CN106092993A - 一种氰根离子的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氰根离子的快速检测方法。通过对DNA‑铜纳米颗粒(DNA‑CuNPs)与荧光染料分子光学相互作用的研究，我们发现CuNPs能够高效熄灭DNA嵌入性染料EBMVC‑B的荧光，并且CuNPs能够被氰根离子(CN‑)快速刻蚀，实现荧光恢复，该过程可以在几秒钟内完成；实现氰根离子的快速荧光分析检测。结果表明，该方法具有专一性高，灵敏度好，操作简便，经济实用等优点；特别是检测速度快，可以克服由于CN‑半衰期短、而复杂前处理过程或长检测时间带来的误差；实现了实际水样中CN‑的检测和可食性植物组织中CN‑的荧光成像分析。因此，该发明方法具有原始创新性、良好的社会价值和应用前景。

Description

一种氰根离子的快速检测方法
技术领域
本发明属于纳米技术和分析检测领域，涉及基于DNA-铜纳米颗粒的纳米复合探针的构建及利用其检测分析氰根离子的新方法。
背景技术
氰根离子是一种剧毒阴离子，致命性强。因其以不同的形式广泛存在于人类的生产生活中，如上千种植物甚至是农作物中，工业废水等。不仅如此，含氰根离子复合物多处在复杂环境中，如木薯中的亚麻仁苦苷，经胃酸水解后生成游离的氢氰酸，产生毒性。若发生氰根离子中毒，症状轻者恶心，呕吐，腹泻、头晕，严重者呼吸困难、心跳加快、瞳孔散大，以至昏迷，最后抽搐、休克，因呼吸衰竭而死亡。还可引起甲状腺肿、脂肪肝以及对视神经和运动神经的损害等慢性病变。氰根离子半衰期短，复杂的前处理或长的检测时间会导致分析误差，因而实时快速地检测氰根离子尤为重要。
DNA-铜纳米颗粒(DNA-CuNPs)作为一种新兴的纳米材料，其性质与应用研究成为又一个研究热点。DNA-CuNPs合成简单，在常温常压下即可完成；合成速度快，仅需几分钟反应时间；操作简单，只需要对铜离子和还原剂简单混和，无需剧烈搅拌或其它处理；相对与其它重金属纳米材料，DNA-CuNPs具有低毒、“绿色”环保等优势，在生化分析应用中展现出很好的潜力。
本发明通过对DNA-CuNPs与荧光染料分子光学作用的研究，我们发现CuNPs能够高效熄灭DNA嵌入性染料EBMVC-B的荧光，并且CuNPs能够被氰根离子(CN-)快速刻蚀，实现荧光恢复，该过程可以在几秒钟内完成；其信号转换具有高度的poly(AT/TA)的双链DNA序列依赖性。基于此，本发明提出了一种CN-的快速检测方法，以poly(AT/TA)的双链DNA序列为模板，并嵌入EBMVC-B和原位合成CuNPs，在CN-作用下，荧光快速产生。结果表明，该方法具有专一性高，灵敏度好，操作简便，经济实用等优点；特别是检测速度快，可以克服由于CN-半衰期短、而复杂前处理过程或长检测时间带来的误差；实现了实际水样中CN-的检测和可食性植物组织中CN-的荧光成像分析。因此，该发明方法具有原始创新性、良好的社会价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服CN-半衰期短、而复杂前处理过程或长检测时间带来的误差，结合DNA-CuNPs的合成与性能优势，构建一种纳米复合探针，发展一种快速的氰根离子荧光检测新方法。本方法用于氰根离子的检测，具有简单方便，响应快速，成本低廉，特异性好等优点，有良好的社会价值和应用前景。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种氰根离子的快速检测方法，在双链DNA序列上嵌入EBMVC-B染料、并原位合成铜纳米颗粒，荧光熄灭，构成复合纳米探针；再加入氰根离子之后，铜纳米颗粒被快速刻蚀，EBMVC-B的荧光恢复，在几秒钟内完成，实现氰根离子的快速荧光分析检测。
所述的检测方法，在MOPS缓冲溶液中加入双链DNA序列和EBMVC-B染料，摇晃混匀，使EBMVC-B与DNA充分作用，嵌入到DNA上；再向上述溶液中加入铜离子溶液和还原剂抗坏血酸钠，铜离子在DNA上被还原，原位生成铜纳米颗粒，淬灭EBMVC-B染料的荧光；最后加入待检测的含有氰根离子的样品；根据荧光强度对CN-实现定性与定量检测。
所述的检测方法，所述MOPS缓冲溶液中MOPS的浓度为5-50mM，含50-250mM氯化钠，所述MOPS缓冲溶液的pH值为7.5-8.5。
所述的检测方法，缓冲液中双链DNA的浓度为50-500nM，EBMVC-B染料的浓度为250-2500nM。所述EBMVC-B染料与双链DNA序列的摩尔比例为5:1。
所述的检测方法，所述双链DNA序列为poly(AT/TA)的双链DNA序列，长度为12-28碱基。
所述的检测方法，所述poly(AT/TA)的双链DNA的序列优选:
5′-ATATATATATATATATATATATAT-3′
3′-TATATATATATATATATATATATA-5′。
使用时是单链的polyAT，自动配对成双链。
所述的检测方法，缓冲液中铜离子的浓度为10-200μM，抗坏血酸钠的浓度为0.5-5mM。
所述的检测方法，铜离子溶液为二价铜盐溶液，包括硫酸铜溶液,氯化铜溶液,硝酸铜溶液，醋酸铜溶液中的一种或几种。
所述的检测方法，待测样品加入后，以450nm为激发光源，收集500nm-700nm的荧光。
所述的检测方法，所述的方法用于检测2.5-20μM氰根离子浓度范围的样品。
所述EBMVC-B染料为本实验室合成
本发明所述poly(AT/TA)的双链DNA序列从生工生物工程(上海)有限公司购买，长度为12-28碱基。
本发明所述纳米复合探针的合成过程优选：
(1)取MOPS缓冲溶液(MOPS 10mM，氯化钠150mM)480μL加入到容积为1.5mL的EP管中；
(2)将poly(AT/TA)的双链DNA与EBMVC-B染料加入上述缓冲液，混合摇匀；
(3)静置2分钟；
(4)加入铜离子和抗坏血酸钠，摇晃混匀后放置2分钟。
本发明所述的一种氰根离子的快速检测过程优选：
(1)在以上述方法合成纳米复合探针之后，加入被检测水样或将纳米复合探针加入待分析的食物样品中；
(2)静置1分钟；
(3)通过荧光分光光度计或共聚焦荧光显微镜进行荧光信号采集，实现定性或定量分析。
与现有技术相比，本发明的优势在于：该方法具有专一性高、灵敏度好、操作简便、条件温和、经济实用等优点；特别是检测速度快，可以克服由于CN-半衰期短、而复杂前处理过程或长检测时间带来的误差；实现了实际水样中CN-的检测和可食性植物组织中CN-的荧光成像分析。因此，该发明方法具有原始创新性、良好的社会价值和应用前景。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图；
图2为实施例1中不同DNA序列用于纳米复合探针的构建及对氰根离子的响应；
图3为实施例2中纳米复合探针用于氰根离子检测的可行性分析；
图4为实施例3中纳米复合探针用于氰根离子检测的动力学分析；
图5为实施例4中纳米复合探针用于氰根离子检测的选择性探究；
图6为实施例5中纳米复合探针对不同浓度氰根离子的检测；
图7为实施例7中纳米复合探针应用于可食性植物组织中氰根离子检测的荧光成像分析。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在易于理解本发明的技术方案特征，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
实施例1不同DNA序列用于纳米复合探针的构建及对氰根离子的响应
配制制备纳米复合探针所需的溶液：将含相同长度的不同DNA序列干粉加水溶解得10μM的储备溶液，配制50μM的EBMVC-B溶液，配制2mM的硫酸铜(CuSO4)溶液，配制100mM的抗坏血酸钠(C6H7NaO6)溶液，配制10mM的MOPS缓冲液(pH＝7.8)，放置4℃冰箱内待用。
(1)取MOPS缓冲液(10mM，pH＝7.8)480μL加入到容积为1.5mL的EP管中；接着加入5μL DNA溶液(10μM)和5μL EBMVC-B染料溶液(50μM)，摇匀并静置2分钟；接着加入5μL的硫酸铜溶液(2mM)和5μL的抗坏血酸钠溶液(100mM)，摇匀，放置2分钟；直接测量并记录各组溶液在激发波长＝450nm，发射波长＝550nm时的荧光强度值，得到不同序列的DNA对纳米复合探针的形成及荧光光谱的影响。
(2)最后加入5μL氰根离子溶液(2mM)，摇匀，直接测量并记录各组溶液在激发波长＝450nm，发射波长＝550nm时的荧光强度值，得到不同DNA序列对纳米复合探针荧光信号产生的影响。信倍比为加入氰根离子后溶液的荧光值除以未加氰根离子时的荧光值，重复三次试验，取平均值。
结果分析：从图2可以看出，在多组不同序列的DNA中，仅基于poly(AT/TA)的双链DNA序列的纳米复合探针对氰根离子的检测信倍比很高，效果很好。基于其他DNA序列的纳米复合探针对氰根离子的检测效果均不理想。由此得出，该纳米复合探针的成功构建与信号转换对poly(AT/TA)的双链DNA序列具有高度依赖性，因此poly(AT/TA)的双链DNA被筛选为用于纳米复合探针构建的最优序列。
实施例2纳米复合探针用于氰根离子检测的可行性分析
通过单一变量法，系统的考察了各反应成分对荧光信号的影响。
(1)取MOPS缓冲液(10mM，pH＝7.5)480μL加入到容积为1.5mL的EP管中；
(2)加入5μL优选得到的双链d(AT)20溶液(10μM)；
(3)加入5μL的EBMVC-B染料溶液(50μM)，摇匀，放置2分钟；
(4)加入5μL的硫酸铜溶液(2mM)；
(5)加入5μL的抗坏血酸钠溶液(100mM)，摇匀，放置2分钟，抗坏血酸钠在此发明的附图中被简写为SA。
(6)最后加入5μL的氰根离子溶液(2mM)，摇匀。
测试并分别记录上述各步骤的荧光光谱。
结果分析：从图3的荧光谱图中可以看出，同时加入d(AT)20和EBMVC-B的时候，具有明显的荧光信号，说明EBMVC-B染料嵌入了poly(AT/TA)的双链DNA中，实现荧光增强；当在该荧光体系中同时引入铜离子和还原剂抗坏血酸钠的时候，荧光快速熄灭，说明EBMVC-B染料荧光被原位形成的铜纳米颗粒熄灭；当继续加入氰根离子的时候，荧光快速恢复，说明同纳米颗粒被氰根离子快速刻蚀，使得EBMVC-B的荧光信号恢复。
实施例3纳米复合探针用于氰根离子检测的动力学分析
设置荧光分光光度计参数，激发波长＝450nm，发射波长＝550nm，进行时间扫描。
(1)取MOPS缓冲液(10mM，pH＝7.8)480μL加入到容积为1.5mL的EP管中，扫描100s-200s；
(2)接着加入5μL d(AT)20溶液(10μM)，摇匀，扫描100s-200s；
(3)再加入5μL EBMVC-B染料溶液(50μM)，摇匀，扫描100s-200s；
(4)接着加入5μL硫酸铜溶液(2mM)，摇匀，扫描100s-200s；
(5)再加入5μL抗坏血酸钠溶液(100mM)，摇匀，扫描100s-200s；
(6)最后加入5μL氰根离子溶液(2mM)，摇匀，扫描100s-200s。
结果分析：从图4的时间扫描结果可以看出，MOPS缓冲液本身无荧光信号；加入d(AT)20溶液后，无荧光信号；继续加入EBMVC-B染料时，立即产生强烈的荧光信号，反应迅速；之后加入的抗坏血酸钠溶液对整个溶液的荧光几乎无影响；当继续加入铜离子溶液时，荧光信号快速下降，100s左右可达到稳定；最后加入氰根离子，荧光信号立刻恢复。由此说明本方法可以实现对氰根离子的快速检测。
实施例4纳米复合探针用于氰根离子检测的选择性探究
取MOPS缓冲液(10mM，pH＝7.8)480μL加入到容积为1.5mL的EP管中；接着加入5μL的d(AT)20溶液(10μM)和5μL的EBMVC-B染料溶液(50μM)，摇匀并静置2分钟；接着加入5μL的硫酸铜溶液(2mM)和5μL的抗坏血酸钠溶液(100mM)，摇匀，放置2分钟；最后加入5μL不同的阴离子溶液(2mM)，使得各种阴离子的浓度为20μM，同时，增加一空白组，只加入5μL MOPS缓冲溶液，摇匀，测量并记录各组溶液在激发波长＝450nm，发射波长＝550nm时的荧光强度值，得到各种阴离子对纳米复合探针荧光信号的影响。信倍比为加入各种阴离子后溶液的荧光值除以空白组的荧光值，重复三次试验，取平均值。
结果分析：从图5可以看出，从a到o分别代表离子CN-,F-,Cl-,Br-,I-,SCN-,H2PO4 -,HPO4 2-,CO3 2-,HCO3 -,SO4 2-,ClO4 -,S2 -,NO3 -,CH3COO-，只有氰根离子的加入才会引起纳米复合探针荧光信号的显著恢复，其它对照离子不存在干扰。说明该纳米复合探针对氰根离子检测具有很好的选择性。
实施例5纳米复合探针对不同浓度氰根离子的检测
取MOPS缓冲液(10mM，pH＝7.8)480μL加入到容积为1.5mL的EP管中；接着加入5μL的d(AT)20溶液(10μM)和5μL的EBMVC-B染料溶液(50μM)，摇匀并静置2分钟；接着加入5μL的硫酸铜溶液(2mM)和5μL的抗坏血酸钠溶液(100mM)，摇匀，放置2分钟；最后加入5μL不同浓度的氰根离子离子溶液，摇匀，测试并分别记录其荧光光谱，得到不同浓度氰根离子的加入对荧光的恢复情况。
结果分析：从图6A的荧光谱图中可以看出，随着氰根离子浓度的增大，550nm处荧光峰的强度逐渐增强,说明荧光强度跟氰根离子浓度呈正相关。从图6A可以得出，该纳米复合探针对氰根离子检测在2.5-20μM浓度范围具有较好的线性关系。
实施例6纳米复合探针应用于实际水样的分析结果
实际水样取自河水，湖水，自来水，用不同浓度的氰根离子进行人为污染，制备成被污染的试剂水样。按照实施例5所涉及步骤制备纳米复合探针，加入不同浓度氰根离子污染的水样，检测荧光信号，重复三次，取平均值，计算回收率。
结果分析：从表1的回收率实验结果可以得出，针对各水样检测的回收率分布在90％-110％，并且具有较小的偏差，说明该方法可用于试剂水样中氰根离子的快速检测分析。
表1为实施例6中纳米复合探针应用于实际水样的分析结果
实施例7纳米复合探针应用于可食性植物组织中氰根离子检测的荧光成像分析
(1)制备纳米复合探针：在170μL MOPS缓冲液(10mM，pH＝7.8)中，加入8μL的d(AT)20溶液(10μM)和10μL的EBMVC-B染料溶液(50μM)，摇匀；接着加入8μL的硫酸铜溶液(2mM)和8μL的抗坏血酸钠溶液(100mM)，摇匀。
(2)选取三种可食性植物组织样品，红薯，马铃薯和木薯，分别切成约0.2mm薄片。
(3)在三种样品上各滴加60μL新制备的纳米复合探针，于共聚焦显微镜下观测，设置激发光源为488nm，成像分析。
结果分析分析：从图7可以看出，木薯组织在加入纳米复合探针后可观察到明显的荧光信号，这与木薯组织在被破坏时产生较高浓度氰根离子的事实相符。而红薯及马铃薯组织在相同实验条件下，无荧光信号。说明本实验可以应用于食物中氰根离子快速检测分析，操作简单。

Claims (10)

1.一种氰根离子的快速检测方法，其特征在于，在双链DNA序列上嵌入EBMVC-B染料、并原位合成铜纳米颗粒，荧光熄灭，构成复合纳米探针；在加入氰根离子之后，铜纳米颗粒被快速刻蚀，EBMVC-B的荧光恢复，在几秒钟内完成，实现氰根离子的快速荧光分析检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在MOPS缓冲溶液中加入双链DNA序列和EBMVC-B染料，摇晃混匀，使EBMVC-B与DNA充分作用，嵌入到DNA上；再向上述溶液中加入铜离子溶液和还原剂抗坏血酸钠，铜离子在DNA上被还原，原位生成铜纳米颗粒，淬灭EBMVC-B染料的荧光；最后加入待检测的含有氰根离子的样品；根据荧光强度对CN-实现定性与定量检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述MOPS缓冲溶液中MOPS浓度为5-50mM，含50-250mM氯化钠，所述MOPS缓冲溶液的pH值为7.5-8.5。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，缓冲液中双链DNA的浓度为50-500nM，EBMVC-B染料的浓度为250-2500nM；所述EBMVC-B染料与双链DNA序列的摩尔比例为5:1。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的检测方法，其特征在于，所述双链DNA序列为poly(AT/TA)的双链DNA序列，长度为12-28碱基。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述poly(AT/TA)的双链DNA的序列:
5′-ATATATATATATATATATATATAT-3′
3′-TATATATATATATATATATATATA-5′。
7.根据权利要求2或3或4所述的检测方法，其特征在于，缓冲液中铜离子的浓度为10-200μM，抗坏血酸钠的浓度为0.5-5mM。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的检测方法，其特征在于，铜离子溶液为二价铜盐溶液，包括硫酸铜溶液，氯化铜溶液,硝酸铜溶液，醋酸铜溶液中的一种或几种。
9.根据权利要求1或2或3或4所述的检测方法，其特征在于，待测样品加入后，以450nm为激发光源，收集500nm-700nm的荧光。
10.根据权利要求1或2或3或4所述的检测方法，其特征在于，所述的方法用于检测2.5-20μM氰根离子浓度范围的样品。
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