CN106053580B - 一种高效毛细管电泳拆分外消旋雷诺嗪的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于拆分和检测技术领域，具体公开了一种高效毛细管电泳拆分外消旋雷诺嗪的方法，该方法以添加了手性选择试剂的磷酸氢二钠‑盐酸作为缓冲液体系，在一定的高效毛细管电泳参数，包括分离电压、分离温度、压力进样和紫外检测波长下，成功的外消旋雷诺嗪进行了拆分，实现了基线分离，这为雷诺嗪药动学和药效学研究奠定了扎实的基础。

Description

一种高效毛细管电泳拆分外消旋雷诺嗪的方法
【技术领域】
本发明涉及拆分和检测技术领域，具体涉及一种外消旋雷诺嗪的拆分方法。
【背景技术】
雷诺嗪(Ranolazine,RNZ)是一种具有全新机制的治疗心绞痛的药物,由美国CVTherapeutics公司和Kissei公司共同开发研制的用于稳定型心绞痛治疗的新型药物,2006年美国食品药品监督管理局批准了雷诺嗪上市。雷诺嗪是哌嗪类化合物,分子中含有一个手性中心,存在一对光学异构体。雷诺嗪以消旋体在国外上市,在我国目前还处于研发阶段。根据国家对手性药物上市的相关法规规定手性药物申报必须对其单体进行药效、毒理等方面的考察。因此，我们需要对外消旋雷诺嗪进行拆分，使外消旋雷诺嗪被拆分，以便于研究人员制备所需单体，从而观察雷诺嗪和其光学异构体的药动学行为，为其药动学和药效学研究奠定基础。
手性拆分的方法很多，而随着色谱科学的发展，现代色谱分析技术在对映体分离方面显示出巨大的优越性，色谱法已逐渐成为目前手性分离的主要手段。其中主要有气相色谱(GC)和高效液相色(HPLC)、薄层色谱、超临界流体色谱法、高效毛细管电泳法(HPCE)等。
HPCE与传统的分离方法相比，显著特点是简单、高效、快速和微量；还具备了经济、清洁、易于自动化、一机多用和环境污染少等优点。在手性化合物的分离方面，相对于其它分离技术而言，HPCE具有可灵活选择操作模式和手性选择剂、试剂及样品用量少且对环境污染小、分析速度快、应用范围广等许多优点。
而目前关于外消旋雷诺嗪的研究还比较少，只发现了一个利用添加手性固定相的高效液相色谱来拆分外消旋雷诺嗪的文献，该文献在以甲醇、异丙醇和正己烷(17:17:66，V:V：V)为流动相，且流速为1.5mL/min,采用反相体系对外消旋雷诺嗪进行拆分时，最佳分离度为3.33。因此，外消旋雷诺嗪的拆分方法单一，没有选择性，不能为后续的研究提供充分的基础。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种高效毛细管电泳拆分外消旋雷诺嗪的方法。该方法具有可灵活选择操作模式和手性选择剂、试剂及样品用量少且对环境污染小、分析速度快、应用范围广等许多优点，且本发明建立了一种拆分外消旋雷诺嗪的新方法，为其后续研究提供更充分的基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高效毛细管电泳拆分外消旋雷诺嗪的方法，包括以下步骤：
(1)以磷酸氢二钠-盐酸作为缓冲液，在该缓冲液中添加手性选择试剂作为缓冲液体系，搅拌至混合均匀后，超声脱气10min并用0.20μm的微孔滤膜过滤；
(2)用去离子水配制外消旋雷诺嗪样品，样品浓度为0.08-0.15mg/mL；
(3)调节毛细管电泳参数为：分离电压为18-23KV，毛细管温度为22-27℃，压力进样为1.5psiX15s，紫外检测波长为200-230nm；正极进外消旋雷诺嗪样品，负极检测；
(4)在(3)设定的毛细管电泳参数下运行毛细管电泳仪，待基线平稳且基线波动在0.15mAu范围内时进样，实现了外消旋雷诺嗪的基线分离。
进一步的，步骤(1)中，所述手性选择试剂为磺丁基醚-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精或硫酸化-β-环糊精中的一种。
进一步的，步骤(1)中，所述手性选择试剂的浓度为15-20mmol/L，添加量为7-12％的体积。
进一步的，步骤(1)中，所述磷酸氢二钠-盐酸的浓度为30-50mmol/L，pH为3.4-4.0。
进一步的，步骤(2)中，所述样品的浓度为0.12mg/mL。
进一步的，步骤(3)中，所述分离电压为20KV。
进一步的，步骤(3)中，所述毛细管温度为26℃。
进一步的，步骤(3)中，所述紫外检测波长为220nm。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用的拆分方法是高效毛细管电泳法，与其他拆分方法相比，具有可灵活选择操作模式和手性选择剂、试剂及样品用量少且对环境污染小、分析速度快、应用范围广等许多优点，用该方法对外消旋雷诺嗪进行拆分的分离效果好且灵敏度高。
(2)目前，关于外消旋雷诺嗪的研究还比较少，只有利用高效液相色谱来拆分外消旋雷诺嗪的研究文献，因此，外消旋雷诺嗪拆分方法单一，没有选择性，不能为后续的研究提供充分的基础，而本发明利用高效毛细管电泳来拆分外消旋雷诺嗪，建立了一种拆分外消旋雷诺嗪的新方法，增加了外消旋雷诺嗪拆分方法的选择，为其后续研究提供更充分的基础。
【具体实施方式】
以下给出具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
1.电泳参数的设定
分离电压为18KV；分离温度为22℃；紫外检测波长为200nm；压力进样为0.5psiX15s。
2.缓冲液体系的制备
缓冲液体系为加入7％(V)15mmol/L磺丁基醚-β-环糊精的磷酸氢二钠-盐酸，浓度为30mmol/L，pH为3.4，并用0.20μm的水性滤膜过滤，待用。
3.进样拆分
按设定的电泳参数运行高效毛细管电泳仪，先用0.20μm水性滤膜过滤过的蒸馏水走30min，再用缓冲液体系走30min，再加电场30min，如此循环，直到基线平稳且基线波动在0.15mV以内时，正极进0.08mg/mL外消旋雷诺嗪样品，负极检测。
实施例2
1.电泳参数的设定
分离电压为19KV；分离温度为24℃；紫外检测波长为210nm；压力进样为0.5psiX15s。
2.缓冲液体系的制备
缓冲液体系为加入9％(V)17mmol/L磺丁基醚-β-环糊精的磷酸氢二钠-盐酸，浓度为35mmol/L，pH为3.6，并用0.20μm的水性滤膜过滤，待用。
3.进样拆分
按设定的电泳参数运行高效毛细管电泳仪，先用0.20μm水性滤膜过滤过的蒸馏水走30min，再用缓冲液体系走30min，再加电场30min，如此循环，直到基线平稳且基线波动在0.15mV以内时，正极进0.10mg/mL外消旋雷诺嗪样品，负极检测。
实施例3
1.电泳参数的设定
分离电压为21KV；分离温度为26℃；紫外检测波长为220nm；压力进样为0.5psiX15s。
2.缓冲液体系的制备
缓冲液体系为加入11％(V)18mmol/L羧甲基-β-环糊精的磷酸氢二钠-盐酸，浓度为43mmol/L，pH为3.8，并用0.20μm的水性滤膜过滤，待用。
3.进样拆分
按设定的电泳参数运行高效毛细管电泳仪，先用0.20μm水性滤膜过滤过的蒸馏水走30min，再用缓冲液体系走30min，再加电场30min，如此循环，直到基线平稳且基线波动在0.15mV以内时，正极进0.12mg/mL外消旋雷诺嗪样品，负极检测。
实施例4
1.电泳参数的设定
分离电压为23KV；分离温度为27℃；紫外检测波长为230nm；压力进样为0.5psiX15s。
2.缓冲液体系的制备
缓冲液体系为加入12％(V)20mmol/L硫酸化-β-环糊精的磷酸氢二钠-盐酸，浓度为50mmol/L，pH为4.0，并用0.20μm的水性滤膜过滤，待用。
3.进样拆分
按设定的电泳参数运行高效毛细管电泳仪，先用0.20μm水性滤膜过滤过的蒸馏水走30min，再用缓冲液体系走30min，再加电场30min，如此循环，直到基线平稳且基线波动在0.15mV以内时，正极进0.15mg/mL外消旋雷诺嗪样品，负极检测。
采集上述4个实施例的电泳图，经过计算得到分离度，作为实验组；将文献中采用CDMPC手性柱的高效液相色谱拆分外消旋雷诺嗪的最佳分离度作为对照组，两者相比较，结果见表1：
表1
实施例 1 2 3 4 对照组
分离度 3.31 3.42 4.01 3.37 3.33
由上表可知，在上述4个实施例中，均可以实现对外消旋雷诺嗪拆分的基线分离，且最佳分离度达到4.01。在4组实施例中，不仅最佳分离度优于对照组20.4％，且实施例2和实施例3的分离度均优于对照组的最佳分离度，实施例1的分离度也与对照组近似。因此，本发明不仅为外消旋雷诺嗪建立了一种新的拆分方法，且该拆分方法的灵敏度高、分离效果好。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.一种高效毛细管电泳拆分外消旋雷诺嗪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以磷酸氢二钠-盐酸作为缓冲液，在该缓冲液中添加手性选择试剂作为缓冲液体系，搅拌至混合均匀后，超声脱气10min并用0.20μm的微孔滤膜过滤；所述手性选择试剂为磺丁基醚-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精或硫酸化-β-环糊精中的一种；
(2)用去离子水配制外消旋雷诺嗪样品，样品浓度为0.08-0.15mg/mL；
(3)调节毛细管电泳参数为：分离电压为18-23KV，毛细管温度为22-27℃，压力进样为1.5psiX15s，紫外检测波长为200-230nm；正极进外消旋雷诺嗪样品，负极检测；
(4)在(3)设定的毛细管电泳参数下运行毛细管电泳仪，待基线平稳且基线波动在0.15mAu范围内时进样，实现了外消旋雷诺嗪的基线分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述手性选择试剂的浓度为15-20mmol/L，添加量为7-12％的体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磷酸氢二钠-盐酸的浓度为30-50mmol/L，pH为3.4-4.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样品的浓度为0.12mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述分离电压为20KV。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述毛细管温度为26℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述紫外检测波长为220nm。
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