CN106124716A - 一种克伦特罗快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种克伦特罗快速检测方法，包括如下的步骤：在Fe3O4@Au表面修饰上三聚氰胺；在脂质体合成的过程中原位包裹葡萄糖，同时通过衍生化反应将三聚氰胺修饰到脂质体的表面；将第一步和第二步中制得的材料混合，加入克伦特罗样品，由于三聚氰胺与克伦特罗之间的作用，形成三明治的夹心结构；加入表面活性剂，使脂质体结构裂解，葡萄糖得以释放，借助血糖仪检测上清液完成定量检测。本方法中的传感器构建过程和检测过程不需要昂贵的仪器和试剂，操作简单，灵敏度很高。

Description

一种克伦特罗快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种克伦特罗快速检测方法，具体涉及一种基于脂质体和血糖仪的克伦特罗快速检测方法。
背景技术
克伦特罗为肾上腺素类神经兴奋剂，常用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病。克仑特罗能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉，特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成，加快生长速度，提高瘦肉的含量。克伦特罗化学性质稳定，高温难以分解，难以代谢清除，会影响肌肉蛋白质代谢、脂肪代谢及肝脏中的糖代谢，严重影响动物正常的生长发育。食用含有克伦特罗残留的肉，会引起血压升高、血管扩张、心跳加快、呼吸加剧，产生恶心、呕吐、头晕、乏力和肌肉颤抖甚至不能站立等现象，给患者的精神、健康及正常生活造成严重危害。近年来现场检测装置由于能及时反应检测信息而被广泛应用于医疗和环境的快速实时检测。现有技术中检测克伦特罗的方法有液相色谱法、比色法、表面增强拉曼散射法、电化学法、ELISA法、表面等离子体共振法等。这些方法中，有些灵敏度不高，有些需要依赖昂贵的仪器、专业的操作人员，有些过程很繁琐。因此，发展一种简单、快速、廉价、高灵敏的克伦特罗检测方法具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克伦特罗快速检测方法，本方法中的传感器构建过程和检测过程不需要昂贵的仪器和试剂，操作简单，灵敏度很高。本发明通过以下的技术方案来实现：
本发明还提供了一种克伦特罗快速检测方法，包括如下的步骤：
（1）在Fe3O4@Au表面修饰上三聚氰胺；
（2）在脂质体合成的过程中原位包裹葡萄糖，同时通过衍生化反应将三聚氰胺修饰到脂质体的表面；
（3）将第一步和第二步中制得的材料混合，加入克伦特罗样品，由于三聚氰胺与克伦特罗之间的作用，形成三明治的夹心结构；
（4）第四步，加入表面活性剂，使脂质体结构裂解，葡萄糖得以释放，借助血糖仪检测上清液完成定量检测。
优选的，具体包括如下的步骤：
1）将200 mL三聚氰胺溶液加入2 mL Fe3O4@Au中，搅拌均匀后，室温孵育6 h；
2）15.9 mmol/L氢化大豆磷脂，6.4 mmol/L胆固醇，0.2 mmol/L衍生化处理的三聚氰胺依次溶解到氯仿、异丙醇醚和甲醇的混合溶剂中；然后将0.5 mL的5.0 mg/mL葡萄糖溶液加入5 mL上述合成脂质体的混合物中，超声5 min后，在氮气气氛保护下，以45oC的温度蒸发溶剂，制得凝胶状的悬浮液；用200 nm的聚碳酸酯过滤膜过滤，得到尺寸均一的脂质体；未包裹的葡萄糖用纯水透析1.5-5 h，制得包裹有葡萄糖的、同时表面修饰了三聚氰胺的功能化脂质体；
3）将50 mL 步骤一中制得的Fe3O4@Au与pH 7.0的克伦特罗溶液在室温条件下，孵育30min，PBS溶液洗涤2次后，加入50 mL步骤二中制得的功能化脂质体，继续孵育30 min，PBS溶液洗涤2次；
4）在步骤三制得的溶液中加入20 mL表面活性剂，反应15 min，葡萄糖从破裂的脂质体结构中释放；取3 mL上清液用于血糖仪的检测。
优选的，所述三聚氰胺溶液浓度为1 mmol/L；所述氢化大豆磷脂和胆固醇的浓度分别为15.9 mmol/L和6.4 mmol/L。
优选的，所述氯仿、异丙醇醚和甲醇的混合溶剂中各组分的体积比为6：6：1。
优选的，所述表面活性剂PBSTw-1X。
本发明旨在通过脂质体原位包裹葡萄糖进行信号放大，利用克伦特罗与三聚氰胺间的特殊作用，结合磁性富集的优势，构建一种可以现场快速、高灵敏检测克伦特罗的新型血糖仪平台，其检测限可低至5 pM；小分子物质检测使用了直观性强、检测灵敏度高的夹心法；传感器的构建过程中无需使用抗体等昂贵试剂，使用特定化学反应代替抗体抗原之间的反应，降低了传感器构建成本，同时保证了较高的特异性和选择性。此外，本发明中磁珠的使用，简化了材料的洗涤过程，利用其富集作用，也在一定程度上提高检测的灵敏度；利用脂质体良好的生物相容性、高负载效率、尺寸可调和易功能化的特点，起到信号放大的效果。本发明中提供的检测方法具有操作简单、成本低、灵敏度高等特点；同时传感器的构建和使用过程中不需要依赖大型仪器以及专业的操作人员，可广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1
本实施例提供了一种克伦特罗快速检测方法，包括如下的步骤：
1）将200 mL三聚氰胺溶液加入2 mL Fe3O4@Au中，搅拌均匀后，室温孵育6 h；
2）15.9 mmol/L氢化大豆磷脂，6.4 mmol/L胆固醇，0.2 mmol/L衍生化处理的三聚氰胺依次溶解到氯仿、异丙醇醚和甲醇的混合溶剂中；然后将0.5 mL的5.0 mg/mL葡萄糖溶液加入5 mL上述合成脂质体的混合物中，超声5 min后，在氮气气氛保护下，以45oC的温度蒸发溶剂，制得凝胶状的悬浮液；用200 nm的聚碳酸酯过滤膜过滤，得到尺寸均一的脂质体；未包裹的葡萄糖用纯水透析1.5-5 h，制得包裹有葡萄糖的、同时表面修饰了三聚氰胺的功能化脂质体；
3）将50 mL 步骤一中制得的Fe3O4@Au与pH 7.0的克伦特罗溶液在室温条件下，孵育30min，PBS溶液洗涤2次后，加入50 mL步骤二中制得的功能化脂质体，继续孵育30 min，PBS溶液洗涤2次；
4）在步骤三中制得的溶液中加入20 mL表面活性剂，反应15 min，葡萄糖从破裂的脂质体结构中释放；取3 mL上清液用于血糖仪的检测。
实施例2
本实施例提供了一种克伦特罗快速检测方法，包括如下的步骤：
1）将200 mL三聚氰胺溶液加入2 mL Fe3O4@Au中，搅拌均匀后，室温孵育6 h；
2）15.9 mmol/L氢化大豆磷脂，6.4 mmol/L胆固醇，0.2 mmol/L衍生化处理的三聚氰胺依次溶解到体积比6：6：1氯仿、异丙醇醚和甲醇的混合溶剂中；然后将0.5 mL的5.0 mg/mL葡萄糖溶液加入5 mL上述合成脂质体的混合物中，超声5 min后，在氮气气氛保护下，以45oC的温度蒸发溶剂，制得凝胶状的悬浮液；用200 nm的聚碳酸酯过滤膜过滤，得到尺寸均一的脂质体；未包裹的葡萄糖用纯水透析1.5-5 h，制得包裹有葡萄糖的、同时表面修饰了三聚氰胺的功能化脂质体；
3）将50 mL 步骤一中制得的Fe3O4@Au与pH 7.0的克伦特罗溶液在室温条件下，孵育30min，PBS溶液洗涤2次后，加入50 mL步骤二中制得的功能化脂质体，继续孵育30 min，PBS溶液洗涤2次；
4）在步骤三中制得的溶液中加入20 mL表面活性剂，反应15 min，葡萄糖从破裂的脂质体结构中释放；取3 mL上清液用于血糖仪的检测。
需要指出的是，以上的两个实施例只是对本发明的解释，并非是对发明的限定，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改，例如简单的加热系统的更换或者反应釜的变化都应在本发明技术方案保护范围之内。

Claims (5)

1.一种克伦特罗快速检测方法，其特征在于，包括如下的步骤：
（1）在Fe3O4@Au表面修饰上三聚氰胺；
（2）在脂质体合成的过程中原位包裹葡萄糖，同时通过衍生化反应将三聚氰胺修饰到脂质体的表面；
（3）将第一步和第二步中制得的材料混合，加入克伦特罗样品，由于三聚氰胺与克伦特罗之间的作用，形成三明治的夹心结构；
（4）第四步，加入表面活性剂，使脂质体结构裂解，葡萄糖得以释放，借助血糖仪检测上清液完成定量检测。
2.如权利要求1所述的克伦特罗快速检测方法，其特征在于，包括如下的步骤：
1）将200 mL三聚氰胺溶液加入2 mL Fe3O4@Au中，搅拌均匀后，室温孵育6 h；
2）15.9 mmol/L氢化大豆磷脂，6.4 mmol/L胆固醇，0.2 mmol/L衍生化处理的三聚氰胺依次溶解到氯仿、异丙醇醚和甲醇的混合溶剂中；然后将0.5 mL 5.0 mg/mL葡萄糖溶液加入5 mL上述合成脂质体的混合物中，超声5 min后，在氮气气氛保护下，以45oC的温度蒸发溶剂，制得凝胶状的悬浮液；用200 nm的聚碳酸酯过滤膜过滤，得到尺寸均一的脂质体；未包裹的葡萄糖用纯水透析1.5-5 h，制得包裹有葡萄糖的、同时表面修饰了三聚氰胺的功能化脂质体；
3）将50 mL 步骤一中制得的Fe3O4@Au与pH 7.0的克伦特罗溶液在室温条件下，孵育30min，PBS溶液洗涤2次后，加入50 mL步骤二中制得的功能化脂质体，继续孵育30 min，PBS溶液洗涤2次；
4）在步骤三中制得的溶液中加入20 mL表面活性剂，反应15 min，葡萄糖从破裂的脂质体结构中释放；取3 mL上清液用于血糖仪的检测。
3.如权利要求2所述的克伦特罗快速检测方法，其特征在于：所述三聚氰胺溶液浓度为1 mmol/L；所述氢化大豆磷脂和胆固醇的浓度分别为15.9 mmol/L和6.4 mmol/L。
4.如权利要求3所述的克伦特罗快速检测方法，其特征在于：所述氯仿、异丙醇醚和甲醇的混合溶剂中各组分的体积比为6：6：1。
5.如权利要求4所述的克伦特罗快速检测方法，其特征在于：所述表面活性剂为PBSTw-1X。
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