CN106117340A - 肿瘤坏死因子β类似物、其偶联物及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及肿瘤坏死因子β类似物、其偶联物及其医药用途。具体而言，本申请涉及一种经工程改造的肿瘤坏死因子β类似物，其氨基酸序列选自：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；还涉及PEG分子和肿瘤坏死因子β或PEG分子和肿瘤坏死因子β类似物共价结合形成的偶联物。根据本申请的偶联物具有更好的体内稳定性，因此减少了静脉给药的频率，减少药物的剂量，同时还降低药物的急性毒性，增加抗肿瘤治疗效果。在动物模型中，本申请的偶联物能够预防或治疗恶性肿瘤，而具有有利的医用前景。

Description

肿瘤坏死因子β类似物、其偶联物及其医药用途

技术领域

本申请涉及生物和医学领域。更具体而言，涉及一种工程改造的肿瘤坏死因子β，还涉及经聚乙二醇修饰的肿瘤坏死因子β，及其制备方法，以及上述分子作为治疗剂在预防或治疗肿瘤中的用途。

背景技术

肿瘤坏死因子β(TNFβ)是一种能够引发恶性肿瘤细胞凋亡的多功能细胞因子。TNFβ由活化的单核巨噬细胞分泌，是迄今为止所发现的肿瘤坏死因子家族(TNFα和TNFβ)中具有强烈抗肿瘤活性的细胞因子之一，其对多种恶性肿瘤细胞具有明显的杀死细胞(tumorcidal)作用(Carswell,EA等人,1975,An endotoxin induced serum factor thatcauses necrosis of tumors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72；3666-3670)。

TNFβ在1970年代末期由美国科学家所发现。TNFβ的生物活性作用，主要是通过与一个较低分子量的受体(TNFR2)，及与一个高分子量受体(TNFR1)结合，来传导所有的生理学、病理学、以及杀死恶性肿瘤细胞的药理学作用(Andrews JS等人,1990.Characterization of the receptors for tumor necrosis factor(TNF)andlymphotoxin(LT)on human lymphocytes.J.Immunol.144；2582-2591.Dembic Z等人,1990.Two human TNF receptors have similar extracellular,but distinctintracellular,domain sequences.Cytokine 2；231-237)。

已经发表的临床治疗早期黑色素癌症和治疗软组织恶性肉瘤的药效实验数据显示：野生型TNFβ在人体内循环时间太短，并且血液循环系统器官毒性过高，因此它用于恶性黑色素瘤、软组织肉瘤的非肠道注射形式的临床疗效不佳(Fiers W,1995.Biologictherapy with TNF:preclinical studies.In Biologic Therapy of Cancer.第二版；DeVita Jr.VT,等人，Philadelphia:J.B.Lippincott Co.295-328)。由于这个原因，TNFβ治疗人体恶性肿瘤的医疗效果，未曾在人体临床试验之中系统性的被证实或排除。

鉴于TNFβ在人体内半衰期短的缺点，本领域仍然需要一种生物体内半衰期更长的新型TNFβ类似物或衍生物，从而使其能够更广泛应用于恶性肿瘤的全身性临床治疗。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，根据本申请的一些实施方式，提供一种经工程改造的肿瘤坏死因子β，其是野生型TNFβ的类似物(在文中也作TNFβ类似物)。

在一些实施方式中，根据本申请的TNFβ类似物和野生型TNFβ在一个氨基酸残基位点上存在差异。在一个具体的实施方式中，所述氨基酸残基位点是第4位；在另一个具体的实施方式中，所述氨基酸残基位点是第22位。在一个具体的实施方式中，第4位氨基酸残基Val(V)被替换为Thr(T)；本领域技术人员习惯上将这种替换表示为V4T；那么，具有这种替换的TNFβ类似物在文中以“TNFβV4T”表示。在另一个具体的实施方式中，第22位氨基酸残基Leu(L)被替换为Ser(S)；本领域技术人员习惯上将这种替换表示为L22S；那么，具有这种替换的TNFβ类似物在文中以“TNFβL22S”表示。在一个具体的实施方式中，TNFβV4T如SEQ IDNo.2所示。在另一个具体的实施方式中，TNFβL22S如SEQ ID No.3所示。

在另一些实施方式中，根据本申请的TNFβ类似物和野生型TNFβ在一个以上(例如，但不限于2个)氨基酸残基位点上存在差异。在一个具体的实施方式中，所述氨基酸残基位点是第4位和第22位。在一个具体的实施方式中，第4位氨基酸残基V被替换为T，且第22位氨基酸残基L被替换为S；具有这种替换的TNFβ类似物在文中以“TNFβV4TL22S”表示。在另一个具体的实施方式中，TNFβV4TL22S如SEQ ID No.4所示。

本领域技术人员知晓，野生型TNFβ(文中以TNFβ表示)的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。人类野生型TNFβ的序列是本领域公知的，例如Pennica D,1984,Human tumornecrosis factor:precursor structure，expression and homology to lymphotoxinNature 312；724-729中可以获得其信息。

根据本申请的一些实施方式，提供一种偶联物，它是聚乙二醇化的TNFβ类似物；也可以理解为聚乙二醇分子和本申请的TNFβ类似物共价结合形成的偶联物。

根据本申请的另一些实施方式，提供一种偶联物，它是聚乙二醇化的TNFβ；也可以理解为聚乙二醇分子和野生型TNFβ共价结合形成的偶联物。

在本申请上下文中，根据本申请的偶联物以“TNFβPEG”表示。如无特别说明，TNFβPEG既包含聚乙二醇化的TNFβ类似物，也包含聚乙二醇化的野生型TNFβ。

在一些实施方式中，聚乙二醇(PEG)包括直链型和支链型。在具体的实施方式中，聚乙二醇是线性聚乙二醇，即直链型。

在一些实施方式中，聚乙二醇的平均分子量是5000至25000，例如5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000以及上述任意两个数值之间的范围。在一个具体的实施方式中，聚乙二醇的平均分子量是10000至20000。在一个具体的实施方式中，聚乙二醇的平均分子量是15000至20000。在一个具体的实施方式中，聚乙二醇的平均分子量是20000。

在本领域中，技术人员习惯上将平均分子量为5000的PEG表示为PEG5000。以此类推，PEG10000、PEG20000等。

在一些实施方式中，用于制备本申请偶联物的PEG是活化形式的聚乙二醇。在具体的实施方式中，适用于本申请的活化形式的聚乙二醇选自：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(Methoxy Succinimidyl Glutarate NHS ester，SG-PEG)、聚乙二醇琥珀酰亚胺基羧甲基酯(Succinimidyl Carboxymethyl NHS ester，SCM-PEG)。在优选的实施方式中，活化形式的聚乙二醇选自：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺基羧甲基酯、及其组合。

PEG修饰可以发生在很多基团上，比如多肽的氨基、巯基、羧基上面。本申请中PEG化在pH>8.2的反应条件下进行，因此PEG修饰特异性地发生赖氨酸的氨基上。

根据一些实施方式，提供了一种药物组合物，其含有根据本申请的TNFβ类似物。

根据另一些实施方式，提供了一种药物组合物，其含有根据本申请的偶联物。

根据另一些实施方式，提供了一种药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。

本领域技术人员能够理解，本申请的药物组合物可以根据具体的施用方式被配制成各种本领域熟知的制剂形式，例如口服剂型(粉剂、片剂、胶囊、软胶囊、液体药物、糖浆、酏丸、散剂、囊剂、粒剂)，或表皮制剂(乳膏、软膏、洗剂、凝胶、香脂、膏药、糊剂、喷雾剂、气雾剂等等)，或注射制剂(溶液、悬浮剂、乳剂)。在一个具体的实施方式中，本申请的药物组合物被制备成注射制剂。

根据本申请的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体选自：佐剂、稀释剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质、及其组合。

在一些实施方式中，填充剂选自：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖、及其组合。

在一些实施方式中，助悬剂选自：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素、及其组合。

本申请的组合物可以通过利用本领域任何现有的或未来的方法制成，例如但不限于使患者或受试者用药后能提供快速、持久或缓慢释放的活性成分。

本申请活性成分(本申请的TNFβ类似物和/或偶联物)的给药剂量可以根据个体的情况、重量、病情的严重程度、药物形式、给药途径以及给药周期的不同而不同。给药剂量可以由本领域技术人员进行选择。施用频率可以是每天单次给药或每天分多次给药。在一些具体的实施方式中，当应用于成人人体时，本申请的偶联物的临床有效药剂量为10至3000ng/m²/7至14天。

本申请的药物组合物通过各种途径给药至个体(如哺乳动物(大鼠、小鼠、驯化动物或人类))。所有的给药方式均是预期的，例如，给药可以是皮下、皮内、膜间、栓剂和气雾剂给药形式。

根据一些实施方式，提供了一种肿瘤坏死因子β类似物，其用于预防和/或治疗肿瘤。根据一些实施方式，提供了本申请的肿瘤坏死因子β类似物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。

根据一些实施方式，提供了一种偶联物，其用于预防和/或治疗肿瘤。根据一些实施方式，提供了本申请的偶联物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。

在一些实施方式中，所述肿瘤是癌症。在一些实施方式中，所述肿瘤选自：淋巴癌、肺癌、肾癌、肝癌、结肠直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤。所述肺癌例如选自小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌。

根据一些实施方式，提供了一种用于制备本申请偶联物的方法，包括步骤：

将肿瘤坏死因子β(或肿瘤坏死因子β类似物)与活化的聚乙二醇接触。

在一些实施方式中，所述肿瘤坏死因子β(或肿瘤坏死因子β类似物)与所述活化的聚乙二醇的比例按重量计为1:20至1:30。例如，1:20；1:21；1:22；1:23；1:24；1:25；1:26；1:27；1:28；1:29；1:30。

在一些实施方式中，所述接触在8.5至9.5的pH中进行。在具体的实施方式中，所述pH为8.8至9.2。在具体的实施方式中，所述pH为8.9至9.1。

在一些实施方式中，所述接触在25℃至37℃的温度中进行。在具体的实施方式中，所述温度为28℃至35℃。在具体的实施方式中，所述温度为29℃至31℃。在具体的实施方式中，所述温度为29.8℃至30.2℃。

在一些实施方式中，所述接触的时间为10至40分钟。在具体的实施方式中，所述接触的时间为15至35分钟。在具体的实施方式中，所述接触的时间为20至35分钟。在具体的实施方式中，所述接触的时间为25至35分钟。在具体的实施方式中，所述接触的时间为28至32分钟。在具体的实施方式中，所述接触的时间为30分钟。

聚乙二醇化学反应是本申请中的重要控制程序。活化的聚乙二醇对TNFβ蛋白修饰反应是通过控制反应pH值在9.0±0.1，反应时间控制在30分钟左右，蛋白与聚乙二醇的用量比为1:20至1:30(w:w)，反应温度控制在25至37℃，使TNFβ蛋白表面的赖氨酸能够充分的与活化聚乙二醇进行反应，以获得聚乙二醇修饰的偶联产物。

聚乙二醇化学反应完成后，可以用截留分子量50000的滤膜装置，将剩余未完成化学反应的蛋白，及剩余未反应的线性聚乙二醇用高速离心分离，即可获得高纯度的聚乙二醇-蛋白物的偶联物。

这是一种温和的生物化学反应，通过与酸酐或羧酸反应形成酯键或酰胺键而得到的偶联物，在通常的生理条件下相对稳定，并不会发生断裂。

在本申请的上下文中，本申请所述的“聚乙二醇化肿瘤坏死因子”、“聚乙二醇修饰的肿瘤坏死因子”的意思是等同的，其等同于聚乙二醇和肿瘤坏死因子β的偶联物或聚乙二醇和肿瘤坏死因子β类似物的偶联物。

在本申请的上下文中，不应对表述“一种”进行限制性理解。根据上下文的语境，“一种”可以指“一类”，而非“一个”。

表1.本申请中所用缩写及其含义

以下将通过具体实施例和附图详细说明书本申请。

附图说明

图1为显示pET28b(+)表达质粒的结构图。

图2为SDS聚丙烯酰胺凝焦电泳测定TNFβ、TNFβ类似物及其偶联物的纯度图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本申请，但这些实施例仅用来说明本申请，而不以任何方式限制本申请的范围。以下实施例中的SCM-PEG5000、SCM-PEG10000、SCM-PEG20000、SG-PEG5000、SG-PEG10000、和SG-PEG20000购自北京键凯科技公司。

实施例

实施例1.野生型TNFβ及TNFβ类似物的构建和表达

一、操作步骤：

1.核苷酸序列的优化和构建：

1.1运用全化学合成方法，将人野生型TNFβ基因的氨基酸序列SEQ ID No.1，改编为SEQ ID No.5以利于置入原核表达系统(如大肠杆菌质粒表达系统)中顺利表达和纯化(方法参考Pennica,D.Nedwin,G.E.,Hayflick,J.S.,等人Nature,1984,312(20/27),724-729,Human tumour necrosis factor:precursor structure,expression and homologyto lymphotoxin)。

所述的改编过程包括：将SEQ ID No.1第2位脯氨酸改成赖氨酸；将第26位苏氨酸改成天冬酰胺；将第28位赖氨酸改成丙氨酸，而完成改编TNFβ基因氨基酸序列如上述序列。

1.2此外，又将SEQ ID No.5进行如下优化：

将第4位缬氨酸改变为苏氨酸(命名为TNFβ类似物TNFβV4T，SEQ ID NO.2)；

将第22位赖氨基酸改变为丝氨酸(命名为TNFβ类似物TNFβL22S，SEQ ID NO.3)；

同时将第4位缬氨酸改变为苏氨酸，第22位亮氨基酸改变为丝氨酸(命名为TNFβ类似物TNFβV4TL22S，SEQ ID NO.4)。

2.野生型TNFβ及TNFβ类似物的表达

运用全化学合成方法，合成上述野生型TNFβ或TNFβ类似物(氨基酸序列见下文)；

将其置入表达质粒例如pET28b(+)(方法参见pET System Novagen手册，第11版，User Protocol TB055Rev.C 0611JN，质粒结构见图1)中；

根据Novagen公司本方法手册中的常规程序(Novagen User ProtocolTB055Rev.C 0611JN)，将质粒穿入大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)sS(Novagen pET System手册，第11版)中；

从将上述表达质粒的大肠杆菌的琼脂培养皿中挑选单一菌落，置入5mL的无菌LB(Luria-Bertani)培养基中(购自国药集团化学试剂有限公司)，于37℃，按标准操作手册方式培养；

按照1％比例逐步放大到5升的培养基，至菌密度OD₂₆₀为0.6至0.8时，降温至18℃；

加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导TNFβ蛋白表达16小时；

大肠杆菌体用5000rpm离心沉淀收集，然后用预冷(4℃)裂解缓冲液，于超声破碎仪中破菌。

二、野生型TNFβ及TNFβ类似物的氨基酸序列：

1.野生型TNFβ(SEQ ID NO：1)

为适应原核表达系统而优化后的序列(SEQ ID NO：5)

2.TNFβV4T(SEQ ID NO：2)

3.TNFβL22S(SEQ ID NO：3)

4.TNFβV4TL22S(SEQ ID NO：4)

实施例2.TNFβ蛋白及其类似物的纯化

如上实施例1中得到的裂解缓冲液破菌后的上清液包含着大量的水溶性表达蛋白。将破菌后的上清液以1.0毫升/每分钟流速，缓慢通过速流通镍离子(Ni-Sepharose^TM6FastFlow)亲和柱(GE Healthcare Bioscience AB,Sweden)，将蛋白留置于镍离子柱上，然后用洗脱溶液0.6M咪唑组胺(imidazole)水溶液洗脱，可得初步纯化的(＞95％)蛋白。

将由此得到的蛋白通过速流通阴离子(SPSepharose^TMFast Flow)树脂交换柱(GEHealthcare Bioscience AB)，将蛋白留置于此树脂离子交换柱上，然后用含0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液(pH 8.5)洗脱，得到进一步高度纯化的(＞99.5％)蛋白。

实施例3.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβSCMPEG20)的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取2.5微克经过纯化后的野生型TNFβ蛋白(实施例2)，置入磷酸钠缓冲液中。取62.0微克分子量为20000的聚乙二醇琥珀酰亚胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)(北京键凯科技)，将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免气泡产生。此时TNFβ与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于30℃轻微搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子β偶联物(命名为TNFβSCMPEG20)。TNFβSCMPEG20的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例4.TNFβSGPEG20的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取2.5微克经过纯化表达的TNFβ，置至磷酸钠缓冲液中。取62.5微克分子量20000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG-PEG20000)，将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免大量气泡产生。此时TNFβ与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于25℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子β类似物偶联物(TNFβSGPEG20)。TNFβGPEG20的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例5.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβV4TSCMPEG20)的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取2.5微克经过纯化表达的TNFβV4T蛋白，置于磷酸钠缓冲液中。取62.5微克分子量20000的聚乙二醇琥珀酰亚胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)，将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免气泡产生。此时TNFβV4T与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于30℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子βV4T偶联物(TNFβV4TSCMPEG20)。TNFβV4TSCMPEG20的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例6.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβV4TSGPEG20)的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取2.5微克纯化表达的TNFβV4T蛋白，置于磷酸钠缓冲液中。取62.5微克分子量20000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG-PEG20000)将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免气泡产生。此时TNFβV4T与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于25℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子β偶联物(TNFβV4TSGPEG20)。TNFβV4TSGPEG20的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例7.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβL22SSCMPEG20)的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取2.5微克经过纯化后的TNFβL22S蛋白(如前实施例1)，加入至磷酸钠缓冲液中，使其充分溶解。取62.5微克分子量20000的聚乙二醇琥珀酰亚胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)，将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免大量气泡产生。此时TNFβL22S与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于30℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子TNFβL22S偶联物(TNFβL22SSCMPEG20)。TNFβL22SSCMPEG20的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例8.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβL22SSGPEG20)的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取2.5微克经过纯化表达的TNFβL22S蛋白，置于磷酸钠缓冲液中。取62.5微克分子量20,000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG-PEG20000)，将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免气泡产生。此时TNFβL22S与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于30℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子TNFβL22Sβ偶联物(TNFβL22SSGPEG20)。TNFβL22SSGPEG20的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例9.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβL22SSGPEG5)的制备

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30^℃。取2.5微克经过纯化表达的TNFβL22S，置于磷酸钠缓冲液中，使其充分溶解。取62.5微克分子量5000的甲氧基PEG琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG-PEG5000)，将其迅速加入至上述溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免大量气泡产生。此时TNFβL22S与聚乙二醇用量比为1：25(w/w)。然后，于30℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入100.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液置入具备分子量50,000的滤膜装置的离心管装置内，用高速旋转离心(3000×g，30分钟)滤除剩余未完成反应的蛋白和剩余未反应的线性聚乙二醇，得到高纯度的聚乙二醇-肿瘤坏死因子β偶联物(TNFβL22SSGPEG5)。TNFβL22SSGPEG5的滤液在0.2μm的无菌滤膜上进行无菌过滤，得最终无菌蛋白注射液药物，置于4℃密封无菌避光保存。

实施例10.聚乙二醇化肿瘤坏死因子β(TNFβV4TSCMPEG20)制备方法的放大

取100ml 0.1M pH 8.5的磷酸钠缓冲液，于水浴中预热至30℃。取300微克经过速流通阴离子(SPSepharose^TMFastFlow)树脂交换柱，高度纯化而得TNFβV4T蛋白，稀释溶解入上磷酸钠缓冲液中。取9000.0微克分子量20,000的聚乙二醇琥珀酰亚胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)，将其迅速加入至上述反应溶液中，并适当搅拌而使活化聚乙二醇在30秒内完全溶解，同时要避免气泡产生。此时TNFβV4T与聚乙二醇用量比为1：30(w/w),于30℃搅拌下进行反应30分钟，然后加入300.0微克甘氨酸终止反应。反应完成后，将反应溶液通过具分子量50,000过滤膜的中空纤维分离柱超滤(Holofiber filtration C06-E050-10-SmPESSpectrum LABS.USA)浓缩至原体积的1/10(10ml)，并将TNFβV4TSCMPEG20与未反应的聚乙二醇、甘氨酸分离。向该10ml浓缩液中再次加入0.1M pH7.5的磷酸钠缓冲液至150ml，通过同样中空纤维分离柱，再次将体积浓缩至10ml。如此同样的操作重复9次，使得0.1M pH7.5的磷酸钠缓冲液完全取代聚乙二醇化反应中的0.1M pH8.5的磷酸钠缓冲液。滤除剩余未完成反应的蛋白，滤除剩余中止反应用的甘氨酸，及滤除剩余未反应的线性聚乙二醇。第10次浓缩后，取50ml 0.1M pH7.5的磷酸钠缓冲液清洗中空纤维分离柱以及分离管。清洗液与15ml的浓缩液合并后所得滤液经0.2μm的无菌滤膜进行无菌过滤，得最终产物TNFβV4TSCMPEG20。最终产物分装为1.0毫升灭菌无菌安培瓶，并置于4℃密封无菌避光保存。

测试例

测试例1.蛋白浓度、纯度分析

蛋白浓度分析方法：采用Bradford-Lowry方法来测定蛋白质的浓度。首先以已知不同浓度的标准蛋白所结合考马斯亮蓝染料的量绘出标准曲线。然后，通过测定蛋白的染料结合量推断出该蛋白质样品浓度。

蛋白纯度分析方法：蛋白生物大分子，由于分子量不同，在同一电场条件下，可由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将不同分子量、不同种类的蛋白生物大分子分开。在确定杂蛋白是否存在的同时，也可以确定未知蛋白质的纯度和蛋白分子的大小。

图2为SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳测定TNFβ、TNFβSCMPEG20、TNFβSGPEG20等的纯度图。由图2可知，实施例2中，裂解缓冲液破菌后的上清液水溶性表达蛋白，经过镍离子亲和柱纯化后，可得到大量的低纯度(＞95％)TNFβ蛋白。再进一步用离子交换树脂纯化可以得到高纯度(＞99.5％)的蛋白。经过PEG修饰后所得的TNFβSCMPEG20、TNFβSGPEG20分子量增大而留滞于高分子量区域。

按照如上方法分析了各个TNFβ类似物(TNFβV4T、TNFβL22S)的纯度，结果均得到了高纯度的TNFβ类似物(TNFβV4TL22S的电泳图结果相同，数据未显示)。

测试例2.本申请偶联物对小鼠成纤维瘤细胞L929的致死活性分析

小鼠成纤维瘤细胞L929购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，体外培养于补充有10％小牛血清配制的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)体外细胞培养液(简称DMEM+10％FCS)，孵育生长于37℃、5％CO₂培养箱中(Humphreys DT1,Wilson MRCytokine.1999Oct；11(10):773-82.Modes of L929cell death induced by TNF-alphaand other cytotoxic agents)。处于对数生长期的L929细胞，用1％胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为5x10⁴/ml，按100μl/孔将L929细胞加入96孔板中，每组4个复孔，每板设定6个药物浓度组。回置于37℃、5％CO₂培养箱中。培养24小时后，用DMEM培养液，按以下浓度依次倍比稀释由前述实施例制得的蛋白或偶联物：0(对照孔)、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/ml、10.0μg/mL。

加入蛋白或偶联物后将96孔板回置于培养箱中，持续培养96小时。次日，取出96孔板，依照Monoclonal antibody targeting of N-cadherin inhibits prostate cancergrowth,metastasis and castration resistance.Nature Medicine,2010，16(12),1414-1420描述的方法向每孔加入10μL CCK8酶底物溶液，并将培养板在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养1小时。然后，用酶标仪(TECAN infinite200PRO)测定在450nm处的吸光度，然后计算，并绘制曲线得到IC₅₀数据。

另外，按照如上文献所述的方法，测定TNFβ、TNFβV4T、TNFβL22S、TNFβSGPEG5、TNFβSGPEG10、TNFβSGPEG20、TNFβSCMPEG5、TNFβSCMPEG10、TNFβSCMPEG20、TNFβV4TSGPEG20、TNFβL22SSGPEG20对小鼠成纤维瘤L929细胞的致死活性。所得到的活性结果如下表2和表3所示。

表2.本申请的蛋白和偶联物对小鼠成纤维瘤细胞L929的致死活性

由上表2可知，高度纯化后的野生型TNFβ蛋白对于靶标测试L929细胞具有高度的细胞致死活性，体外癌细胞致死活性IC₅₀值在6.5±2.8ng/mL。

经过聚乙二醇20000的活化聚乙二醇酯的化学修饰后的偶联蛋白，依然保持了高强度的L929细胞致死活性，其中TNFβSGPEG20、TNFβSCMPEG20的IC₅₀值分别是16.2±8.38ng/mL、12.5±4.2ng/mL。

相对而言，聚乙二醇SCM5000、聚乙二醇SCM10000、聚乙醇SG5000、聚乙醇SG10000的化学修饰作用后，IC₅₀值分别大幅度升高，这指示不能够充分保留对L929肿瘤细胞致死活性。

相对野生型TNFβ而言，用苏氨酸取代第4位缬氨酸；用丝氨酸取代第22位亮氨酸的两个点突变的TNFβ类似物不但可增加亲水性氨基酸所带来的蛋白水溶性(根据蛋白生物学公知的常识，技术人员能够明确地预期，将疏水性氨基酸如缬氨酸置换为亲水性氨基酸如苏氨酸；或者将疏水性氨基酸亮氨酸用亲水性丝氨酸取代时，蛋白的水溶性可以大幅度升高)，而且可以维持＞30％以上的野生型TNFβ的体外癌细胞致死活性(IC₅₀值分别是13.2±4.8；21.2±6.7，降低了2倍和3.2倍)。

经过用同样的聚乙二醇修饰后，两个TNFβ类似物的偶联物TNFβV4TSCMPEG20和TNFβL22SSCMPEG20的体外癌细胞致死活性均略下降，IC₅₀值分别为31.6±15.7ng/mL和61.2±6.7ng/mL。

上述体外活性实验数据显示，分子量为20000的活化聚乙二醇酯化学修饰的情况下，野生型TNFβ蛋白和TNFβV4T、TNFβL22S同样可以保持对靶标癌细胞L929的体外高度致死活性。分子量为5000和10000的两种聚乙二醇酯化学修饰，则不能够充分保留对于野生型TNFβ蛋白和TNFβV4T、TNFβL22S的体外癌细胞致死活性。此外，TNFβSGPEG20可达到最高的肿瘤细胞致死活性。

表3.聚乙二醇的分子量和活化类型对偶联物的小鼠成纤维瘤细胞L929致死活性的影响

由上表3可知，聚乙二醇链长对于小鼠成纤维瘤细胞L929的致死活性具有决定性的作用。当SCM聚乙二醇或SG聚乙二醇为PEG5000时，修饰后的TNFβ-聚乙二醇偶联物失去了105至704倍的活性。当SCM聚乙二醇或SG聚乙二醇为PEG10000时，聚乙二醇化学修饰后的TNFβ-聚乙二醇偶联物失去了近27至65倍的细胞致死活性。当SCM聚乙二醇或SG聚乙二醇为PEG20000时，聚乙二醇化学修饰后的TNFβ-聚乙二醇偶联物仅仅失去了近1.9至2.5倍的体外细胞致死活性。由此可见，最佳选择的聚乙二醇是PEG20000，经SCMPEG、SGPEG修饰后的偶联物并无过度的活性降低，且可达到最低限度失活，和最高程度的小鼠成纤维瘤细胞L929体外致死活性(分别为12.5±4.2，16.2±8.8ng/mL)。

测试例3.本申请偶联物对恶性肿瘤细胞的致死活性分析

靶标细胞为恶性人体黑色素癌A375细胞、肝癌细胞HepG2细胞、结肠癌胞HCT116细胞、非小细胞肺癌A549、和乳腺癌MDA-MB231细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

各靶标细胞，体外培养于外加10％小牛血清配制的DMEM+10％FCS体外细胞培养液，孵育生长于5％CO₂、37℃的恒温培养箱中。处于对数生长期的靶标细胞用1％胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为5x10⁴/ml，每孔100μl加入96孔板，每组4个复孔，每板设定6个浓度组，回置于37℃、5％CO₂培养箱中。

培养24小时后，用DMEM培养液，按以下浓度依次倍比稀释由上述实施例制得的蛋白或偶联物：0(对照孔)、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/ml、10.0μg/mL。

加入蛋白或偶联物后将96孔板回置于培养箱中，继续培养72小时。次日，取出96孔板，向每孔加入10μL CCK8酶底物溶液,再将培养板在37℃、5％CO₂恒湿培养箱中培养1小时。然后，用酶标仪(TECAN infinite200PRO)测定在450nm处的吸光度，并绘制曲线,测得IC₅₀数据如下表4。

表4.本申请的蛋白或偶联物对恶性肿瘤细胞的致死活性IC₅₀值(ng/mL)

如上表4所示，TNFβ、TNFβV4T、TNFβV4TSCMPEG20、TNFβSCMPEG20对人体恶性肿瘤细胞展示了不同程度的致死细胞活性，但相于三种恶性肿瘤细胞活性敏感度均比对于小鼠成纤维瘤L929细胞略低。IC₅₀值显示对恶性非小细胞肺癌敏感性最高，成为临床第一目标适应症。

测试例4.裸小鼠体内抗肿瘤活性分析

建立荷瘤裸鼠模型

将小鼠成纤维瘤细胞L929(11)于外加10％胎牛血清的DMEM基培养液中培养生长，达到处于对数生长期。用1％胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为1.0×10⁷/ml，然后将0.3mL细胞悬浮液(3.0×10⁶细胞)接种注射入Balb/c裸小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)背部。

L929靶标细胞在裸鼠体内生长，定期用游标卡尺测量肿瘤体积，体积达到100至150mm³后，用于活性测试。

将上述裸鼠分为对照或治疗组，每组5只，分别尾静脉注射PBS(溶剂对照组)和TNFβ或TNFβSCMPEG20(治疗组)。以0.3μg和1.0μg每日注射一次，连续给药21天(qd x 21)；或者以0.3μg和1.0μg每周注射一次，连续给药3周(q7d x 3)。

给药后逐日记录动物的毒性反应情况，每周测量一次肿瘤体积，两次测量裸小鼠体重变化，计录动物死亡情况，计算中位存活天数，并制作体重变化曲线和动物存活曲线(Kaplan-Meier plot)。用改良寇氏法计算测试药物对裸鼠的半数致死量(50％LethalDose,LD₅₀)，研究本申请的蛋白和偶联物杀死恶性肿瘤的活性，定量分析TNFβ和TNFβSGPEG20的抗肿瘤效应。所得到的结果如下表5所示。

表5.裸鼠L929肿瘤模型中的抗肿瘤活性

如上表5所示，本申请的蛋白和偶联物在本实验动物模型中，以每天尾静脉给药0.3μg连续给药21天情况下，能够抑制55％的L929肿瘤体积生长，能够延长荷瘤裸鼠存活时间186％。

当TNFβ给药剂量提高至1.0μg，连续21天经尾静脉注射给药情况下，虽然能够抑制75％肿瘤L929体积，但是并不能够延长荷瘤裸鼠生命时间(-8％)，充分证明高剂量(1.0μg)TNFβ可以导致裸鼠全身毒性，甚至于缩短荷瘤裸鼠8％的存活时间。

以每周(7天)尾静脉给药一次，每次0.3μg，连续给药3周(总共三次，共21天)情况下，TNFβ仅仅能够抑制1.9％裸鼠体内L929肿瘤体积生长，也并不能够延长荷瘤裸鼠存活时间(0％)。

用TNFβSCMPEG20经尾静脉给药，每周(7天)尾静脉给药一次，每次注射给药0.3μg，连续给药3周(总共三次，共21天)情况下，TNFβSCMPEG20能够抑制58％裸鼠体内L929肿瘤体积生长，同时也能够显著延长荷瘤裸鼠存活时间(209％)。这个每周给药实验数据充分显示，中剂量(0.3μg)尾静脉给药情况下，TNFβSCMPEG20可以避免高剂量(1.0μg/只/每天)注射TNFβ对于裸鼠的体内毒性造成的提前死亡，并显示出最佳抑制肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠的存活时间209％的治疗效果。在此实验条件下，使用较高剂量TNFβSCMPEG20(1.0μg/只/q7d x3；或者使用较高剂量TNFβSCMPEG20(1.0μg/只/qdx21)在次小鼠体内试验上产生全身系统性药物毒性，造成动物提前死亡，因而无法测定抑制肿瘤生长效果。

用中剂量TNFβSCMPEG20(0.3μg/只)q7d x3活性明显优于中剂量TNFβ(0.3μg/只)q7d x 3、中剂量TNFβ(0.3μg/只)qd x 21以及高剂量TNFβ(1.0μg/只)qd x 21的体内活性。

每周给药实验结果显示了，20,000活化聚乙二醇修饰的TNFβ偶联蛋白能够延长药效时间，而能够达到每周给药一次的治疗恶性肿瘤的目的。

本申请利用聚乙二醇修饰技术，改善了非肠道给药TNFβ蛋白药物半衰期短的缺点，从而有助于在人体上利用非肠道给药方式抑制恶性肿瘤细胞生长。

Claims (10)

1.一种肿瘤坏死因子β类似物，其氨基酸序列选自：

SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

2.一种偶联物，其是聚乙二醇化的肿瘤坏死因子β类似物，其中：

所述肿瘤坏死因子β类似物的氨基酸选自：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

3.一种偶联物，其是聚乙二醇化的肿瘤坏死因子β，其中：

所述肿瘤坏死因子β的氨基酸序列是SEQ ID No.1。

4.根据权利要求2或3所述的偶联物，其中：

所述聚乙二醇为线性聚乙二醇，且

所述聚乙二醇的分子量范围为5000至20000，优选为20000。

5.根据权利要求2或3所述的偶联物，其中：

所述聚乙二醇为活化的聚乙二醇；

优选地，所述活化的聚乙二醇选自：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺基羧甲基酯、及其组合。

6.一种制备权利要求2或3所述偶联物的方法，包括步骤：

将肿瘤坏死因子β或肿瘤坏死因子β类似物与活化的聚乙二醇接触；所述肿瘤坏死因子β或肿瘤坏死因子β类似物与所述活化的聚乙二醇的比例按重量计为1:20至1:30，

其中所述肿瘤坏死因子β类似物的氨基酸序列选自：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.4；

其中所述肿瘤坏死因子β的氨基酸序列是SEQ ID No.1；

优选地，所述活化的聚乙二醇选自甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯和聚乙二醇琥珀酰亚胺基羧甲基酯。

7.根据权利要求6所述的方法，其中：

所述接触在8.5至9.5的pH中进行，

优选，所述pH为8.8至9.2；

更优选，所述pH为8.9至9.1；

以及

所述接触在25℃至37℃的温度中进行，

优选，所述温度为28℃至35℃，

更优选，所述温度为29℃至31℃，

最优选，所述温度为29.8℃至30.2℃。

8.一种药物组合物，其含有选自以下的一种或组合：

权利要求1所述的肿瘤坏死因子β类似物、和权利要求2或3所述的偶联物；

任选地，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。

9.权利要求1所述的肿瘤坏死因子β类似物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途，其中

所述的肿瘤选自：淋巴癌、肺癌、肾癌、肝癌、结肠直肠癌、乳腺癌、纤维肉瘤和黑色素瘤；

优选所述肺癌选自小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌。

10.权利要求2或3所述的偶联物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途，其中

所述的肿瘤选自：淋巴癌、肺癌、肾癌、肝癌、结肠直肠癌、乳腺癌、纤维肉瘤和黑色素瘤；

优选所述肺癌选自小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌。