-72小时，每间隔2小时检查胶质细胞密度，在胶质细胞生长密度为60％-80％时加入1-4μM阿糖胞苷；
3)铺板后第3-5天，进行病毒感染；
4)6-10天，成熟突触形成，神经网络生长；
5)14天后，网络成熟，体外神经网络系统构建完成；
所述光电信号转化系统是采用下述方法进行的：
1)病毒设计：通过分子克隆手段改造慢病毒或腺病毒载体，采用Synapsin启动子使目标蛋白只在神经元而不在胶质细胞中表达，采用2A表达系统同时表达tdTomato红色荧光蛋白和钙离子指示剂蛋白，二者的表达量严格遵照1:1，红色荧光蛋白用来指示单个神经元位置，钙离子指示剂蛋白用来检测电活动；
2)病毒制备：采用磷酸钙转染法在HEK293细胞系中共转载体质粒和包装质粒，600ug DNA/75ml培养皿，转染时HEK293细胞密度60-70％，第二天更换为生长缓冲液；对于慢病毒，转染72小时后收集上清液获得病毒备用；对于腺病毒，转染72小时后收集HEK293细胞胞体，以冻融法裂解即在37℃/-40℃孵育3次，每次10min，离心后加入DNA/RNA酶，在37℃下孵育30分钟，取上清液获得病毒备用；所获病毒经过0.2μm滤膜过滤后分装，置于-80℃冻存；
3)病毒感染：原代神经元铺板后3-5天，加入50-100μl/ml步骤2)制备好的病毒，使病毒最终滴度在108-1012VP/ml；
4)病毒感染后3-5天，目标蛋白开始表达，荧光显微镜下可看到红色荧光蛋白标记的单个神经元；
所述监测与分析系统由视频采集和数据处理两部分构成；
所述HBS缓冲液的pH为7.3；
所述组织裂解液以配置10ml的量计，是由以下组分配置而成：
10ml HBS缓冲液
10ul 0.5M EDTA pH8.0
10ul 1M CaCl2
100ul木瓜蛋白酶
100ul脱氧核糖核酸酶；
所述铺板缓冲液，以1L的量计，是由以下组分制备而成：
900ml MEM缓冲液
25ml 20％的葡萄糖
2.5ml 8％NaHCO3
100mg转铁蛋白
100ml FBS
10ml 200mM L-谷氨酰胺
25mg胰岛素；
所述生长缓冲液，以1L的量计，是由以下组分制备而成：
900ml MEM缓冲液
25ml 20％的葡萄糖
2.5ml 8％NaHCO3
100mg转铁蛋白
50ml FBS
20ml细胞培养添加剂B 27
2.5ml 200mM L-谷氨酰胺。
所述视频采集的具体方法如下：
1)在铺板后15-18天，取出载有构建好的神经网络的盖玻片并置于标准细胞外液中静置10分钟，采用恒温装置控制温度在25-30℃；
2)将神经网络置于荧光显微镜下，采用4x物镜，视野范围2mm x 2mm，囊括200-400个神经元，采用EMCCD或CMOS系统成像，采用470nm LED或488nm激光激活钙指示剂蛋白；
3)采用晶体管逻辑电路同步控制光源和图像采集系统，曝光时间100-500ms，采集频率2.5s/帧，采集系统最终生成TIFF格式文件，单图像素2048x2048；
4)采用以上方法记录网络基础电活动1小时；
所述标准细胞外液配方为：140mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，2mM CaCl2，10mMHEPES，10mM葡萄糖，pH为7.4。
所述数据处理具体方法为：
1)采用卢卡斯-卡那德算法对采集的图像进行稳定化处理以消除长时间记录产生的位移；
2)减除图像背景；
3)采用二维大津展之算法对个体神经元进行物体识别并生成待分析位置坐标集；
4)对每个神经元荧光强度进行分析生成时相图；
5)对时相图进行统计分析，主要分析内容包括：放电强度，放电时程，震荡频率，总体电活动量，单神经元之间相关性，单神经元放电出峰时间点，出峰速度，震荡活动传播路径，传播速度，个体神经元非震荡自发活动10个指标。
本发明在构建好成熟的神经网络系统后，采用免疫荧光细胞化学方法对所示蛋白的激光共聚焦成像，如图2所示，图中PQ型钙通道是神经突触特有的钙离子通道，γ-氨基丁酸囊泡转运体是抑制性神经元突触标记物，谷氨酸囊泡转运体是兴奋性突触标志物。这些蛋白的存在表明体外神经网络已经具有完备的突触结构。由于突触是神经元之间联系的基本单位，大量突触的形成表明体外神经网络已经具有了相当的复杂程度。
此外，本发明还研究了该系统中体外神经网络自发电活动情况，具体结果如图3所示。由该图可见，体外构建的神经网络在静息状态下有少量神经元存在自发电活动(左；明亮的点状物体)。每间隔一段时间(3-10min)，神经网络会爆发一次集群放电(中；大量神经元变亮)。这些活动可以被河豚毒素(钠通道阻断剂，可以阻断神经元动作电位发放)完全阻断(右)说明钙信号依赖动作电位。这同时也说明记录到的钙信号所代表的是网络电活动。
实施例2
一种利用实施例1所述的神经网络电活动检测系统对神经精神类药物的筛选方法，它是在监测与分析系统中视频采集部分中记录神经网络基础电活动结束后，加入待测药物，然后继续采用同样的方法记录神经网络系统电活动情况并根据系统方法对数据进行处理，比较给药前后的时相图分析数据得出药物筛选结果，根据所筛选药物目的的不同调控神经网络系统的基础震荡电活动，具体调控方法如下：
1)调节标准细胞外液的钙离子浓度在1-8mM以控制信号强度和网络传导效率；
2)调节标准细胞外液中镁离子浓度在0-4mM以控制NMDA受体的开放率，进而控制网络兴奋度；
3)调节标准细胞外液中钾离子浓度在0-40mM以控制神经元膜电位；
4)加入特定受体激动剂或阻断剂以控制网络活动，这些受体和通道包括：乙酰胆碱受体、多巴胺受体、谷氨酸受体、GABA受体、钙离子通道、钾离子通道、钠离子通道、激酶。
本发明药物筛选过程中，具体的数据处理的工作流程如图4所示。图中1为原始图像示例，图中每个亮点是一个神经元。采用卢卡斯-卡那德(Lucas-Kanade)算法对采集的图像进行稳定化处理以消除长时间记录产生的位移。2.为减除图像背景后，采用二维大津展之算法(2D-OTsu's method)对个体神经元进行物体识别生成二进制图像。黑色点状物体是识别后的个体神经元。3.根据所识别到的神经元坐标生成待分析位置坐标集。4.对每个量化区域荧光强度进行分析生成时相图。例如：采用0.4Hz采集图像5小时，这样会生成7200张高分辨率照片，对这7200张照片相应区域进行量化，然后以量化值为纵坐标，采集时间点为横坐标作图则得到时相图。5.计算机统计分析后对待测药物生成的统计报告示例。比较给药前(空心圆)后(实心圆)数据。
本发明可针对药物筛选目标的不同，对基础震荡电活动进行调控。例如，采用苦味毒(阻断抑制性传递的药物)加入在该神经网络中，结果如图5所示，该药物可以明显增强放电活动强度和频率。在实际操作中，本发明利用该药物增强信号和制造病理模型(这种药物是在体制造癫痫动物模型的工具药)。
由于筛选的目的不同，特定待选药物所观察的指标也会有所侧重。例如：筛选抗癫痫药物时希望基础震荡活动较强，这样药物的作用更容易体现，从而也提高了系统的敏感度。这就要求我们必须能够对震荡指标加以调控。本发明可以实现对基础震荡活动的调控，来提高系统的敏感度，因而可以很好的实现对神经精神类药物的筛选。

Claims (4)

1.一种神经网络电活动检测系统，其特征在于，它是由体外构建的神经网络系统、光电信号转化系统以及监测与分析系统组成；
所述体外构建的神经网络系统是采用下述方法构建而成：
A.从新生小鼠脑内获得原代神经元
1)全程手术在无菌条件下进行，根据实验需要，神经元可以取自皮层，海马，纹状体，中脑或多脑区混合；
2)将新生小鼠，2-3只一组，用70％酒精涂布消毒，在冰上放置5分钟后断头，取脑，解剖镜下取相应脑区组织并置于0-4℃HBS缓冲液中，10ml/2只小鼠；
3)用HBS缓冲液清洗脑组织2次，加入组织裂解液并置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中静置20分钟；
4)真空吸除组织裂解液并用MEM缓冲液润洗组织2次；
5)向组织中按照2ml/2只小鼠的量加入铺板缓冲液并用移液器吹打40次；
6)用细胞滤器过滤组织悬浮液获得悬浮原代神经元；
B.原代神经元铺板
1)将盖玻片采用细胞外基质涂布表面，然后置于37℃，5％CO2的培养箱1小时；
2)表面处理结束后将A步骤所得悬浮原代神经元均匀铺板到盖玻片上，细胞密度200-1000/mm2，然后置于培养箱中静置1小时；
3)加入铺板缓冲液，置于培养箱中；
C.后续处理
1)铺板后12小时，更换所有铺板缓冲液为生长缓冲液；
2)铺板后48-72小时，每间隔2小时检查胶质细胞密度，在胶质细胞生长密度为60％-80％时加入1-4μM阿糖胞苷；
3)铺板后第3-5天，进行病毒感染；
4)6-10天，成熟突触形成，神经网络生长；
5)14天后，网络成熟，体外神经网络系统构建完成；
所述光电信号转化系统是采用下述方法进行的：
1)病毒设计：通过分子克隆手段改造慢病毒或腺病毒载体，采用Synapsin启动子使目标蛋白只在神经元而不在胶质细胞中表达，采用2A表达系统同时表达tdTomato红色荧光蛋白和钙离子指示剂蛋白，二者的表达量严格遵照1:1，红色荧光蛋白用来指示单个神经元位置，钙离子指示剂蛋白用来检测电活动；
2)病毒制备：采用磷酸钙转染法在HEK293细胞系中共转载体质粒和包装质粒，600ugDNA/75ml培养皿，转染时HEK293细胞密度60-70％，第二天更换为生长缓冲液；对于慢病毒，转染72小时后收集上清液获得病毒备用；对于腺病毒，转染72小时后收集HEK293细胞胞体，以冻融法裂解即在37℃/-40℃孵育3次，每次10min，离心后加入DNA/RNA酶，在37℃下孵育30分钟，取上清液获得病毒备用；所获病毒经过0.2μm滤膜过滤后分装，置于-80℃冻存；
3)病毒感染：原代神经元铺板后3-5天，加入50-100μl/ml步骤2)制备好的病毒，使病毒最终滴度在108-1012VP/ml；
4)病毒感染后3-5天，目标蛋白开始表达，荧光显微镜下可看到红色荧光蛋白标记的单个神经元；
所述监测与分析系统由视频采集和数据处理两部分构成；
所述HBS缓冲液的pH为7.3；
所述组织裂解液以配置10ml的量计，是由以下组分配置而成：
10ml HBS缓冲液
10ul 0.5M EDTA pH8.0
10ul 1M CaCl2
100ul木瓜蛋白酶
100ul脱氧核糖核酸酶；
所述铺板缓冲液，以1L的量计，是由以下组分制备而成：
900ml MEM缓冲液
25ml 20％的葡萄糖
2.5ml 8％NaHCO3
100mg转铁蛋白
100ml FBS
10ml 200mM L-谷氨酰胺
25mg胰岛素；
所述生长缓冲液，以1L的量计，是由以下组分制备而成：
900ml MEM缓冲液
25ml 20％的葡萄糖
2.5ml 8％NaHCO3
100mg转铁蛋白
50ml FBS
20ml细胞培养添加剂B 27
2.5ml 200mM L-谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的神经网络电活动检测系统，其特征在于，所述视频采集的具体方法如下：
1)在铺板后15-18天，取出载有构建好的神经网络的盖玻片并置于标准细胞外液中静置10分钟，采用恒温装置控制温度在25-30℃；
2)将神经网络置于荧光显微镜下，采用4x物镜，视野范围2mm x 2mm，囊括200-400个神经元，采用EMCCD或CMOS系统成像，采用470nm LED或488nm激光激活钙指示剂蛋白；
3)采用晶体管逻辑电路同步控制光源和图像采集系统，曝光时间100-500ms，采集频率2.5s/帧，采集系统最终生成TIFF格式文件，单图像素2048x2048；
4)采用以上方法记录网络基础电活动1小时；
所述标准细胞外液配方为：140mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，2mM CaCl2，10mM HEPES，10mM葡萄糖，pH为7.4。
3.根据权利要求1所述的神经网络电活动监测系统，其特征在于，所述数据处理具体方法为：
1)采用卢卡斯-卡那德算法对采集的图像进行稳定化处理以消除长时间记录产生的位移；
2)减除图像背景；
3)采用二维大津展之算法对个体神经元进行物体识别并生成待分析位置坐标集；
4)对每个神经元荧光强度进行分析生成时相图；
5)对时相图进行统计分析，主要分析内容包括：放电强度，放电时程，震荡频率，总体电活动量，单神经元之间相关性，单神经元放电出峰时间点，出峰速度，震荡活动传播路径，传播速度，个体神经元非震荡自发活动10个指标。
4.一种利用权利要求1-3所述的神经网络电活动检测系统对神经精神类药物的筛选方法，其特征在于，它是在监测与分析系统中视频采集部分中记录网络基础电活动结束后，加入待测药物后，继续采用同样的方法记录神经网络系统电活动情况并根据系统方法对数据进行处理，比较给药前后的时相图分析数据得出药物筛选结果，根据所筛选药物目的的不同调控神经网络系统的基础震荡电活动，具体调控方法如下：
1)调节标准细胞外液的钙离子浓度在1-8mM以控制信号强度和网络传导效率；
2)调节标准细胞外液中镁离子浓度在0-4mM以控制NMDA受体的开放率，进而控制网络兴奋度；
3)调节标准细胞外液中钾离子浓度在0-40mM以控制神经元膜电位；
4)加入特定受体激动剂或阻断剂以控制网络活动，这些受体和通道包括：乙酰胆碱受体、多巴胺受体、谷氨酸受体、GABA受体、钙离子通道、钾离子通道、钠离子通道、激酶。
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